CN112553090B

CN112553090B - 一株高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112553090B
Application number: CN202011452922.8A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 梁宇翔; 解军
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN112553090A

Abstract

本发明涉及一株高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用。本发明的里氏木霉工程菌，是以里氏木霉QM9414为出发菌株，敲除里氏木霉Trclr4基因，构建得到。本发明通过敲除里氏木霉组蛋白H3K9甲基化酶编码基因Trclr4，首次证明了组蛋白H3K9甲基化在里氏木霉合成sorbicillinoids中的重要作用，实现了sorbicillinoids在里氏木霉中的高产。与出发菌株相比，里氏木霉ΔTrclr4工程菌在以纤维素为碳源条件下sorbicillinoids的产量提升了1倍。

Description

一株高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一株高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

次级代谢产物并不是细胞生长所必需的，但是它们往往具备较高的生物学活性，在生物医药和人类健康产业等领域具备潜在的应用价值。其中Sorbicillinoids(通常也被称作黄色色素)是一类由聚酮合酶参与合成的，并且具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌的生物活性的真菌次级代谢产物。到目前为止，已经发现的Sorbicillinoids多达90余种，可由陆地和海洋来源的真菌合成并分泌。基于其结构可主要分为4类，单体的monomericsorbicillinoids，双元的bisorbicillinoids，三元的trisorbicillinoids和杂合的hybrid sorbicillinoids。

里氏木霉作为工业上重要的纤维素酶生产真菌，除具备强大的纤维素酶分泌能力之外，在发酵过程中也可以合成并分泌sorbicillinoids次级代谢产物。近年来，里氏木霉中sorbicillinoids的合成机制逐步进入人们的视野。里氏木霉合成sorbicillinoids的基因簇主要包含两个PKS编码基因(sor1和sor2)，一个MFS家族的转运蛋白编码基因(sor6)、两个转录调控因子编码基因(ypr1和ypr2)以及多个辅助修饰因子编码基因(sor3和sor4)。其中，转录因子YPR1在sorbicillinoids合成过程中起到中心调控作用。此外，有大量的研究表明，表观遗传调控在真菌次级代谢产物的合成中发挥重要的作用。组蛋白H3K9甲基化是真核生物中基因沉默的重要分子标志。然而，H3K9甲基化修饰对里氏木霉合成Sorbicillinoids的影响目前还不是很清楚，其在里氏木霉Sorbicillinoids合成机制中的研究还没有被报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用，本发明构建的里氏木霉ΔTrclr4工程菌能够显著提高sorbicillinoids的产量，sorbicillinoids的产量是出发菌的2倍左右。

术语说明：

sorbicillinoids：是指一类由聚酮合酶(PKS)合成的、具抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌活性的一类次级代谢产物的总称。

本发明的技术方案如下：

一株高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌，是以里氏木霉QM9414为出发菌株，敲除里氏木霉Trclr4基因，构建得到。

根据本发明优选的，所述里氏木霉工程菌sorbicillinoids的合成量是出发菌株的2倍。

上述高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，经PCR扩增得到Trclr4基因上下游同源臂序列；

(2)以pDonor-pyr4质粒为出发质粒，将步骤(1)得到的Trclr4基因上下游同源臂序列经BP克隆连入pDonor-pyr4质粒，构建Trclr4基因敲除质粒pDonor-pyr4-ΔTrclr4；

(3)将步骤(2)得到的Trclr4基因敲除载体pDonor-pyr4-ΔTrclr4线性化后，转化里氏木霉QM9414-Δpyr4原生质体，经再生、筛选及验证，得高产sorbicillinoids的里氏木霉ΔTrclr4工程菌。

优选的，步骤(1)中所述上游同源臂序列的长度为2040bp，PCR扩增引物序列如下：

clr4-up-F：5′-TAGGGATAACAGGGTAATCGATGGCCCAGCGTAGAA-3′，

clr4-up-R：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAATAACCTCCTGAATCAGTCGTA-3′，

所述下游同源臂序列的长度为2063bp，PCR扩增引物序列如下：

clr4-down-F：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAAACCGCATCATCCAAC-3′，

clr4-down-R：5′-ATTACCCTGTTATCCCTATCATGGCTGGCCTGATTT-3′。

优选的，步骤(2)中所述pDonor-pyr4质粒是将筛选标记基因pyr4插入到pDonor质粒中构建得到。

优选的，步骤(2)中所述基因敲除质粒pDonor-pyr4-ΔTrclr4中Trclr4基因上下游同源臂序列分别位于pyr4基因的两侧。

优选的，步骤(3)所述再生和筛选是在不含有尿苷的条件下进行。

优选的，步骤(3)中所述验证是以筛选的转化子基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证及内部基因验证；

其中，用于验证上游同源臂序列锚定的引物序列如下：

Vclr4-up-F:5′-GCCGGTTGATGTGCTGGTC-3′，

Vclr4-up-R:5′-GGTAGGGAAGTGGTTAGGAAAGG-3′，

用于验证下游同源臂序列锚定的引物序列如下：

Vclr4-down-F：5′-TTTTGAGACACGGGCCAGAGCT-3′，

Vclr4-down-R：5′-TTGGTTCTCACTCTGATGTGAT-3′，

用于验证内部基因的引物序列如下：

Vclr4-in-F：5′-TCCATCTCATAAGAACCCTCAA-3′，

Vclr4-in-R：5′-ATTCACTACCTCGGAAACCC-3′。

上述里氏木霉工程菌在生产sorbicillinoids中的应用。

根据本发明优选的，所述应用的步骤如下：

将里氏木霉ΔTrclr4工程菌接种于以1％(v/v)甘油为碳源的MA培养基进行预培养，在30±2℃，180-220rpm培养40-50h，收集菌丝；然后转入以1％(w/v，g/mL)纤维素为碳源的发酵培养基，30±2℃，180-220rpm继续培养生产sorbicillinoids。

优选的，所述MA培养基组分如下：17.907g/L Na₂HPO₄·12H₂O,2g/L KH₂PO₄,1.4g/L(NH4)₂SO₄,0.3g/L尿素,0.5mL/L吐温-80,用无水柠檬酸调pH至5.0；预培养时添加1％(v/v)甘油为碳源，并添加2g/L的蛋白胨；

所述发酵培养基为MA培养基，并在发酵时添加1％(w/v，g/mL)纤维素为碳源，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO₄,0.4g/L CaCl₂,5.0mg/L FeSO₄·7H₂O,2.0mg/L CoCl₂·2H₂O,1.6mg/L MnSO₄·H₂O,1.4mg/L ZnSO₄·7H₂O。

上述未详细说明的步骤均按照本领域常规操作进行。

本发明的技术特点及有益效果：

1、本发明中里氏木霉Trclr4基因编码真核生物组蛋白H3K9甲基化酶，包含302个氨基酸残基。本发明通过敲除里氏木霉组蛋白H3K9甲基化酶编码基因Trclr4，首次证明了组蛋白H3K9甲基化在里氏木霉合成sorbicillinoids中的重要作用，实现了sorbicillinoids在里氏木霉中的高产。本发明基于同源重组介导的基因敲除原理，通过构建Trclr4基因敲除菌株，实现了sorbicillinoids的高水平生产。与出发菌株相比，里氏木霉ΔTrclr4工程菌在以纤维素为碳源条件下sorbicillinoids的产量提升了1倍左右。

2、本发明以pyr4为筛选标记基因，所获得的里氏木霉ΔTrclr4工程菌株遗传性状稳定，有助于其生产的sorbicillinoids次级代谢产物在生物医药及人类健康产业等领域的应用。

附图说明

图1为Trclr4基因敲除原理图；

图2为里氏木霉ΔTrclr4工程菌阳性转化子基因组PCR验证原理图；

图3为里氏木霉ΔTrclr4工程菌阳性转化子基因组PCR验证电泳图；图中，A为上游同源臂序列锚定验证电泳图，NC为阴性对照(里氏木霉QM9414)；B为下游同源臂序列锚定验证电泳图，NC为阴性对照(里氏木霉QM9414)；C为内部基因验证电泳图，PC为阳性对照(里氏木霉QM9414)；三张图中的1和2泳道均为阳性转化子；

图4为里氏木霉QM9414和里氏木霉ΔTrclr4工程菌在发酵36h时sorbicillinoids合成相关基因ypr1、ypr2、sor1、sor2、sor3、sor4和sor6的转录分析柱状图；

图5为里氏木霉QM9414和里氏木霉ΔTrclr4工程菌发酵液中粗sorbicillinoids产量分析图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的扩增引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例中的里氏木霉QM9414为现有菌种，可购自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)，菌种保藏号：26921。

pDonor-pyr4载体是将pyr4插入到pDonor载体中构建得到，构建方法可参照文献：Two major facilitator superfamilysugar transporters from Trichoderma reeseiand their roles ininduction of cellulase biosynthesis。

里氏木霉QM9414-Δpyr4是将里氏木霉QM9414中的pyr4基因敲除后得到的。

实施例1：里氏木霉ΔTrclr4工程菌的构建

1、pDonor-pyr4-ΔTrclr4基因敲除载体构建

1)根据里氏木霉基因组DNA序列设计Trclr4基因(SEQ ID NO.1)上下游同源臂的扩增引物，上游同源臂扩增引物为clr4-up-F和clr4-up-R，下游同源臂扩增引物为clr4-down-F和clr4-down-R；其中，所述clr4-up-F、clr4-up-R、clr4-down-F和clr4-down-R的引物序列如下：

clr4-up-F：5′-TAGGGATAACAGGGTAATCGATGGCCCAGCGTAGAA-3′，

clr4-up-R：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAATAACCTCCTGAATCAGTCGTA-3′，

clr4-down-F：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAAACCGCATCATCCAAC-3′，

clr4-down-R：5′-ATTACCCTGTTATCCCTATCATGGCTGGCCTGATTT-3′；

2)提取里氏木霉QM9414的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以clr4-up-F和clr4-up-R为上下游引物，经PCR扩增得到Trclr4基因上游同源臂片段(SEQ ID NO.2)，大小为2040bp；以clr4-down-F和clr4-down-R为上下游引物，经PCR扩增得到Trclr4基因下游同源臂片段(SEQ ID NO.3)，大小为2063bp，并采用BP克隆方式连入pDonor-pyr4载体，上游同源臂片段位于pyr4基因表达盒的左侧，下游同源臂片段位于pyr4基因表达盒的的右侧，构建Trclr4基因敲除载体pDonor-pyr4-ΔTrclr4。

其中，提取里氏木霉QM9414的基因组DNA方法参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.^TMFungal DNA Mini Kit，OMEGA)说明书进行。

上述PCR扩增体系为：10μM上游引物4μL，10μM下游引物4μL，基因组DNA 10ng，2.5mM dNTP混合物10μL，5×TransStart FastPfu缓冲液20μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH₂O补足至100μL；

上述PCR扩增程序如下：95℃预变性10min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。PCR完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并回收DNA片段。

2、里氏木霉ΔTrclr4工程菌的构建

1)将构建好的Trclr4基因敲除载体pDonor-pyr4-ΔTrclr4，使用I-SceI限制性内切酶线性化，纯化回收后备用；

2)取500μL里氏木霉QM9414-Δpyr4孢子接种于100mL基本培养基中，30℃、200rpm培养16～20h；收集菌丝培养物使用G1漏斗过滤，用无菌的双蒸水洗涤两次，加入8mL SK细胞壁裂解缓冲液，同时加入0.8g溶壁酶和0.8g蜗牛酶，30℃、200rpm酶解2.5～3h；使用G2漏斗过滤细胞裂解液，4℃，4000rpm离心10min收集原生质体，收集到的原生质体用4mL预冷的STC溶液洗涤两次，然后加入预冷的STC溶液重悬，使原生质体浓度约为5×10⁸个/mL，置于冰上备用；

其中，所述基本培养基的组分如下：葡萄糖20g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、KH₂PO₄ 15g/L、蛋白胨10g/L，用NaOH调pH至5.5，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO₄,0.4g/L CaCl₂,5.0mg/L FeSO₄·7H₂O,2.0mg/L CoCl₂·2H₂O,1.6mg/L MnSO₄·H₂O,1.4mg/L ZnSO₄·7H₂O，10mM尿苷；

所述SK细胞壁裂解缓冲液组分如下：1M山梨醇，10mM K₃PO₄；

所述STC溶液的组分如下：1M山梨醇，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH 7.5；

3)取约10μg线性化的Trclr4基因敲除载体pDonor-pyr4-ΔTrclr4、100μL里氏木霉QM9414-Δpyr4原生质体和25μL PTC溶液加入到10mL离心管底部，混匀后冰浴20min，加入1mL PTC溶液，室温放置5min，再加入2mL STC溶液混匀，得转化液；将所得的转化液涂布于不含有尿苷的再生培养基平板上，30℃培养5～7d；

其中，所述PTC溶液的组分如下：60％(w/v，g/mL)聚乙二醇4000，10mM Tris-HCl，50mM CaCl₂，pH 7.5；

所述再生培养基的组分如下：葡萄糖20g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、KH₂PO₄ 15g/L、1M山梨糖醇、1.5％(w/v，g/mL)琼脂A，用NaOH调pH至5.5，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO₄,0.4g/L CaCl₂,5.0mg/L FeSO₄·7H₂O,2.0mg/L CoCl₂·2H₂O,1.6mg/L MnSO₄·H₂O,1.4mg/LZnSO₄·7H₂O；

4)待长出菌落后，将再生培养基平板上长出的菌落转接到不含有尿苷的筛选培养基平板上，30℃培养2d；然后挑选生产较好的菌落于MEA培养基上生孢，30℃培养5～7d；

其中，所述筛选培养基组分如下：葡萄糖20g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、KH₂PO₄ 15g/L、1.5％(w/v，g/mL)琼脂A，用NaOH调pH至5.5，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO₄,0.4g/LCaCl₂,5.0mg/L FeSO₄·7H₂O,2.0mg/L CoCl₂·2H₂O,1.6mg/L MnSO₄·H₂O,1.4mg/L ZnSO₄·7H₂O；

所述MEA培养基组分如下：麦芽提取物30g/L，蛋白胨5g/L、1.5％(w/v，g/mL)琼脂A；

5)收集孢子后用无菌水稀释涂布于筛选培养基分选单孢；分单孢时需加入0.1％(v/v)Triton X-100；提取分单孢获得的转化子基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证，验证阳性转化子；然后采用单孢分离的方法对阳性转化子进行纯化，采用PCR技术通过扩增内部基因进行阳性纯合子验证，构建得到里氏木霉ΔTrclr4工程菌；

其中，上述PCR的具体反应体系和反应条件参见GenStar2×Taq PCR StarMix说明书。

用于验证上游同源臂序列锚定的引物为Vclr4-up-F和Vclr4-up-R，用于验证下游同源臂序列锚定的引物为Vclr4-down-F和Vclr4-down-R，引物序列如下：

Vclr4-up-F:5′-GCCGGTTGATGTGCTGGTC-3′，

Vclr4-up-R:5′-GGTAGGGAAGTGGTTAGGAAAGG-3′，

Vclr4-down-F：5′-TTTTGAGACACGGGCCAGAGCT-3′，

Vclr4-down-R：5′-TTGGTTCTCACTCTGATGTGAT-3′，

用于验证内部基因的引物序列如下：

Vclr4-in-F：5′-TCCATCTCATAAGAACCCTCAA-3′，

Vclr4-in-R：5′-ATTCACTACCTCGGAAACCC-3′。

里氏木霉Trclr4基因敲除原理如图1所示，将Trclr4基因敲除载体pDonor-pyr4-ΔTrclr4经线性化后转入里氏木霉原生质体中，基于DNA同源重组机制实现Trclr4基因的敲除，构建里氏木霉ΔTrclr4工程菌。

验证原理如图2所示，验证结果如图3所示，在上下游同源臂序列锚定验证中，对照菌株QM9414无目的条带，阳性转化子在上下游同源臂序列验证中均有一条明亮的目的条带，条带大小约为2.5kb；在内部基因的验证中，对照菌株QM9414有一条明亮的目的条带，条带大小约为1.5kb，阳性转化子无目的条带，说明里氏木霉ΔTrclr4工程菌构建成功。

实施例2：里氏木霉ΔTrclr4工程菌中参与sorbicillinoids合成主要基因转录水平分析和sorbicillinoids分泌水平分析

1、使用qRT-PCR方法分析里氏木霉ΔTrclr4工程菌中ypr1、ypr2、sor1、sor2、sor3、sor4和sor6的基因转录水平，步骤如下：

1)将对照菌株QM9414和构建的里氏木霉ΔTrclr4工程菌接种于以1％(v/v)甘油为碳源的MA培养基进行预培养，在30℃，200rpm培养48h；收集菌丝，然后转入以1％(w/v，g/mL)微晶纤维素为碳源的发酵培养基，30℃、200rpm继续培养；

其中，所述MA培养基组分如下：17.907g/L Na₂HPO₄·12H₂O,2g/L KH₂PO₄,1.4g/L(NH4)₂SO₄,0.3g/L尿素,0.5ml/L吐温-80,用无水柠檬酸调pH至5.0；预培养时添加1％(v/v)甘油为碳源，并添加2g/L的蛋白胨；发酵时添加1％(w/v，g/mL)微晶纤维素为碳源，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO₄,0.4g/L CaCl₂,5.0mg/L FeSO₄·7H₂O,2.0mg/L CoCl₂·2H₂O,1.6mg/L MnSO₄·H₂O,1.4mg/L ZnSO₄·7H₂O，即为发酵培养基；

2)每隔12h收集发酵液，同时在培养36h时收集菌丝，菌丝用于提取RNA分析ypr1、ypr2、sor1、sor2、sor3、sor4和sor6基因的转录水平，发酵液用于测定sorbicillinoids的合成量；

3)使用TRizol试剂(上海生工)提取样品中的总RNA，用TaKaRa的PrimeScript^TM RTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒对RNA进行反转录，方法参照说明书；使用获得的反转录产物进行qRT-PCR扩增，按照TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒进行qRT-PCR分析，actin基因作为内参基因，实验程序参照说明书；

其中，内参基因actin的qRT-PCR引物如下：

actin-F：5′-TGAGAGCGGTGGTATCCACG-3′，

actin-R：5′-GGTACCACCAGACATGACAATGTTG-3′，

其中，ypr1、ypr2、sor1、sor2、sor3、sor4和sor6基因的qRT-PCR引物如下：

ypr1-qF：5′-GTTCTACACACGACTTCCCATG-3′，

ypr1-qR：5′-CCAGCCACTGATGTCGTATCC-3′，

ypr2-qF:GCTGCTTGAACAAATGGGAG，

ypr2-qR：GCACATTCTTGGAGGAGTCG，

sor1-qF：5′-GGCCTTTGTTCTTCATGACTCC-3′，

sor1-qR：5′-GTGAGCCAAGGCATCTTCG-3′，

sor2-qF：5′-AGCTACTCAACAACGTGACGC-3′，

sor2-qR：5′-ATCCCACTGCTGCTCAGGTAC-3′，

sor3-qF：5′-CTTCGTCTTGAGTGTTCCTCTG-3′，

sor3-qR：5′-GGCAGCAACGATATAAGCGAG-3′，

sor4-qF：5′-CCTGGTAGTGAGAAACACGG-3′，

sor4-qR：5′-GGCCAACAGTCGGACATATC-3′，

sor6-qF：5′-GTCTACATGTTCCTGGGAGCC-3′，

sor6-qR：5′-CAATGCTAACAGCCCAGTGG-3′。

结果如图4所示，培养36h以后，里氏木霉ΔTrclr4工程菌的ypr1、ypr2、sor1、sor2、sor3、sor4和sor6的基因的转录水平分别为对照菌株QM9414的4.5倍、1.4倍、3.1倍、5.6倍、1.9倍、1.7倍、2.1倍，说明敲除ΔTrclr4基因后，里氏木霉ΔTrclr4工程菌株中sorbicillinoids合成相关基因的转录水平显著提高。

2、通过测定发酵液在370nm条件下的OD值，并通过标准曲线表征sorbicillinoids次级代谢产物的合成量，具体步骤如下：取200μL发酵液于96孔板中，每组设置三个重复，在酶标仪中测量370nm条件下OD值，然后根据标准曲线进行数据分析，结果如图5所示。里氏木霉ΔTrclr4工程菌中sorbicillinoids的合成提前，在培养12h时就有sorbicillinoids合成。在培养36h时里氏木霉ΔTrclr4工程菌sorbicillinoids的产量达到最大值。与对照菌株QM9414相比，里氏木霉ΔTrclr4工程菌胞外发酵液中sorbicillinoids产量提升了1倍，说明Trclr4基因的敲除可导致里氏木霉sorbicillinoids产量的提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 山西医科大学

<120> 一株高产sorbicillinoids的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 909

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 1

atggaggccg tcacgagaca gcactttttc ttccacgacc agccgctccg cgcctttccc 60

gcgcacaaga ccatccccgt caccatcgtc aacgaggtcg accaggccgt catcccgccc 120

aacttccgct tcgtcgaccg catggtcctg cgccgcggcg tcgagcccgc tgaggatagc 180

ttccgcagcg gctgctcgtg cgagtccgac gacgcgtgcc agtacacggg ctgcctgacg 240

aagagaaagg cgtacgcgta tcactcgcac ggggccaagg cgggcctgct gcgctccaag 300

atgctcaact ccaaggagcc gctgtacgaa tgccatgccg gctgctcgtg ctccatgagc 360

tgccccaacc gggttgtcga gcgagggcga accgtgccgc tgcagatatt ccgcaccccc 420

gataggggct ggggagtaca cgcccaggcg gccatcaaaa agggccagtt cgtcgaccgc 480

tactacggcg aaatcatcac ctcggccgag gccgaccgcc ggcgcaccgc cgccgccttc 540

tcccagcgca aggacgtcta cctcttcgcc ctcgacaagt tcaccgaccc ggactcgctg 600

gacgcgcgcc tccggggccc gccgctcgag gtcgacggcg agttccagtc gggcccgacg 660

cgcttcatca accactcgtg cgagcccaac ctgcgcatct ttgcgcgcgt cggcgaccac 720

gccgacaagc acattcacga cctggcgctc tttgccatca gggacattcc caggggggag 780

gagctgacgt ttgattacgt cgacggggtg atgacggggg acttggccgg gatggaggag 840

caggaggcgc atggcgagat ggccaagtgt ttgtgcggga gccgcaagtg caggggatat 900

ctgtggtga 909

<210> 2

<211> 2040

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

cgatggccca gcgtagaagc cggcgggccg ctggagagga tgccctcggg caggctcagc 60

ggcggcgggt tgccggcgcg cgaggaggca tcgggggcgc ctccgggata cggcgagttg 120

gggcccgcgg aacgggagaa gcagcagccc tgccgagcgc atcgtcagca tgtgcattgc 180

ataggagagg tgaagaagaa gtagcgcacc atgatgtcgc cgcctttgtc taggtatgca 240

agcaatggag ggatccggtt cttcgactgt cagatgtcgg gcctcagctg gtgggcagaa 300

cggcagcgct tcgcaacgag acggcgacca aacgccatgc caggtctggc tgcagatgcc 360

agaacagaac acgcgcgaga gaacaaagga agttgttgcg ctgggagaga gaaggcctgg 420

aagaagctgg ggcgttgaga ggacggtcaa ggtggcgctg cggatccgcg gtgcgtgcag 480

tctctctcga gctcgccgcc gtctgttggc cggttttcct ttgcttgccg agctgccgtc 540

gagaacaaga ggctccaggc tgagttgggt gaaggcaaat gaatggcaag gcgatttggg 600

gttggtttcg caggtccgac agacaggcag acagacagac agacagacag acagacagac 660

agctggctgg ccggaagctg gccgggaagc tggtcgggaa gcggcgccgc tgactggcgc 720

gcgccccagc gcaaacagtg tgtggctgtg gagggaagag agagaaaacg aggcttatct 780

tggtgcggtt ctggcttgga tgtcgcgccg aagtgtgttg aaaggcgtat tatctactat 840

gtcgaggatg gggagggccg gggttcgggg gaactgagga ggaggcccaa gtccggttgg 900

ttggttggct gcgtattgag tgagctgaag gagatgggga tcaagctcgg cagatggcga 960

tggtagtatt ggatactgac tgagatgatg gatgagcagt gtcttgtctg ctggagtcaa 1020

ctgtagtctg aagacaacga cgagactgga tgcaagagaa agaggggaga ctcttgcaca 1080

cgcattgcaa gaggaggaga gagtgtccgt catttggcca tttacacgtg ctcgtcagct 1140

gcagcaaacg agggccgaca gatgcatgca tggaagcaat ggaagcgaac cgtttgtcag 1200

tcagcccggt tatgttggaa agcttaaggt gagacctcgc taaggtagag ttacagcggg 1260

ggctgcaggc agagcccact gaagagagcc cgctaaaagc actgaagctc cagggaaccc 1320

gtggggagat ggcgcgttta atggcgctgc agattcagtg gattggatca atggattcca 1380

tggttggtgg atggatgatg cttctagccc gagtggcggc gacgagaagc ctctggtgct 1440

gtgtaaactg cgtccgtttg taatcatgct tcgggctgtg caggaatgga attgtgtgcg 1500

gaatctctcc tgtctggatg cccacgttga gctggttgta gtagtattat ctcgtgttta 1560

gagagtgctg tttgagtgct gcatctacct acataagacg gggtactcgt attgcctaaa 1620

tcatgaagtc tagtagtagg tagtttacac atcctcacct cacaaagctt cctgttgatt 1680

tgattaaggc gtctgcatgt gcacagctgg ctagatcgat attcagcaat agattacaca 1740

ttcatgtaca gatcaactac agacaagcaa gagaagtgca ccactttagt ctggttacaa 1800

gttgccaccg atggttacct ggtatactca cagctccagg gtaggtgcct gtatcaagtt 1860

gcccgaaaac accggccatc tgccaggttt tgcgcgttgt ggccatctca ttcatatctg 1920

cttcattctc ataacgcgtc ctggctcagt gctgttacta ccgttctgcc tcgtacttta 1980

atttgataca atttcaccat tgaacagcca tttatcttta cgactgattc aggaggttat 2040

<210> 3

<211> 2063

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 3

caaaccgcat catccaaccc ccccctctct cctctctttt cttaccctga cgtgcaattc 60

acctcgcttg ggaaactaca aacaggcggc attacatccc gttacatcac atcgtctttg 120

tttgcagcca gtccacagct ttcagagaag ctttactgtc gccacgaact tgcacaaaaa 180

gcgcacagct tccggatccg gtccccgtca tgtccacgcc cgccccccct cgacgtggcg 240

gctcctacag atgttataaa gcaagctagg tagatgaagc atcacgaact cccggacagg 300

atatacactt ttacgccacg ctcctactgg tcttgaaacc tacctcgtct caagcgctcc 360

tccatcatgg tcaactatca cagcgactgc acctcctctt cccccccgag ccccgtgcgc 420

ctcaccctcc gccgccgcga ccgcgacgag cgccgtcgcc aagcagagca cttcgcccag 480

ggccggcccc ggccctcgca caccctctgc ggcaacgaca gctgtctgct gcgctgctgc 540

aacgtctacg ccacgagtcc gcgcttcctg cccgtgttcc tgctgggcga cagcgagcgc 600

agcgcagacg gggttccggt aagggacatc tggacggact ttgcctattt ggcgagcacg 660

cggatgtggc ccttcccgga gaaggggagg aagaatggtg ataagaacaa gaagaggaag 720

cagagcgagg cgctgctcag ggcgcagtcc atcgaggcgt ttgccgcgtc gccgccggtg 780

agggcggcgt atctcgactt caggggcctc tgcgaaaaga acaacctgag cttcacggcg 840

gagtcacggc tccgggacat gctctctgcc gcaatgccat ccttttgcga cgtcctcgcg 900

tcactagacg cagcaacagc agcagcagca gcagcagcaa aatccgacga catgccagcg 960

tacactgagc agctcgtcca ctgcacgctg caaggctgcc cgccgcaaca gcagcagcag 1020

cagcagccca accatcagat gctgctgctg cagcacccgg gggacaagca gccattcccg 1080

tggacgcacg aggcctgcat catgcgcttc ctgctgacga ccgagctgtg gcgacgacac 1140

gacgggcgac acatgcgccg gcgcggatgg gcgtggggag ggcgctggag agtggcggag 1200

atgctgtcgg gggtgctgct gcagtattgg ctgatggatc gggagaggtg ctttgagcgg 1260

gtgtcgtgtc gcggagggga gcagtgtgat gaagtttggc aggattgggt ggacaagtat 1320

ccgctgctgg gggaggacga tgatgatggt gatgatgatg atgatggtgg tgaggaggat 1380

gagcaggagg aacaagagga ggaggaggag aaggaagaag aggaagagga gagtaatagt 1440

agggcagtca agagccctga gctggtgccc aagccgctcg ggctcatcaa ggggctggat 1500

ctggacaagg acgtgggata cgttggcggc gttgggacgg cgcatagggg gccgttatgg 1560

atcgaggggc ggcagaggca tggcgtcgag gggctgccgc agcattgacc cctgaaagag 1620

agagagagaa gtactatgag agtcattcac attgtgagtt ccttttcctt ttcctggtga 1680

gtgatgctgt catgaacgaa gctgtcttcg gctatgagga agttttgttg atgggacgcc 1740

cggttgcggc aaagttcggg agtcggcaat tgacggccct ggctcgaaat taacattatc 1800

aaggtaataa tccacatcac aagcaaacaa gatggaaaaa aagcaaaaga aaacaataga 1860

aactattaca aaaggaaaaa aaaaaaaaag aaagagaagt ttgcaaatcc gattacacag 1920

cttagacact gctagaattc atcacacaca cacaagagga ggggagaaaa gggggtatgt 1980

caagtgtgtg tgtgtgtgag tgagtgtgtg taatagtcac acgattgttg tcgcatcgcc 2040

agccgaaatc aggccagcca tga 2063

Claims

1.里氏木霉工程菌在生产sorbicillinoids中的应用，所述里氏木霉工程菌是以里氏木霉QM9414为出发菌株，敲除里氏木霉Trclr4基因，构建得到；所述里氏木霉Trclr4基因编码真核生物组蛋白H3K9甲基化酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述里氏木霉工程菌sorbicillinoids的合成量是出发菌株的2倍。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述里氏木霉工程菌的构建方法如下：

（1）以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，经PCR扩增得到Trclr4基因上下游同源臂序列；

（2）以pDonor-pyr4质粒为出发质粒，将步骤（1）得到的Trclr4基因上下游同源臂序列经BP克隆连入pDonor-pyr4质粒，构建Trclr4基因敲除质粒pDonor-pyr4-ΔTrclr4；

（3）将步骤（2）得到的Trclr4基因敲除载体pDonor-pyr4-ΔTrclr4线性化后，转化里氏木霉QM9414-Δpyr4原生质体，经再生、筛选及验证，得高产sorbicillinoids的里氏木霉ΔTrclr4工程菌。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述上游同源臂序列的长度为2040 bp，PCR扩增引物序列如下：

clr4-up-F：5′-TAGGGATAACAGGGTAATCGATGGCCCAGCGTAGAA-3′，

clr4-up-R：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAATAACCTCCTGAATCAGTCGTA-3′，

所述下游同源臂序列的长度为2063 bp，PCR扩增引物序列如下：

clr4-down-F：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAAACCGCATCATCCAAC-3′，

clr4-down-R：5′-ATTACCCTGTTATCCCTATCATGGCTGGCCTGATTT-3′。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述pDonor-pyr4质粒是将筛选标记基因pyr4插入到pDonor质粒中构建得到。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述基因敲除质粒pDonor-pyr4-ΔTrclr4中Trclr4基因上下游同源臂序列分别位于pyr4基因的两侧。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述再生和筛选是在不含有尿苷的条件下进行。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中所述验证是以筛选的转化子基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证及内部基因验证；

其中，用于验证上游同源臂序列锚定的引物序列如下：

Vclr4-up-F:5′- GCCGGTTGATGTGCTGGTC-3′，

Vclr4-up-R:5′- GGTAGGGAAGTGGTTAGGAAAGG-3′，

用于验证下游同源臂序列锚定的引物序列如下：

Vclr4-down-F：5′- TTTTGAGACACGGGCCAGAGCT-3′，

Vclr4-down-R：5′- TTGGTTCTCACTCTGATGTGAT-3′，

用于验证内部基因的引物序列如下，所述内部基因为里氏木霉Trclr4基因：

Vclr4-in-F：5′- TCCATCTCATAAGAACCCTCAA-3′，

Vclr4-in-R：5′- ATTCACTACCTCGGAAACCC-3′。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：

将里氏木霉工程菌接种于以1%（v/v）甘油为碳源的MA培养基进行预培养，在30±2℃，180-220 rpm培养40-50 h，收集菌丝；然后转入以1%（w/v，g/mL）纤维素为碳源的发酵培养基，30±2℃，180-220 rpm继续培养生产sorbicillinoids；

所述MA培养基组分如下：17.907 g/L Na₂HPO₄·12H₂O, 2 g/L KH₂PO₄, 1.4 g/L(NH4)₂SO₄, 0.3 g/L尿素, 0.5 mL/L 吐温-80, 用无水柠檬酸调pH至5.0；预培养时添加1%（v/v）甘油为碳源，并添加2 g/L的蛋白胨；使用前加入终浓度为0.6 g/L MgSO₄, 0.4 g/LCaCl₂, 5.0 mg/L FeSO₄·7H₂O, 2.0 mg/L CoCl₂·2H₂O, 1.6 mg/L MnSO₄·H₂O, 1.4 mg/L ZnSO₄·7H₂O。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为MA培养基，并在发酵时添加1%（w/v，g/mL）纤维素为碳源，使用前加入终浓度为0.6 g/L MgSO₄, 0.4 g/L CaCl₂, 5.0mg/L FeSO₄·7H₂O, 2.0 mg/L CoCl₂·2H₂O, 1.6 mg/L MnSO₄·H₂O, 1.4 mg/L ZnSO₄·7H₂O。