CN104845993A - 一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种应用于生物医学临床体外诊断领域中的包含丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。该假病毒颗粒是由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹丙型肝炎病毒RNA的一种 RNA-蛋白复合体，且为二十面体；设计并人工合成引物通过重叠剪接PCR的方法得到目的基因MS2，将其连接到质粒 pET-32a(+)上得到重组质粒pET-MS2，将所得重组质粒pET-MS2与HCV片段连接得到pET-MS2-HCV重组质粒，将所得pET-MS2-HCV重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达，采用超声破碎法释放病毒样颗粒，所得病毒样颗粒即为含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒。本发明的假病毒颗粒制备方法简单、容易操作、获得的假病毒纯度高，可作为 RT-PCR 检测的标准品和质控品，无传染性、纯度高、稳定性好，具有耐核糖核酸酶等特点。

Description

一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体是涉及一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。

背景技术

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染引起的主要经血液传播的疾病，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞肝癌(HCC)，目前尚无有效疫苗，亦无有效治愈方法，故早期、准确诊断HCV感染状况有重要意义。

HCV是一组致人类肝炎的病毒，其基因组呈现高度异质性，根据HCV基因组核苷酸序列的差异程度，可将HCV分为6种主要基因型及不同个亚型。照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型．以小写的英文字母表示其基因亚型(如1a、2b、3c等)。HCV 1～3型有广泛的分布，其中la和1b型最为常见，约占全球丙肝感染的60.0％，尤其是在北欧、北美、南欧、东欧和日本，3型主要在东南亚流行；4型在中东、埃及和中非较多；5型仅在南非被监测到，其他基因型在亚洲有不同的分布[http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/whocdscsrlyo2003/en/index2.html#HCV;Oliver GP,Eleanor B,Rachel T,et al.Genetic history of hepatitis C virus in East Asia.J Virol,2009,83:1071-1082.]。在中国，HCV lb和2a型较为常见，其中以1b型为主，多为IL28B基因CC型；某些地区也有la、2b和3b型报道。6型主要见于香港、澳门和部分南方边境省份。

HCV在分类上归于黄病毒科丙肝病毒属，基因组为单股正链RNA，约由9600个核苷酸组成。HCV基因组可分为3个区域, 即5'非编码区(5'NTR, NCR, UTR)、编码区(ORF)、 3'非编码区(3'NTR)。5'NTR：此区高度保守，是病毒翻译的起始位点, 在HCV复制过程中有非常重要的作用。HCV 5'非编码区(5'NTR)含有一个内在核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，IRES可指导核糖体进入起始蛋氨酸密码子，体外分析其活性，特别是对开放读码框架(ORF)翻译的启动非常重要。另外，5'NTR还可作为复制信号，或直接与病毒基因组3'端相互作用，或间接参与RNA-蛋白质的相互作用。开放读码框架(ORF)：编码约含3010个氨基酸的前体蛋白。包括结构区和非结构区：结构区编码病毒的核心蛋白(C蛋白)和包膜蛋白(E1．E2／Nsl)，又称为机构蛋白，参与病毒的组装；非结构区包括NS2-NS5。编码7种非机构蛋白。在病毒复制和稳定病毒的生物学性状等方面起重要作用。如NSSB蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，为HCV复制所必需，是抗病毒治疗的重要靶位。3'NTR中的保守序列可潜在形成三个稳定的茎环结构，是黑猩猩体内HCV复制所必需的结构。由于HCV 3'和5'末端序列在不同HCV株间高度保守，使其成为抗病毒治疗的优选靶位。

在对HCV进行核酸检测时，一般有三个步骤需要阳性对照：步骤一：提取HCV RNA，主要为病毒外膜及衣壳的破碎，病毒核酸的释放；步骤二：HCV RNA逆转录为cDNA；步骤三：cDNA与PCR反应液混合，在PCR仪中扩增并得到信号。现有的阳性对照，主要包含下述几种来源：确诊为乙型肝炎患者或被感染动物的阳性血清；体内或体外转录RNA；质粒或化学合成。所有阳性对照中，最准确可靠的应该是含HCV病毒的天然样本(如患者或被感染动物的血液、细胞培养液)，可充分保证其作为前述三个步骤的阳性对照，但其最大缺陷在于天然样本来源有限，且存在病毒扩散的潜在危害性。体内或体外转录的HCV RNA，可以作为逆转录的阳性对照；但是，由于其不具备病毒外壳，所以不适合作为提取病毒RNA步骤中的阳性对照，且易被环境中普遍存在的RNase降解，不易保存。用质粒作为阳性对照，其优点是制备容易，但由于质粒是DNA，不是RNA，因此它只能作为PCR扩增步骤的阳性对照，而无法作为RNA提取和逆转录的对照。至于化学合成法，成本非常高，没有核衣壳的保护而容易降解，因此不适用于大规模生产。

所谓人工假病毒颗粒是将目的RNA病毒基因通过扩增及克隆连接至可以诱导表达噬菌体基因的表达载体上，通过诱导表达产生包被有噬菌体衣壳蛋白的目的RNA片断，这种技术又叫做装甲RNA(Armored RNA)技术(Pasloske B L, et al. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J].J Clin Microbiol，1998,36(12)：3590-3594)。

目前构建假病毒颗粒常用载体主要为MS2噬菌体和能够高效表达的表达载体。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。MS2噬菌体是正性单链RNA病毒，属于轻小噬菌体科、轻小噬菌体目、轻小噬菌体属，由外裹蛋白衣壳的核酸组成，是性菌毛RNA大肠杆菌噬菌体的4个血清型中第1血清群的典型代表。MS2噬菌体基因组全长3569碱基对，可编码成熟蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。MS2噬菌体能够通过吸附性菌毛（F-pili）感染雄性大肠杆菌，感染后每个细胞能产生10³～10⁴个噬菌体[van Meerten D, Olsthoorn R C, van Duin J, et al. Peptide display on live MS2 phage: restrictions at the RNA genome level[J]. J Gen Virol, 2001,82:1797-1805.]。电子显微镜下MS2噬菌体直径约27nm[Strauss J H Jr, Sinsheimer R L. Purification and properties of bacterio phage MS2 and of its ribonucleic acid[J]. J Mol Biol, 1963,7:43-54.]。一个噬菌体颗粒包括180个衣壳蛋白单体、一分子成熟蛋白，包裹一分子基因组RNA组成的正二十面体(贾盘兴. 噬菌体分子生物学基本知识和技能[M].北京：科学出版社，2001，2-5)。噬菌体对宿主寄生具有高度特异性，只能侵染一种细菌中的某一菌株。MS2噬菌体的宿主是大肠杆菌，在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中广泛存在[Theitler D J, Nasser A, Gerchman Y, et al. Synergistic effect of heat and solar UV on DNA damage and water disinfection of E. coli and bacteriophage MS2[J]. J Water Health, 2012,10:605-618]。

发明内容

  本发明中提到的一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹丙型肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体；其内含有丙型肝炎病毒5’UTR基因序列，具有耐核糖核酸酶的特性，并且易于制备、保存和运输，可作为丙型肝炎病毒基因诊断试剂盒中的标准品和质控品。

 一种含丙型肝炎RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其具体制备步骤为：

步骤一、pET-MS2重组子的构建

1）依照GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列（NC_001417），自主设计扩增成熟蛋白和衣壳蛋白融合基因的引物MS2F、P2、P3及MS2R并进行人工合成，序列分别为：

MS2F：5＇-CGGGATCCGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTA-3＇，

P2：5＇-GGAACCTGGAGACTATCTAGAGAGCCGTTGCCTGATT-3＇，

P3：5＇-TCTCCAGGTTCCCCGGAGTTTGAAGCATGGCTTCTAA-3＇，

MS2R：5＇-CCCAAGCTTCAATACATAAAGAGTTGAACTTCTT-3＇，

下划线所指为上下游引物分别引入的BamH I和HindⅢ酶切位点；然后通过重叠剪接PCR的方法扩增出成熟蛋白和衣壳蛋白基因（MS2基因），其碱基序列如SEQ ID NO：5；

2）将融合扩增得到的MS2基因和质粒pET-32a(+)使用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切，然后通过T4 DNA连接酶将两者进行连接，得到连接产物；

3）将上述步骤2）所得到的连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，挑单个菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定，将鉴定正确的单个菌落进行扩大培养并提取质粒，将重组质粒命名为pET-MS2, 置于-20℃保存；

步骤二、pET-MS2-HCV重组子的构建

1）依据GenBank数据库中的HCV病毒5’UTR基因序列（GenBank: KC285356.1），自主设计并人工合成丙型肝炎病毒HCV基因片段的PCR扩增引物对，序列分别为：

上游引物HCVF：5＇-CCCAAGCTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTT-3＇，

下游引物HCVR：5＇-CCGCTCGAGGGGCGGCGGTTGGTGTTACGTTTGG-3＇，

下划线所指为上下游引物分别引入的HindⅢ和XhoI酶切位点；然后通过PCR方法扩增出HCV基因，其碱基序列如SEQ ID NO：8；

2）将扩增得到的HCV片段和重组质粒pET-MS2使用限制性内切酶HindⅢ和XhoI分别双酶切，采用胶回收试剂盒分别纯化回收后，将两者用T4 DNA 连接酶连接，得到连接产物；

3）上述步骤2）说制备的连接产物转化入大肠杆菌，挑单菌落分别进行PCR鉴定，将鉴定正确的菌落进行扩大培养并提取质粒，将质粒命名为pET-MS2-HCV； 步骤三、诱导表达与纯化 将上述步骤二鉴定正确的含有pET-MS2-HCV重组质粒的阳性菌落，重新涂布于含氨苄霉素的LB 固体培养基平板，挑取单菌落接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中，培养至A_600nm为0.5～1.0时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/ L，继续培养36h，然后采用超声破碎法裂解出病毒样颗粒物，向溶液中加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I至终浓度均为1mg/L，37℃水浴作用2h。离心收集上清，即为本发明含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，4℃保存。

  有益效果

本发明的一种含丙型肝炎病毒RNA的病毒样颗粒，内含HCV 5’UTR保守区基因片段，经试验验证该病毒样颗粒具有以下几个方面的优点: 1、内含HCV 5’UTR保守区基因片段，该片段无传染性，在制备和使用时对人员和环境均无危险，安全可靠；2、稳定性好，MS2假病毒颗粒具有耐RNA酶的特点，经稳定性验证，制备的假病毒颗粒能够耐DNA酶及RNA酶攻击，且在37℃可以长期保存。3、对天然HCV病毒具有很好的模拟作用；由于表达产物为噬菌体样颗粒，具有病毒颗粒的外壳结构，可以很好的模拟病毒颗粒，在进行核酸提取及PCR鉴定过程中全程监测整个实验过程，避免出现假阴性可能。本发明可作为丙型肝炎病毒的基因诊断试剂盒的质控品和/或标准品，具有很强的实用价值。

附图说明

图1是MS2 重叠剪接PCR产物电泳图；图中标号：1为MS2 成熟蛋白扩增产物、2为MS2 衣壳蛋白扩增产物、M为DNA分子量标准。

图2是MS2基因融合产物电泳图；图中标号：1为MS2融合基因产物、M为DNA分子量标准。

图3是重组质粒pET-MS2双酶切电泳图；图中标号：1为pET-MS2重组质粒双酶切、M为DNA分子量标准。

图4是HCV扩增产物电泳图；图中标号：1为HCV扩增产物、M为DNA分子量标准。

图5是病毒样颗粒的定性测定结果图；图中标号：M为DNA分子量标准，1,2为反转录后扩增产物、5,6为无反转录直接扩增产物。

图6是病毒样颗粒核糖核酸酶攻击试验结果图。

图7是病毒样颗粒稳定性试验结果图。

具体实施方式

本发明实施例涉及以下菌种、试剂和仪器：大肠杆菌MS2噬菌体(ATCC 15597B1)购于美国ATCC公司；大肠杆菌BL21(DE3)菌株购于北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α菌株购于大连宝生物生物工程公司；pET-32a(+)质粒购于美国Novagen公司；RNA提取试剂盒、质粒抽提纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit、限制性核酸内切酶 BamHⅠ、XhoⅠ和 HindⅢ、T4 DNA连接酶购于大连宝生物生物工程公司；引物寡核苷酸片段由上海生工生物工程公司合成；QPCR扩增操作使用Mx 3000P。

一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其具体制备步骤为：

步骤一、pET-MS2重组子的构建

1）根据GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列（NC_001417），设计成熟蛋白和衣壳蛋白融合基因的引物MS2F、P2、P3及MS2R并进行人工合成，序列分别为：

MS2F：5＇-CGGGATCCGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTA-3＇，

P2：5＇-GGAACCTGGAGACTATCTAGAGAGCCGTTGCCTGATT-3＇，

P3：5＇-TCTCCAGGTTCCCCGGAGTTTGAAGCATGGCTTCTAA-3＇，

MS2R：5＇-CCCAAGCTTCAATACATAAAGAGTTGAACTTCTT-3＇，

下划线所指为上下游引物分别引入的BamHI和HindⅢ酶切位点；然后通过重叠剪接PCR的方法扩增出成熟蛋白和衣壳蛋白基因（MS2基因），其碱基序列如 SEQ ID NO：5；重叠剪接PCR具体方法为：首先配制两组反转录反应液，内含有2×RT-PCR Buffer、5U Ex Taq HS酶、RT Enzyme Mix、各10pmol MS2F+ P2及P3+ MS2R引物、RNase Free dH₂O。取MS2噬菌体RNA（采用RNA提取试剂盒按照其说明书进行提取后，加无菌超纯水按照水和RNA的体积比为100: 1进行稀释）5μL作为模板，加入两组反转录反应液中，混匀，进行PCR扩增。反应参数为 50℃ 30min，95℃ 5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 180s，35个循环，72℃ 7min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，得到与预期片段大小（1.2kb及470bp）相符的目的基因（如图1所示）；然后配制反应液，内含有2×RT-PCR Buffer、5U Ex Taq HS酶、各10pmol MS2F及MS2R引物、RNase Free dH₂O。各取5μL纯化后的产物作为模板，加入反应液中，混匀，进行PCR扩增。反应参数为95℃ 5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 2min，35个循环，72℃ 7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，得到与预期片段大小（1700bp）相符的目的基因（如图2所示）；

2）采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切上述步骤 1）所获得的MS2融合基因和质粒 pET-32a(+)，采用胶回收试剂盒纯化后，通过T4 DNA连接酶将两者于16℃连接过夜，得到连接产物；

3）将上述步骤2）所得到的连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布氨苄霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜后挑取单克隆，经菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌落进行扩大培养并提取质粒，获得重组质粒pET-MS2。重组质粒pET-MS2经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，电泳检测出现预期条带（如图3所示）；

步骤二、pET-MS2-HCV重组子的构建

1） 根据GenBank数据库中的HCV病毒5’UTR基因序列（GenBank: KC285356.1），人工合成丙型肝炎病毒HCV基因片段的PCR扩增引物对，序列分别为：

上游引物HCVF：5＇-CCCAAGCTTGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTT-3＇，

下游引物HCVR：5＇-CCGCTCGAGGGGCGGCGGTTGGTGTTACGTTTGG-3＇，

下划线所指为上下游引物分别引入的HindⅢ和XhoI酶切位点；然后通过RT-PCR方法扩增出HCV基因，其碱基序列如SEQ ID NO：8。RT-PCR具体方法为：首先配制反转录反应液，内含有2×RT-PCR Buffer、5U Ex Taq HS酶、RT Enzyme Mix、各10pmol HCVF及HCVR引物、RNase Free dH₂O。取HCV的RNA（采用RNA提取试剂盒按照其说明书进行提取后，加无菌超纯水按照水和RNA的体积比为 100: 1 进行稀释）5μL作为模板，加入上述反转录反应液中，混匀，进行PCR扩增。反应参数为 50℃ 30min，95℃ 5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 180s，35个循环，72℃ 7min。PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，得到与预期片段大小（400bp）相符的目的基因（如图4所示）；

2）HCV基因和pET-MS2 经限制性内切酶 Hind Ⅲ和XhoI双酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收线性化片段，通过T4 连接酶连接获得连接产物；

3）上述步骤 2）所制备的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养过夜，经菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌落进行扩大培养并提取质粒，获得重组子pET-MS2-HCV；

步骤三、诱导表达与纯化

将上述步骤二鉴定正确的含有pET-MS2-HCV重组质粒的阳性菌落，重新涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基平板，挑取单菌落接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中，培养至A_600nm为0.5～1.0时，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/ L，继续培养36h，然后将菌液进行采用超声破碎法裂解出病毒样颗粒物，超声破碎具体步骤为工作时间3s、间歇时间3s、工作频率10%、总时间5min。超声结束后进行12000rpm，4℃离心10min，收集上清。向上清溶液中加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I至终浓度均为1mg/L，37℃水浴作用2h。离心收集上清，即为本发明含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，4℃保存；

步骤四、病毒样颗粒的鉴定实验

1）PCR鉴定实验

取制备的病毒样颗粒悬浮液，进行十倍稀释，一组不经过反转录直接进行PCR反应；另一组样本经反转录后，再进行PCR扩增，电泳检测扩增结果。样本稀释后，其中一组不经过反转录直接进行PCR反应，检测结果均为阴性（图5中第5、6泳道），表明制备病毒样颗粒悬浮液中和病毒样颗粒内，均无DNA污染，模板以RNA形式存在；另一组样本经反转录后，再进行PCR扩增，检测结果为阳性（图5中第1、2泳道），表明HCV5’UTR基因的RNA片段已经成功重组于病毒样颗粒中；

2）病毒样颗粒核糖核酸酶攻击试验

取病毒样颗粒稀释标本各50μL，分成两组。一组直接进行样品处理、反转录和荧光定量PCR扩增。另一组加入1mg/L的核糖核酸酶，室温放置60min后再进行样品处理、反转录和荧光定量PCR检测，比较两组的Ct值，结果如图6所示。两组检测结果基本一致，表明制备的病毒样颗粒能够很好的抵抗DNA及RNA核糖核酸酶的降解；

3）病毒样颗粒稳定性实验

取病毒样颗粒稀释标本，分别于37℃放置5d、10d、15d、20d、25d、30d，然后进行样品处理、反转录和荧光定量PCR检测，比较其Ct值的变化。病毒样颗粒的稳定性实验结果如图7所示，37℃放置不同时间后的Ct值变化趋势表明，制备的病毒样颗粒在37℃至少可以储存30天，稳定性良好。

<110>宝瑞源生物技术（北京）有限公司

 

<120>一种含丙型肝炎病毒 RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法

 

<160>8

 

<210>1 

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>扩增MS2噬菌体的成熟蛋白序列的上游引物序列

 

<400>1

cgggatccgtttgacctgtgcgagcttttagta     33

 

<210>2 

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>扩增MS2噬菌体的成熟蛋白序列的下游融合引物序列

 

<400>2

ggaacctgga gactatctag agagccgttg cctgatt     37

 

<210>3 

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>扩增MS2噬菌体的衣壳蛋白序列的上游融合引物序列

 

<400>3

tctccaggtt ccccggagtt tgaagcatgg cttctaa     37

 

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>扩增MS2噬菌体的衣壳蛋白序列的下游引物序列

 

<400>4

cccaagcttc aatacataaa gagttgaact tctt     34

 

<210>5

<211>1680

<212>DNA

<213>MS2噬菌体（Levivirus）

 

<400>5

gtttgacctg tgcgagcttt tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc   60

gttcgcgttt acgcggacgg tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atatcgttcg    120

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gcacgctcct gctacagcct cttccctgta agccaaaact tgacttacat cgaagtgccg    360

cagaacgttg cgaaccgggc gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt  420

aaccttggtg ttgctttagc agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc  480

attgcgctcg tgaaggcgta cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc  540

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gagttgcagt tcggttggtt accactaatg agtgatatcc agggtgcata tgagatgctt    660

acgaaggttc accttcaaga gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac   720

atcaagttag atggccgtct gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata  780

tcgcgacgta tcgtgatatg gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct   840

ctaggtatct tgaacccact aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc   900

gactggctcc tacctgtagg taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc   960

tacatgtcag gaacagttac tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct  1020

ccctacgggt ggactgtgga gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat  1080

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ccggagtttg aagcatggct tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa  1260

ctggcgacgt gactgtcgcc ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct  1320

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atcgcaaata caccatcaaa gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg  1440

tagagcttcc tgtagccgca tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt  1500

tcgctacgaa ttccgactgc gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg  1560

gaaacccgat tccctcagca atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca  1620

ttcaaacatg aggattaccc atgtcgaaga caacaaagaa gttcaactct ttatgtattg  1680

 

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>扩增HCV的上游引物序列

 

<400>6

cccaagcttg cagaaagcgt ctagccatgg cgtt   34

 

<210>7 

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>扩增HCV的下游引物序列

 

<400>7

CCGCTCGAGG GGCGGCGGTT GGTGTTACGT TTGG   34

 

<210>8

<211>330

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus）

 

<400>8

gcagaaagcg tctagccatg gcgttagtat gagtgtcgtg cagcctccag gaccccccct    60

cccgggagag ccatagtggt ctgcggaacc ggtgagtaca ccggaattgc caggacgacc 120

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Claims (6)

1.一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

(1)pET-MS2重组质粒的构建 

依照GenBank公布的MS2噬菌体的成熟蛋白及衣壳蛋白基因编码区序列（GenBank:NC_001417.2），自主设计重叠剪接PCR扩增MS2噬菌体基因的引物对，将MS2噬菌体编码成熟蛋白的序列与编码衣壳蛋白的序列融合到一条长序列上，

上游引物MS2F：如序列表 Seq ID No:1所示，

融合引物序列P2：如序列表Seq ID No:2所示，

融合引物序列P3：如序列表Seq ID No:3所示，

下游引物 MS2R：如序列表Seq ID No:4所示，

然后通过重叠剪接PCR的方法融合扩增出MS2基因并克隆，如序列表 SEQ ID NO:5所示；

将融合扩增出的MS2基因和质粒pET-32a(+)使用限制性内切酶BamH I和HindⅢ分别双酶切，纯化后进行连接，得到连接产物pET-MS2；将所得到的pET-MS2连接产物通过热激法转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，扩大培养，提取质粒并进行菌液PCR和双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒置于-20℃保存；

(2)pET-MS2-HCV重组质粒的构建

依照GenBank公布的HCV病毒5’UTR编码区序列（GenBank: KC285356.1），自主设计并人工合成丙型肝炎病毒HCV基因片段的PCR扩增引物对，

上游引物HCVF：如序列表SEQ ID NO:6所示，

下游引物HCVR：如序列表SEQ ID NO:7所示，

然后通过PCR的方法扩增出HCV基因，如序列表SEQ ID NO:8所示；

将扩增出的HCV基因和质粒pET-MS2利用限制性内切酶HindⅢ和XhoI分别进行双酶切，纯化后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5α细胞中，提取质粒并进行PCR鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-MS2-HCV；

(3)诱导表达与纯化

将步骤(2)中鉴定正确的重组质粒pET-MS2-HCV的阳性菌落，接种到含氨苄霉素的LB液体培养基中，培养至OD600值为0.5-1.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/ L，继续培养36h，然后采用超声破碎法裂解出病毒样颗粒物，向溶液中加入核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶I至终浓度均为1mg/L，37℃水浴作用2h，离心收集上清，即为本发明含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，4℃保存。

2.如权利要求1所述的一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：所述的融合扩增MS2基因序列包括编码成熟蛋白序列及编码衣壳蛋白序列，可诱导表达出成熟蛋白和衣壳蛋白。

3.如权利要求1所述的一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：所述的HCV基因片段的序列为5’UTR基因序列，HCV 5'末端序列在不同HCV株间高度保守，如序列表SEQ ID NO:8所示。

4.如权利要求1所述的一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒是由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹丙型肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体；很好的模拟了HCV病毒颗粒结构，具有耐核糖核酸酶的特性。

5.如权利要求1所述的含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒可用作丙型肝炎病毒检测试剂盒中的阳性参考品或标准品。

6.如权利要求5所述含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒的用途，其特征在于，所述丙型肝炎病毒检测的阳性参考品包括丙型肝炎病毒检测的PCR阳性参考品、RNA提取阳性参考品及逆转录阳性参考品。