CN113912740A - 一种非洲猪瘟病毒i177l基因原核表达载体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，包括下述步骤：1）利用下述引物，以pGEX‑6p‑1质粒为模板，PCR扩增出pGEX‑6p‑1线性化表达载体；上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC 3’；下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT 3’；2）利用下述引物，以质粒pMD19T‑I177L为模板，PCR扩增出I177L原核表达片段；上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTATGAAATTATTTTG3’；下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAAGTAGATGAAC3’；3）利用重组酶ExnaseTM II对步骤1）和2）得到的PCR扩增产物进行快速重组克隆，得到阳性克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化，获得纯化的I177L融合蛋白。通过本发明，将获得非洲猪瘟I177L基因的表达载体，实现I177L基因在大肠杆菌中的表达，获得纯化的GST‑I177L融合蛋白。

Description

一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法
技术领域
本发明涉及一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，属于兽医学技术领域。
背景技术
非洲猪瘟病毒为线性双股DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，且是唯一已知的虫媒DNA病毒，能引起家猪和野猪感染的一种急性、烈性、高度接触的传染性疾病。急性型表现高热、出血斑，死亡率极高，可达到100％，其余类型出现精神沉郁、共济失调、呼吸困难等临床症状，给全球养猪业造成了巨大经济损失。I177L基因是新鉴定的非洲猪瘟毒力基因，位于ASFV基因组中间的稳定区，负责编码177个氨基酸，在病毒感染晚期表达。近年来研究发现敲除I177L 基因可以获得毒力减弱的毒株，家猪免疫后临床表现正常，并且对亲本毒株起到完全保护作用，不排毒。Borca Manuel V等又在ASFV-G-ΔI177L的基础上敲除了ASFV基因组中多基因家族(Multigene families,MGF)的八个基因，构建了衍生毒株ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR克服了原毒株只能在原代猪巨噬细胞中复制的缺点，为商品化疫苗的开发提供了可能。然而，对于I177L蛋白的生物学功能和作用机制还不甚清楚，本发明对非洲猪瘟病毒I177L基因进行克隆的基础上，构建其原核表达载体pGEX-6P-1-I177L并实现高效表达，获得GST-I177L融合蛋白，对该蛋白后续研究具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于针对上述存在的问题，提供一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，实现I177L蛋白的高效表达，为后续I177L蛋白生物学功能研究和基因缺失苗鉴别诊断试剂的开发提供条件。本发明的原理和最核心的技术是利用重组酶ExnaseTMII的同源重组克隆，构建I177L原核表达载体并实现 GST-I177L融合蛋白的高效表达。
本发明的目的是这样实现的：一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；
上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC 3’；
下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT 3’；
2)利用下述引物，以质粒pMD19T-I177L为模板，PCR扩增出I177L原核表达片段；
上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTATGAAATTATTTTG3’；
下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAAGTAGATGAAC3’；
3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR扩增产物进行快速重组克隆，得到阳性克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化，获得纯化的I177L融合蛋白。
步骤3)中，阳性克隆转化到BL21细菌，经IPTG诱导获得GST-I177L融合蛋白。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供了一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，其中，一种非洲猪瘟病毒I177L基因载体pGEX-6p-1，为现有研究中存在的多个问题提供可选择的条件。本发明公开了PCR扩增pGEX-6p-1 线性化载体引物以及PCR扩增非洲猪瘟病毒I177L基因引物序列。本发明还公开了一种基于重组酶ExnaseTM II并利用pGEX-6p-1线性化载体以及PCR扩增 I177L基因体外一步骤克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现I177L蛋白高效表达。
本发明的具体步骤为：
(1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；
上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC 3’；
下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT 3’；
(2)利用下述引物，以质粒pMD19T-I177L为模板，PCR扩增出I177L原核表达片段；
上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTATGAAATTATTTTG3’；
下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAAGTAGATGAAC3’。
(3)利用重组酶ExnaseTM II将线性化载体pGEX-6p-1和I177L基因的PCR 扩增产物进行连接重组反应，得到阳性克隆，并转化到BL21细菌，经IPTG诱导可获得GST-I177L融合蛋白。
本发明的有益效果为：
本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略，可不经酶切快速构建出非洲猪瘟病毒I177L基因的原核表达载体pGEX-6p-1-I177L，并以此原核表达载体实现非洲猪瘟病毒I177L高效表达及纯化融合蛋白，为深入研究I177L 生物学功能及基于ASFV-G-ΔI177L基因缺失苗鉴别诊断试剂的开发具有重要意义。
综上，本发明涉及一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法。具体内容包括利用同源重组技术，将I177L基因克隆至线性化载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，获得GST-I177L的融合表达蛋白，并成功对融合蛋白进行纯化。本发明将获得非洲猪瘟I177L基因的表达载体，实现I177L 基因在大肠杆菌中的表达，获得纯化的GST-I177L融合蛋白，表达载体构建和 I177L融合蛋白的纯化为进一步探究I177L基因生物学功能和诊断试剂盒的开发奠定了理论基础。
附图说明
图1PCR扩增线性化载体pGEX-6p-1和I177L原核基因片段。泳道M，DNA Marker；泳道1，线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物；泳道2，GST-I177L基因的PCR产物。
图2SDS-PAGE分析I177L融合蛋白的表达和纯化。泳道M，蛋白Marker；泳道1，GST菌体破碎上清；泳道2，GST菌体破碎沉淀；泳道3，GST-I177L 菌体破碎上清；泳道4，GST-I177L菌体破碎沉淀；泳道5，GST琼脂糖凝胶柱首次滤液；泳道6，纯化后GST-I177L蛋白。
图3Western Blot鉴定I177L融合蛋白。泳道M，蛋白Marker；泳道1， GST菌体破碎沉淀；泳道2，GST菌体破碎上清；泳道3，GST-I177L菌体破碎沉淀；泳道4，GST-I177L菌体破碎上清。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合图表给出了GST-I177L融合蛋白高效表达及纯化的示例。
1)、设计扩增pGEX-6p-1线性化表达载体和I177L基因片段引物，具体引物序列见表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
2)、pGEX-6p-1线性化表达载体和I177L基因原核片段扩增：以pGEX-6p-1 质粒为模版，pGF和pGR作为引物(序列见表1)，扩增线性化pGEX-6p-1，反应体系为：20μl水，25μl2X Phanta Max Master Mix，2μl 10μmol上游引物，2μl 10μmol下游引物,1μl10ng/μl的pGEX-6p-1。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性3分钟,随后进行30个循环(95℃变性30秒,57℃退火30秒，72℃延伸3分钟),最后72℃延伸10分钟。以I177L cDNA为模板，pG-I177L-2F和pG-I177L-2R作为引物(序列见表1)扩增I177L原核表达片段，反应体系为：20μl水，25μl 2X Phanta Max Master Mix，2μl 10 μmol上游引物，2μl 10μmol下游引物,1μl10ng/μl的cDNA模板。PCR 扩增反应循环参数为：95℃预变性3分钟,随后进行30个循环(95℃变性 30秒,55℃退火30秒，72℃延伸3分钟),最后72℃延伸10分钟。PCR 结束后，将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图1所示，其中泳道M 为DNA Marker，泳道1为线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物，泳道2为I177L 原核片段PCR产物。
3)、原核表达载体pGEX-6P-1-I177L的构建：通过胶回收获得的pGEX-6P-1 线性化载体和I177L片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆，如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的I177L片段产物 50-100ng，纯化的pGEX-6p-1线性化表达载体50ng，2μl商品化的ExnaseTM II 酶，4μl 5×CEⅡbuffer，其它补加水至20μl。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μl反应物转化到常规感受态细菌DH5α中，涂 LB板。次日挑取细菌克隆，菌落PCR鉴定阳性者送擎科公司测序，将序列正确者提取质粒，保存于-20℃待用。
4)、非洲猪瘟病毒I177L蛋白诱导表达及其纯化:将构建好的 pGEX-6P-1-I177L重组质粒转化BL21感受态细胞，涂板，挑取单菌落加入含AMP 的LB培养液中摇床培养过夜；将菌液以1∶100比例转接种到含有AMP的LB培养基中，经过反复摸索发现37℃摇菌3h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃诱导12h后蛋白表达量最高，后超声破碎2-3min，完成后将样品4℃10000r/min 离心10min，分离上清与沉淀，金属浴98℃煮样10min后，进行SDS-PAGE(5％的浓缩胶，12％的分离胶)以及Western blot分析(以抗鼠源的GST单抗为一抗， HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗)鉴定表达情况。在图2中，转化菌体裂解产物的上清和沉淀中均可见一特异条带，证明重组子能够正常表达。在确定I177L的可溶性表达基础上，大量摇菌并超声破碎，通过GST琼脂糖凝胶柱纯化得到可溶性融合蛋白GST-I177L。图2中泳道6是I177L蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果。在图3中Western blot结果显示GST-I177L融合蛋白能与抗GST单抗发生特异性反应，与预期大小一致，进一步证明GST-I177L融合蛋白表达的正确性。
表1扩增线性化pGEX-6p-1载体和ASFV病毒GST-I177L基因片段引物设计
Figure RE-GDA0003395945530000051
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatgacggt gaaaacctct gacacatgc 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgggcccc tggaacagaa cttccagat 29
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttccagggg cccatgtatg aaattatttt g 31
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttttcaccg tcattaaaag tagatgaac 29

Claims (2)

1.一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1）利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板， PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；
上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC 3’；
下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT 3’；
2）利用下述引物，以质粒pMD19T-I177L为模板，PCR扩增出I177L原核表达片段；
上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTATGAAATTATTTTG 3’；
下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAAGTAGATGAAC 3’；
3）利用重组酶ExnaseTM II对步骤1）和2）得到的PCR扩增产物进行快速重组克隆，得到阳性克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化，获得纯化的I177L融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒I177L基因原核表达载体的方法，其特征在于，步骤3）中，阳性克隆转化到BL21细菌，经IPTG诱导获得GST-I177L融合蛋白。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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