CN110408582A

CN110408582A - 展示猪瘟病毒e2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影构建及制备

Info

Publication number: CN110408582A
Application number: CN201910696035.6A
Authority: CN
Inventors: 杨梦华; 姬生乐; 韩美晴; 杜丽宏; 彭名正; 徐思艳
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110408582B

Abstract

本发明涉及一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影的制备方法，制备方法包括如下步骤：构建tcpP‑E2融合蛋白表达载体pJSL13；制备霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞；将pJSL13及温控诱导裂解质粒pBV220‑E共同转入霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞，得到E2‑rVC；诱导E2‑rVC表达融合蛋白tcpP‑E2并制备菌影E2‑rVCG。

Description

展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影构建及制备

技术领域

本发明涉及一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影构建及制备，属于基因工程疫苗领域。

背景技术

猪瘟是一种由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、接触性传染病。由于该病具有高度的传染性及致病性，流行广泛，给各国的养猪业带来了严重的经济损失。猪瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属的重要成员之一，它是单股正链RNA病毒，长约为12.3 kb，编码一个多聚蛋白，该蛋白在后期会被剪切加工成4个成熟的结构蛋白和8个成熟的非结构蛋白，其中猪瘟病毒囊膜E2蛋白能够诱导机体产生特异性抗体，因此经常作为研究猪瘟亚单位疫苗、标记疫苗和检测方法的主要的目标蛋白。研究表明E2蛋白的C端的ABCD四个区是诱导抗体产生的主要抗原结构域。

细菌菌影通常是利用噬菌体裂解E蛋白使革兰氏阴性细胞膜上形成一个跨膜孔道，细菌胞浆内容物在内外渗透压的作用下通过形成的孔道流出胞外。形成一个完整的细菌空壳。这种裂解方式已经广泛应用于各种革兰氏阴性细菌，主要包括霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌、副猪嗜血杆菌等。菌影的制备生产工艺简单，成本低，还可冻干保存，在储存及运输方面十分便利。菌影最大的优势是保留了完整细胞结构，不仅可以作为天然佐剂刺激机体免疫系统应答，还可以作为递送系统装载大分子蛋白或核酸，以及小分子药物等等。EKO等以霍乱弧菌菌影（Vibrio cholerae Ghosts）为递送系统，将衣原体的MOMP蛋白锚定到细胞膜上制备了rVCG，通过实验证明其刺激宿主产生了强力ThI型免疫反应，同时产生了很好的体液免疫应答。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影构建及制备，以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影，具体包括以下步骤：

（1）构建猪瘟病毒E2蛋白ABCD四区与tcpP蛋白融合表达载体pJSL13。

以霍乱弧菌基因组为模板扩增tcpP基因片段，以人工合成的E2蛋白ABCD四区基因扩增E2蛋白ABCD四区基因片段，两片段通过切胶回收的方式进行纯化，将纯化好的两片段通过Overlapping PCR拼接为一条片段tcpP-E2。具体步骤如下：根据猪瘟病毒E2蛋白ABCD四个区与tcpP基因序列设计上下游引物，tcpP基因片段的下游引物与E2蛋白ABCD四区片段上游引物设计时加入Linker序列，并在tcpP基因片段上游引物引入Flag标签蛋白序列及EcoRI酶切位点，E2蛋白ABCD四区片段下游引物引入PstI酶切位点。

融合表达基因片段tcpP-E2与载体pacyc-aphB用EcoRI，PstI内切酶进行37℃酶切过夜。酶切过后的基因片段与载体片段进行16℃酶连6 h，酶连产物纯化后电转化至大肠杆菌DH5αλpir中。筛选阳性细菌送金维智公司测序，将序列正确的重组载体命名为pJSL8。

所述基因克隆使用引物均为金维智公司合成的DNA引物序列，下划线标注酶切位点。引物碱基序列如SEQ ID NO:1~4所示：

tcpP基因片段上游引物Flag-tcpP-P1-EcoRI：

5'-CGGAATTCATGGATTATAAGGATGATGATGATAAGGGGTATGTCCGCGTGATTTATCAATT-3'

tcpP基因片段下游引物tcpP-Linker-P2：

5' -CCCCCACTGCCAGACCCCGATGAACCACTGCTAGATCCATTTTTTGTGCATTC-3'

E2蛋白ABCD四区基因片段上游引物E2-Linker-P3：

5' -TCTGGCAGTGGGGGAGGTGGCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTAC-3'

E2蛋白ABCD四区基因片段下游引物E2-P4-PstI：

5'-CCATTGCATTGGTTCTGCAGTTAGAATAGATCTTCATTTTCCACTGTGGTGGTCACAC-3'

已有研究表明tcpH蛋白可提高tcpP蛋白在膜上稳定性，故为使tcpP-E2融合蛋白稳定在霍乱弧菌内膜上，在pJSL8的基础上，插入一段由Pbad启动，包含tcpP基因起始一段序列及全长的tcpH基因组成的序列tcpH基因片段，即Pbad-tcpH。此片段以实验室已保有质粒pBAD24-tcpH为模板扩增，并在片段的两端引物序列中引入PstI酶切位点。

所述基因克隆使用引物均为金维智公司合成的DNA引物，下划线标注酶切位点。

引物碱基序列如SEQ ID NO:5~6所示：

上游引物Pbad-tcpH-F-PstI：

5' -AAAACTGCAGATCCTACCTGACGCTTTTTATC-3'

下游引物Pbad-tcpH-R-PstI：

5' -CCAATGCATTGGTTCTGCAGGGCTTCTGTGGAGGAGCGCCTAC-3'

Pbad-tcpH片段与pJSL8质粒分别进行PstI单酶切，37℃酶切过夜。次日将酶切片段与酶切载体酶连，16℃酶连6 h。酶连产物纯化后电转化至大肠杆菌DH5αλpir中。筛选阳性细菌送金维智公司测序，将序列正确的重组载体命名为pJSL13。

（2）制备霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞

按常规方法制备霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞，将细菌提前两天平板划线，第二天挑取单菌落摇菌，第三天1：100转接扩大培养至OD₆₀₀=0.7后收菌。细菌先冰浴10 min，后用2 mM CaCl₂洗三次，再用2 mM CaCl₂及10%甘油混合液洗一次后重悬100 μL/管分装；

（3）将pJSL13与pBV220-E电转入霍乱弧菌ΔtcpP缺失株中

pBV220-E质粒为实验室已有的温控诱导裂解基因E表达的质粒，取pJSL13质粒及pBV220-E各200 ng同时电击转化至霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞中，30℃摇菌110min涂于SKA（Sm100，Km50，Amp100三种抗生素）的普通LB平板。次日菌落PCR验证后挑取阳性菌落并保菌，命名为E2-rVC。

（4）优化重组菌影表达融合蛋白后的裂解条件

对融合蛋白表达条件及裂解条件的摸索，制备E2-rVCG，确定30℃，200 rpm摇菌至OD₆₀₀=0.3时，加入0.1% Ara诱导融合蛋白表达。至OD₆₀₀=0.7时，42℃，60 rpm诱导裂解E蛋白表达，裂解6 h收菌，以达到最佳表达条件。实验中进行裂解前与裂解后的涂板计数，证明裂解率达99.99%以上。

（5）重组菌影大批量制备及冻干保存

将E2-rVC在SKA平板上活化，第二天挑去阳性菌落摇菌20 mL，第三天1：100转接至两个1 L液体LB中，按优化的条件制备E2-rVCG，收获菌影1.12 g。

本发明旨在将猪瘟病毒E2蛋白ABCD四个区与霍乱弧菌内膜蛋白tcpP融合表达，锚定于霍乱弧菌内膜上，制备猪瘟病毒重组疫苗E2-rVCG，来作为预防猪瘟的候选疫苗。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

本发明降低菌影裂解时摇床转速至60 rpm，降低细菌生长速度，相对提高了裂解速度。制备条件的改进，大大提高了菌影的裂解率，相较常规制备方式将裂解率从99%提高至99.99%，进一步提高了菌影的制备率。

本发明涉及的菌影E2-rVCG，制备方式简单，成本低，最终以冻干粉形式保存，储存便利。

本发明将猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白的主要抗原区ABCD四个区锚定于霍乱弧菌菌影上，作为一种新型猪瘟疫苗使用。这种疫苗已通过动物实验证明安全性良好，不会像减毒活性株疫苗那样有毒力回复的风险；本发明还利用菌影的佐剂效用，增强疫苗的免疫原性。

附图说明

图1 为geneE片段电泳结果；

图2 为tcpP-E2片段电泳结果；

图3 为tcpH片段电泳结果；

图4 为pJSL8结构示意图；

图5 为pJSL13结构示意图；

图6 为E2-rVCG诱导条件及裂解曲线示意图；

图7 为tcpP-E2融合蛋白表达western blot检测；

图8 为E2-rVC（霍乱弧菌）透射电镜检测结果图；

图9 为E2-rVCG（霍乱弧菌菌影）透射电镜检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。

一种展示猪瘟病毒E2蛋白ABCD四区的重组霍乱弧菌菌影疫苗的构建及制备方法，步骤如下：

（1）tcpP-E2融合基因片段获得

tcpP基因以霍乱弧菌C6706基因组为模板扩增，E2蛋白ABCD四区基因通过人工合成方式获得，tcpP基因片段在上游引物添加Flag蛋白基因及EcoRI酶切位点，下游引物引入linker序列，扩增tcpP片段。以人工合成的E2蛋白ABCD四区为模板，上游引物添加linker序列，下游引物引入PstI酶切位点，扩增E2片段。将两片段通过Overlapping PCR连成一条片段tcpP-E2，条带通过1%凝胶电泳验证，目的条带1269 bp，大小正确，结果如图2所示。

根据GenBank中的基因序列，人工合成E2蛋白ABCD四区基因，序列为：

CGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATAGGGCTACTCGGGGCCGGAGGTCTCACTACCACCTGGAAAGAATACAGCCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAATCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGGGGCTTTACTCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACCGAAGAAATGGGAGATGACTTCGGGTTCGGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGTCCTGTTGTCAAGGGAAAGTACAATACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTTATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGAGAAGCCTTTCCCACACAGAATGGATTGTGTGACCACCACAGTGGAAAATGAAGATCTATTCTAA

（2）构建猪瘟病毒E2蛋白ABCD四区与tcpP蛋白融合表达载体pJSL8

将tcpP-E2片段与载体pacyc-aphB质粒分别进行EcoRI和PstI酶切，酶切过后的片段进行酶连及转化，得到表达载体pJSL8，载体图谱如图4所示。对阳性细菌测序，结果表明所得阳性质粒与预期一致，测序结果如下：

表达载体pJSL8中tcpP-E2 DNA序列如SEQ ID NO:7所示：

AAGGATGATGATGATAAGGGGTATGTCCGCGTGATTTATCAATTTCCCGATAACCTTTGGTGGAATGAATGCACTAATCAAGTCTATTATGCACAAGATCCAATGAAGCCAGAAAGGCTGATTGGTACACCAAGCATAATACAGACTAAGTTATTGAAAATACTCTGTGAATATCATCCTGCCCCCTGTCCAAATGATCAAATAATTAAAGCACTTTGGCCTCATGGATTTATCAGCTCTGAAAGTCTAACTCAGGCAATCAAAAGAACCAGAGATTTTTTGAATGATGAACATAAGACGTTGATCGAAAATGTAAAGTTACAAGGTTATCGTATTAATATTATACAAGTTATTGTTTCTGAAAACGTTGTTGATGAAGCTGACTGTAGTCAAAAAAAATCAGTAAAAGAGCGGATAAAAATTGAGTGGGGGAAGATAAACGTAGTTCCTTATCTTGTTTTTTCGGCGCTTTATGTTGCTTTGCTACCTGTGATTTGGTGGAGTTATGGCCAATGGTATCAACATGAATTAGCCGGCATTACTCATGATCTACGAGATTTAGCAAGGTTACCGGGGATAACAATCCAAAAACTGTCAGAACAAAAACTCACGTTCGCTATTGATCAACATCAGTGTTCCGTGAATTATGAACAGAAGACATTAGAATGCACAAAAAATGGATCTAGCAGTGGTTCATCGGGGTCTGGCAGTGGGGGAGGTGGCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATAGGGCTACTCGGGGCCGGAGGTCTCACTACCACCTGGAAAGAATACAGCCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAATCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGGGGCTTTACTCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACCGAAGAAATGGGAGATGACTTCGGGTTCGGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGTCCTGTTGTCAAGGGAAAGTACAATACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTTATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGAGAAGCCTTTCCCACACAGAATGGATTGTGTGACCACCACAGTGGAAAATGAAGATCTATTCTAA

（3）插入Pbad-tcpH基因提高tcpP-E2在膜上的稳定性

为使tcpP-E2在内膜上更加稳定，插入一段由Pbad启动，包含tcpP基因起始一段序列及全长的tcpH基因组成的序列tcpH基因，即Pbad-tcpH。此序列通过本实验室已保有的质粒pBAD24-tcpH进行扩增，条带通过1%凝胶电泳验证，目的条带642 bp，大小正确，结果如图3所示。

（4）构建猪瘟病毒E2蛋白ABCD四区与tcpP蛋白融合表达能力加强载体pJSL13

为增强tcpP-E2蛋白在膜上的稳定性，在pJSL8的基础上插入一段由额外Pbad控制启动转录的tcpH基因序列，此质粒命名为pJSL13，图谱如图5所示。

（5）加强载体pJSL13、温控诱导性裂解质粒pBV220-E导入霍乱弧菌ΔtcpP缺失株

按常规方法制备霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞，将细菌提前两天平板划线，第二天挑取单菌落摇菌，第三天1：100转接扩大培养至OD₆₀₀=0.7后收菌。细菌先冰浴10 min，后用2 mM CaCl₂洗三次，再用2 mM CaCl₂及10%甘油混合液洗一次后重悬100 μL/管分装；将pJSL13与pBV220-E导入霍乱弧菌ΔtcpP缺失株，通过菌落PCR扩增裂解E基因，1%凝胶电泳验证，目的条带276 bp，大小正确，结果如图1所示。

（6）重组菌影E2-rVCG的获得

在3 mL SKA培养基（含Sm100，Amp100，Km50的LB培养基）中接种E2-rVC。次日1：100转接至200 mL含有相同抗生素的LB培养基中，30℃，200 rpm培养，待OD₆₀₀=0.3时，加入0.1% Ara诱导融合蛋白表达，待OD₆₀₀=0.7时，转入42℃，60 rpm培养以裂解细菌，每隔1 h抽样检测细菌培养物的OD₆₀₀，结果显示培养物在转入裂解环节后1 h，OD₆₀₀有略微的上升，此后由于细菌的裂解，OD₆₀₀开始下降，直到裂解5 h后，OD₆₀₀基本稳定。说明菌影制备完毕，融合蛋白诱导及细菌裂解过程如图6所示。

（7）tcpP-E2融合蛋白在E2-rVCG上的表达鉴定

将霍乱弧菌野生型细菌，E2-rVC细菌摇3 mL，次日1：100转接将一管霍乱弧菌野生型细菌及两管E2-rVC细菌至五毫升LB培养基中，一管E2-rVC细菌样品只诱导融合蛋白表达不裂解，另一管E2-rVC细菌样品按之前优化条件进行处理得菌影，霍乱弧菌野生型细菌样品仅保持相同的培养条件，将得到的三份样品菌超声破碎处理得Western blot上样样品。

蛋白胶电泳：取出制备好的PAGE胶，按M：Maker 1：CK（霍乱弧菌野生型） 2：E2-rVCG（融合蛋白表达霍乱弧菌菌影）3：E2-rVC（融合蛋白表达霍乱弧菌）顺序上样跑胶。

转膜：转膜步骤如下：①将凝胶切割至合适大小，并准备同样大小PVDF膜。②PVDF膜在甲醇中浸泡1 min后，与滤纸放入Transfer Buffer浸泡。③在转膜用夹板的黑色端，铺上一层海绵，再按照五层滤纸-凝胶-PVDF-五层滤纸的顺序排放，并用塑料板轻刮最上层滤纸，赶出气泡，再铺上一层海绵后夹紧夹板。④将夹板放进电泳槽，湿转恒压100 V，50 min完成转膜。

封闭：转膜结束后，取出PVDF膜5%脱脂牛奶封闭1 h，结束后，TBST洗膜三次，每次10 min。

一抗：取出PVDF膜，加入Flag抗体37℃缓慢振摇1 h（抗体1：2000稀释于PBST），结束后，TBST洗膜三次，每次10 min。

二抗：取出PVDF膜，加入羊抗鼠酶标抗体，37℃缓慢振摇1 h（抗体1：5000稀释于PBST），结束后，TBST洗膜三次，每次10 min。

曝光显色：将PVDF膜放置于曝光仪，混合AB曝光液400 μL并将PVDF膜全部覆盖后曝光，空白对照无条带，菌影E2-rVCG相较于未裂解菌E2-rVC，其融合蛋白tcpP-E2含量稍低，证明融合蛋白tcpP-E2牢固的结合在霍乱弧菌膜上，结果如图7所示。

（8）E2-rVC及E2-rVCG的透射电镜分析

取适量E2-rVC及E2-rVCG离心得沉淀，作为裂解前及裂解后透射电镜样品。配制固定液相关试剂，A液为0.2 M的磷酸氢二钠，B液为0.2 M磷酸二氢钠。AB液混合比例为61：39。本次配制固定液包含戊二醛0.25 mL，AB液1.25 mL及1 mL dd₂O。每个样品用1 mL固定液重悬，4℃固定过夜。次日进行后续透射电镜分析实验。E2-rVC（霍乱弧菌）的内容物均在细菌内，而E2-rVCG（霍乱弧菌菌影）大部分内容物已流出到细菌外，证明裂解E蛋白表达后细菌发生了裂解现象，结果如图8、9所示。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影构建及制备

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 1

cggaattcat ggattataag gatgatgatg ataaggggta tgtccgcgtg atttatcaat 60

t 61

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 2

cccccactgc cagaccccga tgaaccactg ctagatccat tttttgtgca ttc 53

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 3

tctggcagtg ggggaggtgg ccggctagcc tgcaaggaag attacaggta c 51

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 4

ccattgcatt ggttctgcag ttagaataga tcttcatttt ccactgtggt ggtcacac 58

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 5

aaaactgcag atcctacctg acgcttttta tc 32

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 6

ccaatgcatt ggttctgcag ggcttctgtg gaggagcgcc tac 43

<210> 7

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 7

aaggatgatg atgataaggg gtatgtccgc gtgatttatc aatttcccga taacctttgg 60

tggaatgaat gcactaatca agtctattat gcacaagatc caatgaagcc agaaaggctg 120

attggtacac caagcataat acagactaag ttattgaaaa tactctgtga atatcatcct 180

gccccctgtc caaatgatca aataattaaa gcactttggc ctcatggatt tatcagctct 240

gaaagtctaa ctcaggcaat caaaagaacc agagattttt tgaatgatga acataagacg 300

ttgatcgaaa atgtaaagtt acaaggttat cgtattaata ttatacaagt tattgtttct 360

gaaaacgttg ttgatgaagc tgactgtagt caaaaaaaat cagtaaaaga gcggataaaa 420

attgagtggg ggaagataaa cgtagttcct tatcttgttt tttcggcgct ttatgttgct 480

ttgctacctg tgatttggtg gagttatggc caatggtatc aacatgaatt agccggcatt 540

actcatgatc tacgagattt agcaaggtta ccggggataa caatccaaaa actgtcagaa 600

caaaaactca cgttcgctat tgatcaacat cagtgttccg tgaattatga acagaagaca 660

ttagaatgca caaaaaatgg atctagcagt ggttcatcgg ggtctggcag tgggggaggt 720

ggccggctag cctgcaagga agattacagg tacgcaatat catcaaccaa tgagataggg 780

ctactcgggg ccggaggtct cactaccacc tggaaagaat acagccacga tttgcaactg 840

aatgacggga ccgttaaggc catttgcgtg gcaggttcct ttaaaatcac agcacttaat 900

gtggtcagta ggaggtattt ggcatcattg cataaggggg ctttactcac ttccgtgaca 960

ttcgagctcc tgttcgacgg gaccaaccca tcaaccgaag aaatgggaga tgacttcggg 1020

ttcgggctgt gcccgtttga tacgagtcct gttgtcaagg gaaagtacaa tacaaccttg 1080

ttgaacggta gtgctttcta tcttgtctgc ccaatagggt ggacgggtgt tatagagtgc 1140

acagcagtga gcccaacaac tctgagaaca gaagtggtaa agaccttcag gagagagaag 1200

cctttcccac acagaatgga ttgtgtgacc accacagtgg aaaatgaaga tctattctaa 1260

Claims

1.一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影，其特征在于，制备方法包括如下步骤：

（1）构建tcpP-E2蛋白融合蛋白表达载体pJSL13；

（2）制备霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞；

（3）将pJSL13及温控诱导裂解质粒pBV220-E共同转入霍乱弧菌ΔtcpP缺失株感受态细胞，得到E2-rVC；

（4）诱导E2-rVC表达融合蛋白tcpP-E2并制备菌影E2-rVCG。

2.根据权利要求1所述的一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影，其特征在于：所述步骤（3）中反应温度为30℃。

3.根据权利要求1所述的一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影，其特征在于：所述步骤（4）中诱导的反应条件：OD₆₀₀ =0.3时，30℃，200 rpm下加入0.1% Ara诱导tcpP-E2重组蛋白表达；OD₆₀₀=0.7时，42℃，60 rpm下诱导裂解E蛋白表达。

4.根据权利要求1所述的一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影，其特征在于，所述步骤（1）具体为：

1）以霍乱弧菌基因组为模板扩增tcpP基因上游片段，以人工合成的E2蛋白ABCD四区基因为模板扩增下游片段，上下游片段进行纯化，将纯化好的上下游片段通过OverlappingPCR拼接为一条片段tcpP-E2；

2）将融合表达基因tcpP-E2片段与载体pacyc-aphB用EcoRI，PstI内切酶进行酶切；

3）酶切过后的基因片段与载体片段进行酶连，酶连产物纯化后电转化至大肠杆菌DH5αλpir中，得到pJSL8；

4）以pBAD24-tcpH质粒为模板，扩增Pbad-tcpH基因片段，将Pbad-tcpH片段与pJSL8质粒分别进行PstI单酶切，将酶切片段与酶切载体酶连，酶连产物纯化后电转化至大肠杆菌DH5αλpir中，得到pJSL13。

5.根据权利要求1或4所述的一种展示猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影，其特征在于：所述霍乱弧菌为O1血清型霍乱弧菌C6706。