CN105037504B - 一种agv2型环形病毒vp2可溶性蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白及其制备方法。是利用pGEX‑6p‑1线性化载体以及AGV2病毒VP2基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP2，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP2蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP2可溶性蛋白。本发明获得的AGV2病毒VP2可溶性表达及纯化的蛋白，可直接提供VP2可容性蛋白作为AGV2诊断抗原；作为免疫原获得抗VP2多克隆抗体；为开展AGV2血清学流行病学调查及VP2功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白；并为进一步探究VP2生物学功能具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种可溶性蛋白，具体涉及一种AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白及其制备方法。
背景技术
鸡的传染性贫血病毒(CAV)一直被认为是环形病毒属中唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个新型人源环形病毒HGyV序列。序列分析惊人发现，HGyV与AGV2的基因组序列同源性高达96％。最近，Maggi以及Biagini等人在健康人，器官移植病人以及HIV阳性病人血清样品中也检测到HGyV/AGV2的DNA序列。在国内，叶建强等检测并首次报道了活禽市场鸡群及人血样中AGV2的存在。这些表明AGV2具有潜在的公共卫生意义。然而目前所有的国内外对AGV2的检测均依赖于对AGV2的病毒基因组DNA的PCR扩增，目前尚无检测AGV2蛋白抗原及其抗体的血清学方法。对该病毒的组织嗜性、病毒蛋白表达及感染宿主中AGV2抗体水平等尚无报道。
因此，对AGV2病毒早期表达蛋白VP2基因在体外进行克隆，构建VP2表达载体，实现可溶性表达，将为深入开展AGV2抗原及其抗体检测、血清学调查，明确AGV2在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究VP2生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种AGV2型环形病毒VP2蛋白及其制备方法。
本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP2基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP2，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP2蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP2融合蛋白。
实现本发明的技术方案是：
一种AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白，利用pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP2基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP2，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP2蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP2可溶性蛋白。
进一步，所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；
上游引物：5’-ACGGACCAGCTCTAACCTCTGACACATGC-3’；
下游引物：5’-ACCGCCGGATGACATCAGAACTTCCAGAT-3’。
进一步，所述AGV2病毒VP2基因片段是利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒
为模板，PCR扩增出VP2基因片段；
上游引物：5’-ATGTCATCCGGCGGTCTCGGGGATTGC-3’；
下游引物：5’-TTAGAGCTGGTCCGTCTGGGTCTCCTG-3’。
本发明还提供了上述AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；
上游引物：5’-ACGGACCAGCTCTAACCTCTGACACATGC-3’；
下游引物：5’-ACCGCCGGATGACATCAGAACTTCCAGAT-3’；。
2)利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP2基因；
上游引物：5’-ATGTCATCCGGCGGTCTCGGGGATTGC-3’；
下游引物：5’-TTAGAGCTGGTCCGTCTGGGTCTCCTG-3’；
3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP2，阳性克隆经IPTG诱导表达，实现AGV2的VP2蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP2可溶性蛋白。
本发明所述的AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白可作为AGV2诊断抗原；以及作为免疫原获得抗VP2多克隆抗体。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：
1、本发明中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTM II体外重组技术克隆AGV2病毒VP2基因，简化克隆过程，实现VP2基因快速克隆表达。
2、本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略，可快速构建AGV2病毒VP2基因的原核可溶性表达载体。
3、本发明获得的AGV2病毒VP2可溶性表达及纯化的蛋白，可直接提供VP2可容性蛋白作为AGV2诊断抗原；作为免疫原获得抗VP2多克隆抗体；为开展AGV2血清学流行病学调查及VP2功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白，并为进一步探究VP2生物学功能具有重要意义。
附图说明
图1是本发明AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白的制备方法流程图。
图2本发明PCR扩增产物的电泳分析图(泳道M表示对照品DNAMarker的电泳分析图，泳道1、2分别代表线性化载体pGEX-6p-1以及AGV2病毒VP2片段PCR扩增产物的电泳分析图)。
图3是本发明AGV2病毒VP2基因的可溶性表达鉴定图(A是SDS-PAGE分析VP2蛋白的可溶性表达：泳道1、2、3,分别代表IPTG诱导的VP2超声裂解样品上清，沉淀及纯化后蛋白；泳道M为预染的蛋白分子量；B为抗GST单抗分析VP2蛋白表达：泳道1为IPTG诱导的VP2超声裂解样品；泳道2为IPTG诱导的GST超声裂解样品)。
图4是本发明间接免疫荧光鉴定抗VP2蛋白多克隆抗体图(A为转染pcAGV2-VP1-3的293T细胞的间接免疫荧光结果；B为转染pcDNA3.1载体的293T细胞的间接免疫荧光结果)。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了AGV2新型环形病毒VP2可溶性蛋白制备的示例。
实施例1
1)设计扩增pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP2基因片段引物：扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1034-1047位；且在5‘端带有额外15个碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-929位；且在5‘端带有额外15个碱基。扩增AGV2病毒VP2基因上游引物位于VP2基因1-27位，扩增AGV2病毒VP2基因下游引物位于VP2基因376-399位。pGEX-6p-1线性化载体上游引物5‘端额外15个碱基与VP2下游引物5‘端前15个碱基反向互补；pGEX-6p-1线性化载体下游引物5‘端额外15个碱基与VP2上游引物5‘端前15个碱基反向互补。具体引物序列见附表1。
2)pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP2基因片段PCR扩增：以pGEX-6p-1质粒以及pcAGV2-VP1-3质粒为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物,1μl 10ng/μl的pGEX-6p-1质粒或pcAGV2-VP1-3质粒，1μl商品化的PhantaSuper-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为：95℃变性3分钟,随后进行30个循环(95℃变性10秒,57℃退火30秒，72℃延伸3分钟),最后72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道M表示对照品DNAMarker的电泳分析图，其中泳道1、2分别代表线性化载体pGEX-6p-1以及AGV2病毒VP2片段PCR扩增产物的电泳分析图。
3)AGV2病毒VP2片段快速克隆进pGEX-6p-1载体：将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-1以及AGV2病毒VP2片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的AGV2病毒VP2片段产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-1表达线性化载体50ng，2μl商品化的ExnaseTMII酶，4μl 5倍的缓冲液，其它补加水至20μl。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μl反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。
4)AGV2病毒VP2可溶性蛋白诱导表达及其纯化:将获得的含AGV2病毒VP2基因的阳性克隆(命名为pGEX-VP2)转化BL21细菌，按1:100转接种到含有AMP+的LB培养基中，摇菌3h后，加入IPTG(1mmol/ml)诱导5h后收集细菌，进行超声40hz，40min破碎。将超声破碎样品离心1000r/min,10min后分上清与沉淀进行SDS-PAGE(5％的浓缩胶，10％的分离胶)以及Western blot分析(以抗鼠源的GST单抗为一抗，羊抗鼠HRP标记的IgG为二抗)鉴定表达及其可溶性。在图3A中，VP2蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。Western blot分析(图3B)则进一步证明了VP2融合蛋白的表达。在确定VP2的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了VP2蛋白的纯化。图3A泳道3是VP2蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果，蛋白浓度测定发现纯化后的蛋白浓度为1.6mg/ml。为进一步测定纯化后蛋白的抗原性，评价其能否作为免疫原及诊断用抗原，将纯化的VP2蛋白免疫小鼠，并通过间接免疫荧光以及ELISA方法测定小鼠血清中抗VP2抗体水平。以转染pcAGV2-VP1-3质粒的293T细胞为抗原进行的间接免疫荧光试验发现，二免疫后小鼠就能产生针对VP2蛋白的特异性抗体(图4A)。以纯化的VP2蛋白作为包被抗原进行的ELISA实验发现，二免疫后小鼠血清抗VP2抗体效价达1万以上。这些结果表明本发明表达的VP2蛋白具有很好的反应性及免疫原性，在AGV2血清学诊断中将具有良好的应用前景。
表1 扩增pGEX-6p-1线性化载体和AGV2病毒VP2片段引物设计
Claims (4)
1.一种AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白，其特征在于，利用pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP2基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP2，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP2蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP2可溶性蛋白；
所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；
上游引物：5’-ACGGACCAGCTCTAACCTCTGACACATGC-3’；
下游引物：5’-ACCGCCGGATGACATCAGAACTTCCAGAT-3’；
所述AGV2病毒VP2基因片段是利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP2基因片段；
上游引物：5’-ATGTCATCCGGCGGTCTCGGGGATTGC-3’；
下游引物：5’-TTAGAGCTGGTCCGTCTGGGTCTCCTG-3’。
2.一种AGV2型环形病毒VP2可溶性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；上游引物：5’-ACGGACCAGCTCTAACCTCTGACACATGC-3’；
下游引物：5’-ACCGCCGGATGACATCAGAACTTCCAGAT-3’；。
2)利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP2基因；
上游引物：5’-ATGTCATCCGGCGGTCTCGGGGATTGC-3’；
下游引物：5’-TTAGAGCTGGTCCGTCTGGGTCTCCTG-3’；
3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP2，阳性克隆经IPTG诱导表达，实现AGV2的VP2蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP2可溶性蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：
40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物,1μl 10ng/μl的pGEX-6p-1质粒或pcAGV2-VP1-3质粒，1μl商品化的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应循环参数为：95℃变性3分钟,随后进行30个循环，所述循环为95℃变性10秒,57℃退火30秒，72℃延伸3分钟；最后72℃延伸10分钟。
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