CN106939310A - 一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。其优点是：将P43启动子中核糖体结合位点进行本发明的优化方法，使得优化后的启动子与mRNA的结合水平提高，继而提高了目的基因的表达水平。

Description

一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物工程技术领域，具体地说是一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法。
背景技术
启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，是DNA分子上被RNA聚合酶和转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。启动子的保守结构特征有：-10区、-35区、两个区之间的间隔距离和转录起始位点TSS。两个识别区之间的序列虽然并不保守，但是其间隔距离的保守性对于RNA聚合酶结合时的空间几何构象十分重要。之前研究结果表明，启动子-10位的TATA区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。原核生物中-10区同-35区之间核苷酸数目的变动会影响基因转录活性的高低，强启动子一般为17±1bp，当间距小于15bp或大于20bp时都会降低启动子的活性。同时，-35区共有序列5’-TTGACA-3’跟-10区共有序列5’-TATAAT-3’高度保守，对于大多数启动子来说，-10区与-35区的序列与共有序列的相似程度越高，其启动子的转录强度越高。启动子上与RNA聚合酶核心酶和σ因子互作的功能区域包括-35区、-10区、扩展的-10区(extended-10)、上游增强元件(UP element)和+1区的转录起始位点，一些启动子还存在着与激活蛋白与阻遏蛋白结合的位点。不同启动子表现出的转录效率高低，归根结底在于功能结构序列的不同，如何通过对上述结构的缺失、添加和突变，以得到适用于生产应用和理论研究的理想启动子，使目前亟待解决的问题。
mRNA是生物信息传递链中的重要一环，与蛋白质翻译密切相关，有效的翻译起始决定蛋白质能否顺利进行翻译(Gold 1988)。mRNA的5’端非编码区存在着一个重要的功能元件：核糖体结合位点RBS，也即原核生物中的SD序列。原核生物翻译需要核糖体与核糖体结合位点和起始密码子同时结合，核糖体的16S序列与RBS互补配对，起始转运RNA(tRNA)与起始密码子结合，从而开始翻译蛋白。研究表明mRNA的5’端形成的二级结构对于翻译起始会产生重要影响，如果SD序列和起始密码子位于较稳定的发夹结构中，那么核糖体识别难度会大幅增加，导致翻译起始效率降低，蛋白表达水平下降。
发明内容
为了解决上述技术缺陷，本发明提供一种用于提高产量的启动子及其制备方法，以增强核糖体识别能力，提高翻译起始效率和外源蛋白表达水平。
本发明一方面，提供一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。
本发明第二方面，保护一种通过上述方法获得的启动子。
本发明第三方木，保护一种含第二方面所述启动子的载体。
一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其优点是：将P43启动子中核糖体结合位点进行本发明的优化方法，使得优化后的启动子与mRNA的结合水平提高，继而提高了目的基因的表达水平。
附图说明
图1A、1B为启动子P43转录产物5’端非翻译区二级结构图示
其中图1A是根据文献报导，启动子P43转录出的序列推测在5’端会形成的一个发夹结构(Wang et al 1984)；
图1B为Mfold软件推定的结构；
图2为扩增纳豆激酶载体中表达元件pRBS5NK的琼脂糖凝胶图；
其中，泳道1为来源于枯草芽胞杆菌168中启动子P43经改造过后RBS5的条带(284bp)；泳道2为以对照菌质粒pP43SacCNK为模板扩增出来的纳豆激酶基因条带SacCNK(1629bp)；泳道3为启动子RBS5和纳豆激酶片段SacCNK做SOE-PCR连接的条带
RBS5NK(1913bp)，泳道M为5K DNA marker；
此图证明了纳豆激酶载体中表达元件的扩增均成功；
图3为重组载体转化地衣芽胞杆菌BL10菌落PCR验证图；
其中，泳道1-5为用引物pHY-F/pHY-R进行不同转化子的菌落PCR验证时条带(2184bp)，泳道M为5K marker；
图4为对照菌株地衣芽胞杆菌BL10(pP43SacCNK)和启动子优化后的菌株发酵终点的SDS-PAGE图；
其中，泳道M为Protein molecular weight marker，泳道1为对照菌BL10(pP43SacCNK)的胞外总蛋白浓缩10倍后的发酵上清液样，泳道2～6分别为改造菌BL10(pRBS1NK)，BL10(pRBS2NK)，BL10(pRBS3NK)，BL10(pRBS4NK)，BL10(pRBS5NK)的胞外总蛋白浓缩10倍后的发酵上清液样。
具体实施方式
本发明一方面，提供一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。
优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、将步骤S1扩增出的启动子P43作为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS1-SOE-R，且在设计方向引物时，引物P43RBS1-SOE-R后面5个碱基减掉，并在引物P43RBS1-SOE-R的前面添加TTCAT这5个碱基，通过PCR扩增出启动子RBS1，使得扩增出来的序列后面多出序列ATGAA，其具体序列见序列表SEQ ID NO:2。
或者
优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2，其具体序列见序列表SEQ ID NO:3。
或者
优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2；
以启动子RBS2为模板，利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43RBS3-SOE-R，且在反向引物前面添加5个碱基TTCAT，通过PCR扩增出启动子RBS3，其具体序列见序列表SEQ ID NO:4。
或者
优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS4-SOE-R，将P43茎环结构右侧的序列GAAGATCT删除，RBS结合区GTAAGAGAGG变为GGGATCTGAAG，通过PCR扩增出启动子RBS4，其具体序列见序列表SEQ ID NO:5。
或者
优选地，对所述核糖体结合位点的序列进行优化的方法为：
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S3扩增出的启动子RBS2为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS5-SOE-R，将P43茎环结构的序列去除，保留P43上的RBS，通过PCR扩增出启动子RBS5，其具体序列见序列表为SEQ ID NO:6。
进一步地，上述PCR扩增反应体系、条件分别为：
扩增反应体系均为：5×Fastpfu Buffer 10uL、dNTPs(2mM)5uL、primer F 1uL、primer R 1uL、模板DNA 1uL、Fastpfu酶1uL，ddH2O，所添加的ddH2O使得溶液补至50uL；
扩增反应条件均为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸X min(X值根据具体片段大小而定，一般1kbp片段延伸1min)，30个循环；72℃10min，4℃10min。
本发明第二方面，保护一种通过上述方法获得的启动子。
本发明第三方木，保护一种含第二方面所述启动子的载体。
以下就具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例一：
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43-SOE-R：CTTACCTATAATGGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT
S2、将步骤S1扩增出的启动子P43作为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS1-SOE-R，且在设计方向引物时，引物P43RBS1-SOE-R后面5个碱基减掉，并在引物P43RBS1-SOE-R的前面添加TTCAT这5个碱基，通过PCR扩增出启动子RBS1，使得扩增出来的序列后面多出序列ATGAA，其具体序列见序列表SEQ ID NO:2。
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43RBS1-SOE-R：
CTTACCTATAATGGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT
实施例二
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43-SOE-R：
CTTACCTATAATGGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2，其具体序列见序列表SEQ ID NO:3。
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43RBS2-SOE-R：
CCTCCTTTCCTATAATGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT
实施例三
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43-SOE-R：
CTTACCTATAATGGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2；
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43RBS2-SOE-R：
CCTCCTTTCCTATAATGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT
以启动子RBS2为模板，利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43RBS3-SOE-R，且在反向引物前面添加5个碱基TTCAT，通过PCR扩增出启动子RBS3，其具体序列见序列表SEQ ID NO:4。
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43RBS3-SOE-R：
CCTCCTTTCCTATAATGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT
实施例四
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43-SOE-R：
CTTACCTATAATGGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS4-SOE-R，将P43茎环结构右侧的序列GAAGATCT删除，RBS结合区GTAAGAGAGG变为GGGATCTGAAG，通过PCR扩增出启动子RBS4，其具体序列见序列表SEQ ID NO:5
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43RBS4-R：
AATCAGTCTCTTTTTCATATTACCTCCTCAGATCCCCTATAATGGTACC
实施例五
S1、根据NCBI数据库发布的B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；利用Primer Primier 5软件设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43-SOE-R：CTTACCTATAATGGTACCAGATCTGCTATCACTTTAT；
S2、以步骤S3扩增出的启动子RBS2为模板，利用Primer Primier5软件设计引物P43-F和P43RBS5-SOE-R，将P43茎环结构的序列去除，保留P43上的RBS，通过PCR扩增出启动子RBS5，其具体序列见序列表为SEQ ID NO:6。
设计引物如下：
P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43RBS5-SOE-R：
GATCCTTCCTCCTTTAGATCTGCTATCACTTTAT
上述实施例一至实施例五中的扩增反应体系均为：5×Fastpfu Buffer 10uL、dNTPs(2mM)5uL、primer F 1uL、primer R 1uL、模板DNA 1uL、Fastpfu酶1uL，ddH2O，所添加的ddH2O使得溶液补至50uL；
扩增反应条件均为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸X min(X值根据具体片段大小而定，一般1kbp片段延伸1min)，30个循环；72℃10min，4℃10min。
现有启动子P43转录产物5’端非翻译区二级结构图以及通过上述实施例一至实施例五方法优化后的的启动子发夹结构如图1所示。
实施例六：
对实施例一至实施例五所述方法所制得的RBS1～RBS5功能进行检测
一、设计引物SacC-F和NK-R，以质粒pHYSacCNK为模板，通过PCR扩增出含SacC信号肽序列的纳豆激酶基因序列SacC-NK；
二、基于P43启动子改造的纳豆激酶分泌型表达载体的构建
以商用表达载体pHY300PLK为初始载体构建纳豆激酶高效分泌表达载体，PCR分别出实施例一至实施例五中对应的含SacC信号肽序列的纳豆激酶基因片段SacC-NK和RBS1NK～RBS5NK；
扩增出与启动子P43对应的带SacC信号肽的纳豆激酶序列，所用引物为：
SacCP43-SOE-F：
GAAGATCTGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAGAGACTGATTC
SacCNK-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTG
扩增出与RBS1对应的带SacC信号肽的纳豆激酶序列，所用引物为：
SacCRBS1-SOE-F：
GAAGATCTGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAAATGAAAAAGAGACT
SacCNK-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTG
扩增出与RBS2中对应的带SacC信号肽的纳豆激酶序列，所用引物为：
SacCRBS2-SOE-F：
GAAGATCTGGTACATTATAGGAAAGGAGGAATGTACCATGAAAAAGAGACTGATTCAAG
SacCNK-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTG
扩增出与RBS3对应的带SacC信号肽的纳豆激酶序列，所用引物为：
P43RBS3-R：
GAAGATCTGGTACATTATAGGAAAGGAGGAATGTACCATGAAATGAAAAAGAGACTG
SacCNK-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTG
扩增出与RBS4对应的带SacC信号肽的纳豆激酶序列，所用引物为：
P43RBS4-SOE-R：
GAAGATCTGGTACATTATAGGTAAGGAGGAATGTACAC
SacCNK-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTG
扩增出与RBS5对应的带SacC信号肽的纳豆激酶序列，所用引物为：
P43RBS5-SOE-R：
GAAGATCTAAAGGAGGAAGGATCAATGAAAAAGAGACTGATTCAAG
SacCNK-R：GCTCTAGACGCAATAATGCCGTCGCACTG
将实施例一至实施例五中所述方法所制得的RBS1～RBS5启动子序列和步骤二中制备的含SacC信号肽序列的纳豆激酶基因片段SacC-NK及RBS1～RBS5，通过SOE-PCR方法连接以获得产物P43SacC-NK和RBS1NK～RBS5NK；
所述SOE-PCR方法所用条件为：
SOE-PCR反应条件为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸X min(X值根据具体片段大小定，一般1kbp片段延伸1min)，7个循环(此循环不加引物进行)；72℃5min(在此时间段内加入引物)；95℃30s，55℃30s，72℃延伸X min(X值根据具体片段大小定，一般1kbp片段延伸1min)，30个循环；72℃10min，4℃10min。
再将上述获得的产物P43SacC-NK和RBS1NK～RBS5NK均通过EcoR I/Xba I双酶切(酶切体系为片段80uL，10×M Buffer 10uL，EcoR I 5uL，Xba I 5uL)；混匀后分成20uL一管，37℃酶切3h。将酶切片段产物与同样经过EcoR I/Xba I双酶切的pHY300PLK空质粒酶连，酶连温度为16℃，时间为8h，酶连产物随后转化E.coli DH5α，挑转化子进行菌落PCR验证，将PCR验证正确的转化子挑菌接至含有5mL LB培养基的PA瓶中(50ug/mL氨苄抗生素)，抽质粒并测序，重组质粒分布命名为pRBS1NK～pRBS5NK。(如图2所示)
三、地衣芽胞杆菌基于P43启动子改造的纳豆激酶工程菌株BL10(pRBS1NK)，BL10(pRBS2NK)，BL10(pRBS3NK)，BL10(pRBS4NK)，BL10(pRBS5NK)的构建
将构建好的纳豆激酶表达载体pRBS1NK～pRBS5NK分别电转化至地衣芽胞杆菌BL10中(该菌保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2013400，分类命名为：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL10，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2013年09月10日，且属于存活状态)，具体为：
首先做地衣芽胞杆菌BL10感受态，在平板上活化菌种，然后挑菌至含有5～10mLLB的PA瓶中，30～37℃过夜培养，随后以3～5％的接种量转接至生长培养基中，30～37℃，180～200rpm培养至OD600到0.80～0.90，5500～7000rpm离心6～8min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500～7000rpm离心6～8min，重复三次后加入0.8～1mL洗涤培养基重悬菌体，分装至灭过菌的1.5mL EP管中，每管分装80～100uL，-80℃保存。
再将吹干后的电转杯在冰上预冷10～15min，然后将80～100uL的地衣芽胞杆菌BL10感受态细胞与5～10uL重组载体(分别与pRBS1NK～pRBS5NK)混匀后加入电转杯中，冰上预冷3～5min后，2.1～2.4kV条件下点击，电击时间4.8-5.2ms，随后立即加入500～800uL恢复培养基并转移至1.5mL EP管中。30～37℃，100～110rpm培养3h后涂LB平板(含20ug/mL四环抗生素)。待长出转化子后挑菌进行菌落PCR验证和抽质粒验证，验证正确后保存菌种，且重组菌株分别命名为BL10(pRBS1NK)、BL10(pRBS2NK)、BL10(pRBS3NK)、BL10(pRBS4NK)、BL10(pRBS5NK)。
四、重组载体转化地衣芽胞杆菌BL10菌落PCR验证步骤
待电转化涂抗性平板后，将转化子挑至相同的抗性平板上进行扩大培养，37℃静置培养6h后即可长出，随后将若干转化子分别挑部分至1.5mL EP管(加有30uL的ddH2O)中，沸水浴煮菌10min，然后12000rpm离心2min，上清液作为菌落PCR验证模板待用。
配置菌落PCR体系：ddH2O 7.7uL，dNTPs 5uL，10×EasyTaq Buffer 5uL，pHY-F1uL，pHY-R 1uL，模板10uL，EasyTaq酶1uL；菌落PCR反应条件为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸2.5min(片段大小2184bp左右)，30个循环；72℃10min，4℃10min。
菌落PCR反应结束后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示，泳道1～5为不同转化子菌落PCR验证结果条带(2184bp)，泳道M为5k DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。由图可知，成功获得含重组载体的地衣芽胞杆菌BL10(pRBS5NK)。
五、地衣芽胞杆菌工程菌产纳豆激酶的发酵实验
在平板上活化步骤三获得的菌种，挑菌接至含有50mL液体LB的250mL三角瓶中，37℃，220rpm培养10h，随后以1％的接种量接种至发酵培养基中，37℃，220rpm培养48h。对照菌株为启动子未经改造的纳豆激酶表达菌株BL10(pP43SacCNK)(菌保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2014253，分类命名为：地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL10(pP43SacCNK)，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年06月12日，且属于存活状态)。
所述液体LB配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠，pH7.2-7.4 250mL三角瓶装液量为50mL；
所述发酵培养基为：5-30g/L葡萄糖；1-15g/L大豆蛋白胨；1-15g/L酵母粉；1-15g/L蛋白胨；1-10g/L玉米浆；0.1-10g/L氯化钠；0.1-6g/L硫酸铵；0.1-3g/L磷酸氢二钾；pH7.0-7.2；
所述发酵条件为：发酵温度为37℃，250mL三角瓶中装液量20-50mL，摇床转速150-250r/min，发酵周期48h；
发酵液预处理：取2mL发酵液于2mL EP管中，10000rpm离心5min后上清转移至另外一个2mL EP管中，4℃保存备用。
六、启动子改造对纳豆激酶产量的影响
1、纤维蛋白溶解法测定步骤五经发酵的纳豆激酶的酶活：
样品吸光度AT：向试管中依次加入0.40mL纤维蛋白原溶液(0.72％，w/v)，1.4mLTris-HCl(50mM，pH7.8)，37℃温浴5min，然后加入0.10mL凝血酶溶液(20U/mL)，37℃温浴10min，再加入0.10mL的稀释酶样品，37℃温浴60min，加入2mL三氯乙酸(0.20M)静止20min终止反应，10000rpm离心10min，取上清于275nm比色测定吸光度AT；
对照吸光度AB：向试管中依次加入0.40mL纤维蛋白原溶液(0.72％，w/v)，1.40mLTris-HCl(50mM，pH7.8)，37℃温浴5min，然后加入0.10mL凝血酶溶液(20U/ml)，37℃温浴10min，继续37℃温浴60min，同时加入0.10mL的稀释酶样品和2mL三氯乙酸(0.20M)，10000rpm离心10min，取上清于275nm比色测定吸光度AB作为对照。
1个单位的纤维蛋白降解酶活(FU)相当于每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶量。
纳豆激酶活性(FU/g或者FU/ml)＝(AT－AB)/0.01×1/60×1/0.1×D＝A100/6*D(D：稀释倍数；AT实际的OD275；AB：空白OD275)
通过酶活测定，对照菌BL10(pP43SacCNK)的纳豆激酶酶活是42.95FU/mL，而启动子改造菌BL10(pRBS1NK)的纳豆激酶酶活是46.23FU/mL，BL10(pRBS2NK)的纳豆激酶酶活是44.35FU/mL，BL10(pRBS3NK)的纳豆激酶酶活是15.87FU/mL，BL10(pRBS4NK)的纳豆激酶酶活是28.54FU/mL，BL10(pRBS5NK)的纳豆激酶酶活高达74.31FU/mL。相比较于对照菌BL10(pP43SacCNK)酶活，启动子改造菌BL10(pRBS5NK)的纳豆激酶酶活提高了73％。
2、蛋白胶检测：
样品预处理：在1.5mLEP管中加入900uL发酵液上清，与100uL 100％TCA混匀后，4℃条件下静置过夜，10000rpm离心10min，随后用500uL无水乙醇洗去TCA，重复三次，待乙醇吹干后加入45uL的2M硫脲和8M尿素的混合溶液，与等量的2*SDS-PAGE buffer混匀后沸水浴加热10min，随后上样10uL进行SDS-PAGE检测。
如图4为SDS-PAGE检测结果，根据样品条带的深度及面积，比较启动子改造菌BL10(pRBS1NK)～BL10(pRBS5NK)与对照菌BL10(pP43SacCNK)的相对产量。由图可知，改造菌BL10(pRBS1NK)和BL10(pRBS5NK)分泌的纳豆激酶产量明显高于对照菌BL10(pP43SacCNK)，说明本发明中启动子序列的优化方法可以提高纳豆激酶的分泌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北大学
<120> 一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 300
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌P43启动子
<400> 1
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
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gcgattatgt aaaatataaa gaagatctgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
<210> 2
<211> 305
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌P43启动子优化序列RBS1
<400> 2
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taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
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gcgattatgt aaaatataaa gaagatctgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
atgaa 305
<210> 3
<211> 297
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌P43启动子优化序列RBS2
<400> 3
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
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gcgattatgt aaaatataaa gaagatctgg tacattatag gaaaggagga atgtacc 297
<210> 4
<211> 302
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌P43启动子优化序列RBS3
<400> 4
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
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gcgattatgt aaaatataaa gaagatctgg tacattatag gtaaggagga atgtaccatg 300
aa 302
<210> 5
<211> 291
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌P43启动子优化序列RBS4
<400> 5
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
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gcgattatgt aaaatataaa ggtaccatta taggggatct gaggaggtaa t 291
<210> 6
<211> 284
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌P43启动子优化序列RBS5
<400> 6
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
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Claims (9)

1.一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：S1、具体为将枯草芽胞杆菌中P43启动子的转录起始位点后的核糖体结合位点的序列扩增；S2、再通过引物设计，扩增出带核糖体结合位点序列的P43启动子，以获得具有至少一种结构功能的序列。
2.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：
S1、根据B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、将步骤S1扩增出的启动子P43作为模板，设计引物P43-F和P43RBS1-SOE-R，且在设计方向引物时，引物P43RBS1-SOE-R后面5个碱基减掉，并在引物P43RBS1-SOE-R的前面添加TTCAT这5个碱基，通过PCR扩增出启动子RBS1，使得扩增出来的序列后面多出序列ATGAA，其具体序列见序列表SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：
S1、根据B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2，其具体序列见序列表SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：
S1、根据B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，设计引物P43-F和P43RBS2-SOE-R，将两个碱基C和A从P43颈环结构上去除，并且将RBS结合区由GTAAGAGAGG变为GAAAGGAGG，通过PCR扩增出启动子RBS2；
以启动子RBS2为模板，设计引物P43-F和P43RBS3-SOE-R，且在反向引物前面添加5个碱基TTCAT，通过PCR扩增出启动子RBS3，其具体序列见序列表SEQ ID NO:4。
5.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：
S1、根据B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S1扩增出的启动子P43为模板，设计引物P43-F和P43RBS4-SOE-R，将P43茎环结构右侧的序列GAAGATCT删除，RBS结合区GTAAGAGAGG变为GGGATCTGAAG，通过PCR扩增出启动子RBS4，其具体序列见序列表SEQ ID NO:5。
6.根据权利要求1所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：
S1、根据B.subtilis 168基因组序列NZ_CP010052.1，找到P43原始序列，具体序列见序列表SEQ ID NO:1；设计引物P43-F和P43-SOE-R，以B.subtilis 168总DNA为模板扩增出原始启动子P43；
S2、以步骤S3扩增出的启动子RBS2为模板，设计引物P43-F和P43RBS5-SOE-R，将P43茎环结构的序列去除，保留P43上的RBS，通过PCR扩增出启动子RBS5，其具体序列见序列表为SEQ ID NO:6。
7.根据权利要求1至6任一所述一种基于核糖体结合位点改造的启动子优化方法，其特征在于：
所述方法中PCR扩增反应体系、条件分别为：
扩增反应体系均为：5×Fastpfu Buffer 10uL、dNTPs(2mM)5uL、primer F 1uL、primerR 1uL、模板DNA 1uL、Fastpfu酶1uL，ddH2O，所添加的ddH2O使得溶液补至50uL；
扩增反应条件均为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃延伸X min(X值根据具体片段大小而定，一般1kbp片段延伸1min)，30个循环；72℃10min，4℃10min。
8.保护一种通过权利要求1至6任一所述方法获得的启动子。
9.保护一种含权利要求8中所述启动子的载体。
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