CN106520809A - 一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法，涉及GyV3新型环形病毒的诊断用融合蛋白的制备技术领域。本发明设计了扩增出pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV3病毒VP3基因片段的两对引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II，不经酶切连接反应，直接在体外快速重组取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。本发明简化了克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。

Description

一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及GyV3新型环形病毒的诊断用融合蛋白的制备技术领域。

背景技术

鸡的传染性贫血病毒（CAV）一直被认为是环形病毒属中唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个新型人源环形病毒HGyV序列。序列分析惊人发现，新型人源环形病毒HGyV与AGV2的基因组序列同源性高达96%。自2012年以来，环形病毒属中第三个成员GyV3的DNA序列也在人的粪便、皮肤拭子以及其他动物粪便中相继被发现。

目前尚无检测GyV3抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV3病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV3蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV3在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究GyV3 VP3生物学功能具有重要意义。

在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法，并实现VP3蛋白的表达，可以用于对GyV3在鸡群以及人群中的感染提供明确、有效的诊断。

本发明技术方案包括以下步骤：

1）以pGEX-6p-1质粒为模板，采用下述引物PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；

上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’；

下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’；

2）以人工合成的GyV3-VP3 基因为模板，采用下述引物PCR扩增出VP3基因片段；

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGAACCGGGACTTGG3’；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCCTTT3’；

3）在重组酶ExnaseTM II的作用下，将所述pGEX-6p-1线性化表达载体和VP3基因片段进行重组克隆，取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。

本发明上述扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在引物的5‘端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在引物的5‘端带有额外CAT碱基。

本发明上述扩增GyV3病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在引物的5‘端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增GyV3病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在引物的5‘端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补碱基。

本发明设计了扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及GyV3病毒VP3基因片段的两对引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II，不经酶切连接反应，直接在体外快速重组取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。本发明简化了克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。

本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略，可快速构建GyV3病毒VP3基因的原核表达载体。本发明获得的GyV3病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV3诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV3流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。

附图表说明

图1为本发明GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的构建示意图。

图2为扩增出的pGEX-6p-1线性化载体、扩增出的GyV3病毒VP3基因片段和DNAMarker在1%的琼脂糖凝胶中的电泳图。

图3为SDS-PAGE分析GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的表达的电泳图。

图4为Western blot 鉴定抗AGV3 VP3蛋白多克隆抗体的电泳图。

具体实施方式

结合附图以下实施方式给出了GyV3新型环形病毒VP3蛋白制备的示例。

1、设计扩增含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV3病毒VP3基因片段引物：

扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5’端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5’端带有额外CAT碱基。

PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物：

上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’；

下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’。

扩增GyV3病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增GyV3病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补碱基。

PCR扩增GyV3病毒VP3基因引物：

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGAACCGGGACTTGG3’；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCCTTT3’。

以上两对引物均由Life Technologies上海赛默飞世尔科技公司合成并鉴定。

2、pGEX-6p-1线性化载体、GyV3病毒VP3基因片段的PCR扩增：

如图1中的步骤1所示分别以pGEX-6p-1质粒以及合成的GyV3 VP3基因为模版，采用上述合成的对应引物进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10 mM dNTP，1μl 10 μmol 上游引物，1μl 10 μmol 下游引物, 1μl 10ng/μl的pGEX-6p-1质粒或pcGyV3-VP3质粒，1μl商品化的Phanta Super-Fidelity DNA 聚合酶。PCR扩增反应循环参数为：94℃变性5分钟，随后进行30个循环（94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸3分钟），最后72℃延伸10分钟。

PCR结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道M表示对照品DNA Marker的电泳分析图，其中泳道1、2分别代表线性化载体pGEX-6p-1以及GyV3病毒VP3片段PCR扩增产物的电泳分析图。

从图2可见，采用以上方法分别PCR扩增出了pGEX-6p-1线性化载体和GyV3病毒VP3基因片段。

3、GyV3病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-1载体：

如图1中的步骤2所示，将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-1以及GyV3病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。

具体操作如下：将纯化的GyV3病毒VP3片段产物50～100ng、纯化的pGEX-6p-1表达线性化载体50ng、2μL商品化的ExnaseTM II 酶和4μL 5倍的缓冲液水混合，再补加水至20μL。将以上反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μL反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。经16小时后挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定即为阳性克隆体，命名为pGEX-VP3。

4、GyV3病毒VP3蛋白诱导表达及其纯化：

将阳性克隆体pGEX-VP3转化BL21细菌，经IPTG诱导（0.1mmol/mL）后收集细菌，进行超声（40赫兹）破碎。

将超声破碎样品离心后分别取得上清和沉淀。分别取30μL裂解上清和沉淀，加入5μL 6×SDS凝胶上样缓冲液混匀，煮沸5min；用于SDS-PAGE（5%的浓缩胶，10%的分离胶）电泳分析重组蛋白的表达及其表达形式。同时设立转化空载体的细菌裂解上清和沉淀对照。图3显示了SDS-PAGE分析VP3蛋白的表达结果，其中：泳道 1为转化有pGEX-VP3重组克隆的细菌裂解沉淀，泳道2为转化有pGEX-VP3重组克隆的细菌裂解上清。与转化有空载体的细菌裂解上清（泳道5）和沉淀（泳道4）比较，泳道2中在40kD处可见一特异性差异表达蛋白条带。这表明，GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。 在确定VP3的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的纯化。图3 泳道3为纯化后的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。

5、GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的免疫反应性：

为进一步测定纯化后蛋白的抗原性，评价其能否作为免疫原及诊断用抗原， 将纯化的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白腹腔免疫6周龄BALB/C小鼠，免疫三次，每次间隔14天，剂量均为50μg /只/次。首免时与等体积的完全弗氏佐剂混合至油包水状，再次免疫时与等体积的不完全弗氏佐剂混合，之后免疫不加佐剂。三免后采集小鼠血清，用在293T细胞中表达的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白作为抗原进行Western blot分析血清中抗VP3特异性抗体。如图4所示：其中泳道1为转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物；泳道2为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。由图4可见：这一结果表明本发明表达的GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白具有很好的反应性及免疫原性，在GyV3血清学诊断中将具有良好的应用前景。

<110>扬州大学

<120>一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法

<160>4

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pGEX-6p-1基因序列设计

<400>1

taatgacggt gaaaacctct gacacatgc

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<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>根据pGEX-6p-1基因序列设计

<400>2

catgggcccc tggaacagaa cttccagat

<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>根据GyV3病毒VP3基因片段设计

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据GyV3病毒VP3基因片段设计

<400>4

gttttcaccg tcattacagt cttagccttt

Claims (1)

1.一种GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以pGEX-6p-1质粒为模板，采用下述引物PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；

上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’；

下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’；

2）以人工合成的GyV3-VP3 基因为模板，采用下述引物PCR扩增出VP3基因片段；

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGAACCGGGACTTGG3’；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCCTTT3’；

3）在重组酶ExnaseTM II的作用下，将所述pGEX-6p-1线性化表达载体和VP3基因片段进行重组克隆，取得阳性克隆体，并转化BL21细菌，经IPTG诱导下即获得GyV3新型环形病毒VP3融合蛋白。