CN111088379B - 用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组及其用途 - Google Patents

用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组及其用途。所述的引物组由上游引物以及下游引物组成，其中所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。特异性实验结果表明该引物组只与马流产沙门氏菌反应，而与其他马、驴常见传染病病原均无交叉反应，具有良好的特异性。灵敏度实验表明，该引物组检测马流产沙门氏菌的最低限度为4.7×103CFU/ml，具有良好的敏感性。本发明的提出为马流产沙门氏菌的检测或诊断提供了一种有效技术手段，通过本发明的方法，使马流产沙门氏菌的检出率极大提高，诊断更精确，对于马流产沙门氏菌病的防控具有重要意义。

Description

用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组及其用途，特别涉及一种基于马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC设计的特异性引物组及其用途，本发明属于生物技术领域。
背景技术
马流产沙门氏菌病(Equine abortus salmonellosis)，又称为马副伤寒(Equiparathphoid)，是由马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)引起的，以马属动物流产为特征的传染病。最早在18世纪末19世纪初时，欧美地区曾发生过大批量马流产的现象，在20世纪70年代末，我国华北、西北、东北等养马数量多的地区也陆续爆发马流产沙门氏菌病，导致大批量马出现流产，对我国当时马业的发展造成了比较严重的经济损失。在2017-2018年，我国华东地区孕驴，出现了超过30％的流产率，西北、华北地区马疫情更为严重，流产率30-100％，甚至会更高，这与先前报道高流产率一致。
疫情的爆发，给我国养马业、养驴业，造成了极大的经济损失，严重制约我国马、驴产业的快速发展。如果能够做到快速正确诊断，采取科学的防控措施，可以最大程度上控制疫病的蔓延，降低流产带来的经济损失。关于马流产沙门氏菌的诊断方法均停留在传统的检测技术手段上，如病原学检测以细菌分离鉴定为主，存在周期长，分离率低等缺点；血清学检测依赖于试管凝集试验，该方法操作繁琐、不适用于大规模样品的检测、特异性不强、敏感性较低。缺乏商品化的快速检测试剂盒。我们在前期研究中发现，利用16S rDNA基因进行PCR鉴定，结果获得的扩增序列，只能鉴别为沙门氏菌属，不能够特异性地鉴定出是沙门氏菌属中的哪种病原菌，因为16SrDNA基因在沙门氏菌属内同源性高达99.6％。特别是针对可引起马流产的马流产沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌不能做出鉴别诊断。因此，有必要建立一种特异性的PCR检测方法实现对马流产沙门氏菌的快速诊断。
沙门氏菌的鞭毛蛋白成分主要是蛋白质，鞭毛抗原中含有不同的H抗原，分为I型和II型，即FliC和FljB蛋白，每个鞭毛都由基体、弯钩和细丝三个亚单位组成，结构极其复杂，具有良好的收缩性，抗原性，但是不稳定，一旦遇到酒精或着受到高温，其结构则会被破坏。鞭毛也是沙门氏菌的主要毒力因子，沙门氏菌鞭毛与其在体外的定值以及侵袭细胞的能力有关，缺失后，导致在体内生存能力减弱，致病力减弱。两种蛋白的结构比较相似，两端高度同源，中间差异大，称为可变区，可变区中不同的碱基序列编码不同的氨基酸序列，形成不同的抗原表位，具有特异性，也被称为抗原决定区。在单个细胞中只有一种鞭毛蛋白可以表达。
本发明选取鞭毛蛋白FliC为研究对象，扩增不同分离株的FliC全基因，通过比对分析后，选取501-1080bp区域设计了一对特异性引物，并证实具有良好的敏感性、特异性，可以作为马流产沙门氏菌检测和诊断的特异性引物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够特异性检测或诊断马流产沙门氏菌的引物组，并建立基于该引物的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明通过对不同马属动物来源的15株马流产沙门氏菌FliC基因进行扩增，并对扩增产物进行序列分析，比较不同沙门氏菌的差异性，结果表明，驴源分离株与马源分离株同源性99.5-99.9％，高度保守。与同属沙门氏菌同源性为57.3％-80.9％，在碱基501-1080bp之间同属沙门氏菌序列差异大，属内同源性38.2-73％，以此段序列为模板设计一对特异性引物P3/P4，用于马流产沙门氏菌特异性核酸诊断。特异性实验结果表明该引物组只与马流产沙门氏菌反应，而与与其他马、驴传染病病原均无交叉反应，具有良好的特异性。灵敏度实验表明，该引物组检测马流产沙门氏菌的最低限度为4.7×103CFU/ml，具有良好的敏感性。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组，所述的引物组由上游引物以及下游引物组成，其中所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，本发明还提出了所述的引物组在制备检测或诊断马流产沙门氏菌试剂中的用途。
其中，优选的，所述的试剂为PCR检测试剂或试剂盒。
其中，优选的，所述的试剂用于检测或诊断马流产沙门氏菌时，所采用的PCR体系为：
反应体系20μL：2×Taq Master Mix，10μL；上游引物及下游引物，各1μL；ddH2O，6μL；模板，2μL。
其中，优选的，所述的试剂用于检测或诊断马流产沙门氏菌时，所采用的PCR反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，56℃或58℃或60℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃终延伸10min。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明克服了现有检测或诊断马流产沙门氏菌的方法存在的弊端，提供了一种可用于特异性检测或诊断马流产沙门氏菌的引物组，并建立了相关检测方法，通过PCR检测，使马流产沙门氏菌的检出率极大提高，诊断更精确，对于马流产沙门氏菌病的防控具有重要意义。
附图说明
图1为特异性引物P3/P4在FliC全基因序列上的对应位置；
图2为FliC基因的PCR扩增结果；
其中：1-4泳道为不同马流产沙门氏菌菌落样本的扩增结果；5泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；
图3为FliC基因的相似性；
其中：KX1-KX5代表同一流产马驹不同组织的分离株，D1-D3代表驴源沙门氏菌分离株，H1-H10代表马源沙门氏菌分离株；
图4为不同扩增温度下FliC基因的PCR扩增结果；
其中：1-3泳道分别为退火温度为56℃、58℃以及60℃时的扩增结果；4泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；
图5为FliC基因的灵敏性PCR扩增结果；
其中：1-10泳道对应的细菌数分别为4.7×108CFU、4.7×107CFU、4.7×106CFU、4.7×105CFU、4.7×104CFU、4.7×103CFU、4.7×102CFU、4.7×101CFU、4.7×100CFU、4.7×10- 1CFU；11泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker；
图6为P3/P4引物的特异性检测结果。
其中：1-8泳道分别为马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、链球菌、马动脉炎病毒、马传染性贫血病毒、马流感病毒、马I型、IV型疱疹病毒的扩增结果；9泳道为阴性对照；M泳道为DNA marker。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
实施例1用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物的设计及应用
1材料与方法
1.1质粒和菌株
PMD18T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自上海康为世纪有限公司；马流产沙门氏菌菌株保存于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所马传染病与慢病毒研究创新团队。
1.2样品及试剂
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、高纯度质粒小提试剂盒(Pureplasmid Mini Kit)等均购自康为世纪有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)购自TIANGEN
1.3引物的设计
根据GenBank中马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC基因组序列(GenBank HE801374)，设计一对引物P1/P2，扩增全长FliC基因。通过序列分析后，选取501-1080bp区域设计一对特异性引物P3/P4，用于马流产沙门氏菌特异性核酸的诊断(图1)。
表1 FliC PCR扩增引物
Figure BDA0002369755860000051
1.4鞭毛蛋白FliC基因的克隆与序列分析
参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，并以此为模板，PCR扩增FliC基因。反应体系20μL：2×Taq Master Mix，10μL；P1及P2，各1μL；ddH2O，6μL；模板，2μL；反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃终延伸10min；待PCR反应结束后，取6μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。依据Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。并将其连接至PMD18T载体，转化DH5α，挑取阳性克隆并送吉林库美生物公司进行测序并进行序列分析。
1.5马流产沙门氏菌检测引物退火温度的优化
以马流产沙门氏菌的核酸为模板，进行PCR扩增，反应体系同1.4，只是将其中的引物替换为P3及P4，反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，56℃/58℃/60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃终延伸7min；待PCR反应结束后，取7μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6引物的敏感性鉴定
选取对数生长期的马流产沙门氏菌的新鲜菌液，依次稀释10倍，选取三个浓度涂板进行计数。稀释后的菌液分别取1ml，离心处理，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，最终50μL洗脱。利用P3/P4引物进行PCR扩增，反应条件同1.5，退火温度为58℃，模板为2μL。结束后，分别取7μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。
1.7引物的特异性鉴定
分别以马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、链球菌、马动脉炎病毒、马传染性贫血病毒、马流感病毒、马I型、IV型疱疹病毒等核酸为模板，利用P3/P4引物进行PCR扩增，反应条件同1.5，退火温度为58℃，模板为2μL。结束后，分别取7μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。
1.8临床样本的PCR诊断
以P3/P4为引物，对2018年收集的部分样品进行PCR鉴定，并对数据进行统计分析。
2结果
2.1马流产沙门氏菌FliC基因的克隆
PCR扩增马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC基因，扩增的产物经1％琼脂糖凝胶电泳，初步表明，获得了1条约1500bp的特异带，与预期大小相一致(图2)。
2.2重组质粒PMD18T-FliC的鉴定及序列分析
对构建的PMD18T-FliC重组质粒，PCR鉴定正确后，进行测序，序列测定表明，克隆到的FliC基因，全长1427bp，为马流产沙门氏菌FliC基因。氨基酸同源性和核苷酸同源性分析结果表明(图3)，从马、驴所扩增的18条FliC序列与同属标准株DQ838252-pullorum(鸡白痢沙门氏菌)、AY353319S.typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)、AY353260S-bongori(邦戈尔沙门氏菌)同源性为57.3％-80.9％，18条FliC序列之间同源性为99.2-100％。
2.3马流产沙门氏菌退火温度的优化
设置不同退火温度，待PCR反应结束后，取6μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示不同退火温度下均得到单一明亮条带，位置与预期大小相符(图4)。因此PCR退火温度选取56℃、58℃或60℃均可以。
2.4引物的敏感性
经细菌计数结果显示，原菌液浓度约为4.7×108CFU/ml，作10倍梯度稀释后作为PCR扩增的模板，如图5所示，1-10泳道依次细菌数为4.7×108CFU～4.7×10-1CFU。经PCR扩增后，电泳结果显示，最低检测限度为4.7×103CFU/ml(图5，第6泳道)。
2.5特异性鉴定
分别以马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、链球菌、马动脉炎病毒、马传染性贫血病毒、马流感病毒、马I型、IV型疱疹病毒的核酸作为模板进行马流产沙门氏菌FliC的PCR扩增，结果显示除马流产沙门氏菌以外，其他非特异性病原菌均未获得特异性的目的条带(图6中第2-8泳道)，由此证明P3/P4引物具有良好的特异性。
2.6临床样本的PCR诊断
对不同时间收集的临床样本，分别采用细菌分离方法以及本发明建立的马流产沙门氏菌FliC特异性PCR检测方法进行沙门氏菌鉴定，统计结果如下表2。对于流产组织(26份)，细菌分离方法及FliC PCR检测方法的阳性率均为100％；对于疫区采集的40份驴阴道拭子，细菌分离方法的阳性率为2.5％，FliC PCR检测方法的阳性率为50％；对于非疫区的772份拭子，细菌分离方法及FliC PCR检测方法的阳性率均为0％，其中细菌分离时出现过1个菌落，但是该菌落不能够在液体培养基中生长，继续传代后也无菌落生长，因此仍为阴性。将流产组织和阴道拭子中FliC PCR鉴定为阳性的扩增产物，分别选取5份进行测序分析，序列分析证实均为马流产沙门氏菌。
表2 FliC PCR检测方法与细菌分离方法的结果比较
Figure BDA0002369755860000071
从上述结果可以看出，细菌分离鉴定分离率较低，很容易出现漏检的情况。而本发明建立的马流产沙门氏菌FliC特异性PCR检测方法，敏感性更高，马流产沙门氏菌的阳性检出率更高，更准确。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组及其用途
<160>4
<170>Patent-In 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>1
ttgacccaga ataacctgaa ca 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>2
tgcggaacct ggttcgcctg cg 22
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>3
tgatgtgaag agcgaagcag 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>artificial sequence
<400>4
ttcagtttta ccgtctgcgc 20

Claims (5)

1.用于检测马流产沙门氏菌的特异性引物组，其特征在于，所述的引物组由上游引物以及下游引物组成，其中所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测或诊断马流产沙门氏菌试剂中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的试剂为PCR检测试剂或试剂盒。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的试剂用于检测或诊断马流产沙门氏菌时，所采用的PCR体系为：
反应体系20μL：2×Taq Master Mix，10μL；上游引物及下游引物，各1μL；ddH2O，6μL；模板，2μL。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的试剂用于检测或诊断马流产沙门氏菌时，所采用的PCR反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，56℃或58℃或60℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃终延伸10min。
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