CN103484537A - 一种马流产沙门菌pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可用于检测马流产沙门氏菌的PCR检测试剂盒，包括引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其中的上游引物是5’ATTAGTGCCGGTTTTATCCT3’下游引物是5’TTACCACTCGCATCAAATC3’，PCR检测方法：提供待测样品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10×buffer、引物、DNA聚合酶、待测样品和ddH2O，混匀；令簿壁管中的混合物在PCR仪上扩增；在电泳设备中电泳扩增产物；分析并进行结果判断。该PCR试剂盒配制方法简便，易于产业化生产，PCR检测方法检测马流产沙门菌的灵敏度高、检测周期短、速度快、可操作性强、其检测精度达30个菌或5.7pg的模板DNA，而检测成本却相对较低，在该病的临床防控中具有重要的应用价值。

Description

一种马流产沙门菌PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种可用于检测马流产沙门氏菌的PCR检测试剂盒，具体内容是利用试剂盒中自行设计的特异引物，结合PCR检测方法检测马流产沙门菌，为马流产沙门菌的检测提供了一种特异、敏感、快速的方法。 
技术背景
马副伤寒性流产是由马流产沙门氏杆菌所引起的马属动物的一种慢性传染病，在临床上无明显的全身症状，以孕马突然流产为特征。该病广泛地分布于世界各国，在欧洲18-19世纪大批流行，1893年由Smith和hlome发现本菌后，在世界各地均发现此病。渡部氏于1939年曾报告在内蒙海拉尔地区某些马场中发现本病，1958年河北省坝上地区某些马场中亦有发生。1959和1963年察北牧场流产80余匹，流产率分别达53％以上。 
准确而快速的诊断是控制疾病的关键，在疾病暴发时显得尤其重要。诊断的速度决定疾控响应的速度，而疾控响应的速度又决定疾病传播的范围、疾病控制的成败和经济损失的程度。在我国随着养马业的快速发展对马流产的诊断也越来越受重视。 
马流产沙门菌传统的诊断方法主要依靠流产病原材料中病原微生物学分离、培养和生化试验等进行鉴定。这种方法存在诸多局限性，如马流产沙门菌在生化试验时往往出现不一致现象，可靠性差。另外检测周期长，一般至少需要7～14d才能做出结果，极不利于对患马进行及时治疗。此外一些养殖场特别是发展中国家的普遍使用抗生素使得检测沙门氏菌较困难。 
随着分子生物学技术的发展，许多新的分子生物学技术正在被用来进行马流产沙门菌的分离鉴定。最近几年出现了一些新的检测方法，如：胶乳凝集反应，酶联免疫吸附试验，免疫荧光试验、和DNA杂交试验。这些方法虽然快速但特异性差，且免疫方法检测沙门氏菌的检出率较低，从而限制了它们的推广和应用。 
PCR技术近年来在检测沙门氏菌方面得到了广泛的应用，其具有敏感性高、特异性强、快速、简便、能高通量检测、重复性好等突出优点。总之PCR技术的应用很大程度上弥补了传统鉴定方法的弊端。PCR法已被证明可为检测沙门氏菌提供一个新方法。PCR诊断方法与传统的形态染色、培养特性和生化鉴定方法相比较，能够提高检测灵敏度、缩短检测时间、简化检测程序，实现检测的自动化、快速化、特异化，在沙门氏菌的临床诊断中具有重要的 应用价值。 
国内目前对马流产沙门氏菌的研究较少，诊断也主要依靠传统的分离、培养和生化试验等进行鉴定，这些方法过程复杂，周期长，所需试剂繁多，可靠性差。目前PCR技术在检测马流产沙门氏菌方面的研究和应用还尚未见报道。 
发明目的 
针对目前国内马业快速发展及马流产沙门菌病诊断和研究中对于快速简便诊断方法的需求，本发明提供了一种马流产沙门菌PCR检测试剂盒及其检测方法。根据已发表的马流产沙门菌基因序列，设计合成引物，扩增得到了1300bp的基因产物。该PCR诊断方法与传统的形态染色、培养特性和生化鉴定方法相比较，具有快速、准确的优点，并且具特异性好，灵敏度高，在该病的临床诊断中具有重要的应用价值。 
发明内容
本发明建立的马链球菌马亚种PCR诊断方法具有以下特征： 
(1)自行设计的鉴定引物，利用PCR方法扩增基因片段，扩增引物正向引物为上游引物是5’ATTAGTGCCGGTTTTATCGT3’   下游引物是5’TTACCACTCGCATCAAATC3’经该引物的扩增应得到1300bp的条带。 
(2)对被检细菌的基因组的PCR扩增。 
将提取马流产沙门菌基因组DNA，经PCR扩增后，得到1300bp的条带，与预期目的片段大小相符。 
(3)对建立的马流产沙门菌PCR诊断试剂盒及方法的敏感性检测。 
提取细菌的基因组DNA，进行5倍梯度稀释，对提取各稀释度基因组DNA按最适条件进行PCR反应，以确定本方法对该菌的检测限。 
(4)建立的马流产沙门菌PCR诊断试剂盒及方法的特异性的检测。 
利用所建立的马流产沙门氏菌PCR方法扩增经煮沸法提取的试验菌株的基因组DNA，验证本方法的特异性。 
发明效果 
(1)与传统和现有的方法相比该PCR检测试剂盒的检测法具有操作简便的特点。 
(2)与传统和现有的方法相比该PCR检测试剂盒的检测法具有检测速度快的优点。 
(3)该PCR检测试剂盒的检测法具有灵敏度高的特点。 
(4)该PCR检测试剂盒的检测法具有特异性强的特点，非常适用于马流产沙门氏菌的准确的检测与诊断。 
附图说明
图1是马流产沙门氏菌标准菌株的PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳结果图。 
M：DL2000DNA Marker；1：阳性菌株2：阴性对照菌株。 
图2是马流产沙门氏菌PCR检测试剂盒的敏感性检测结果图。 
M：DNAMarker DL20001：基因组未稀释的2：基因组10倍稀释3：基因组20倍稀释4：基因组50倍稀释5：基因组100倍稀释6：基因组200倍稀释7：基因组500倍稀释8：基因组103倍稀释9：基因组104倍稀释。 
图3是建立的马流产沙门氏菌PCR检测试剂盒的特异性的检测结果图。 
M：DNA Marker DL20001：马流产沙门氏菌的标准菌株；2：金黄色葡萄球菌分离株3：链球菌兽疫亚种标准菌株4：大肠杆菌的标准菌株5：大肠杆菌DH5a菌株6：大肠杆菌BL21菌株。 
具体实施方案
为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。 
实施例1：被检细菌基因组的提取及目标基因的PCR扩增。 
基因组的提取 
将纯化好的菌株接种于3mL的液体培养基中，过夜培养。具体方法如下： 
(1)取过夜培养的1.5mL菌液，离心，弃去培养基，再用灭菌去离子水，400uL旋沉淀，充分混匀后，再次离心，12000rpm，5min。重复上述操作一次。 
(2)弃去上清后，加入400uL的TE缓冲液，充分混匀后加入100uL(20mg/mL)溶菌酶和5uL的RNA酶，再次充分混匀后，37℃水浴1h30min。 
(3)加入80uL10％SDS溶液，充分混匀后，37℃水浴1h30min。 
(4)加入100uL 5mol/L Nacl溶液和80uL CTAB/Nacl溶液，充分混匀，37℃水浴30min，-20℃放置20min。 
(5)加入500uL酚∶氯仿抽提液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，充分混匀，12000rpm，离心10min。轻轻的吸取上清，转移至另一干净的离心管中。 
(6)重复(5)一次 
(7)加入0.1倍体积的醋酸钠(pH＝5.2)和0.6倍体积的异戊醇，轻轻的颠倒混匀，-20℃放置20min。 
(8)离心12000rpm，10min，弃上清，沉淀用70％乙醇400ul清洗沉淀，12000rpm，8min离心，用移液器轻轻的吸出上清，敞开管口，置于室温，待乙醇挥发完全。加入20uL的TE缓冲液，充分溶解沉淀，-20℃冻存备用。 
将提取后的基因组进行凝胶电泳鉴定。 
目的基因的PCR扩增 
PCR反应体系(20uL)：无酶水8.5uL，taq酶混合物10uL，上游引物0.5uL，下游引物0.5uL，模板0.5uL。 
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30S，54℃退火30S，72℃延伸90S，循环30次，72℃延伸10min，4℃保温。 
PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段长度约为1300bp的阳性产物。 
实施例2：对建立的马流产沙门菌PCR诊断试剂盒及方法的敏感性检测。 
初始浓度为57ng/μL的被检菌基因组DNA经200倍稀释后仍能观察到扩增条带（见图2)，表明本PCR方法对培养菌DNA的检测灵敏度约为5.7pg。 
实施例3：建立的马流产沙门菌PCR诊断试剂盒及方法的特异性的检测。 
利用建立的沙门氏菌PCR方法对数株细菌进行特异性检测，沙门氏菌为阳性，而其他菌株均表现阴性(见图3)，说明本研究建立的PCR方法具有特异性。 

Claims (5)

1.一种用于马流产沙门氏菌PCR检测试剂盒包括引物，dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’ATTAGTGCCGGTTTTATCGT  3’，下游引物是5’TTACCACTCGCATCAAATC  3’。
2.根据权利要求1所述的的特异性引物对被检测的细菌基因组进行PCR扩增应得到1300bp的PCR扩增产物。
3.根据权利要求1所述的马流产沙门氏菌PCR检测试剂盒，该诊断方法应当具有的敏感性为30个菌或5.7pg的模板DNA。
4.根据权利要求1所述的马流产沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征是该试剂盒对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌35218，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21以及兽疫链球菌等的扩增呈阴性结果。
5.根据权利要求1所述的马流产沙门氏菌PCR检测试剂盒包括其在马流产沙门菌病的临床诊断和研究中的应用。
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