CN112921041B - 一种斑玉蕈强启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种斑玉蕈强启动子及其应用，其中，所述启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明选择并设计的HmGPD启动子高效地驱动外源基因在斑玉蕈中表达，为通过遗传方法改良符合生产需求和消费者喜爱的斑玉蕈新品种奠定基础，具有良好的市场应用前景。

Description

一种斑玉蕈强启动子及其应用
技术领域
本发明属于启动子技术领域，具体涉及一种斑玉蕈强启动子及其应用。
背景技术
斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)又名蟹味菇、鸿喜菇或海鲜菇等，在分类学上隶属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)、离褶伞科(Lyophyllaceae)、玉蕈属(Hypsizipus Singer)。斑玉蕈自二十世纪八十年代引入我国开始栽培后，已经从栽培条件、栽培原料、药理作用和营养价值等多方面展开研究。通过现代遗传学方法改良品种是斑玉蕈产业发展的迫切需求，而分子生物学工具的缺乏是斑玉蕈遗传研究中的瓶颈。启动子作为控制基因转录的重要顺式元件，在基因表达中起着至关重要的作用，在遗传转化实验中选择合适的启动子是提高外源基因表达水平的关键。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD)是糖酵解途径中的关键酶之一，催化NADH依赖性的二羟丙酮磷酸转化为甘油-3磷酸。由于功能保守，GPD基因在人类、动物、植物和真菌中广泛存在。
因此，开发一种可用于高效驱动外源基因增强表达的启动子，从而为斑玉蕈的遗传转化研究提供重要工具，是有待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种斑玉蕈强启动子，其中：所述启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明所述的斑玉蕈强启动子的一种优选方案：所述启动子，其扩增引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的斑玉蕈强启动子在斑玉蕈中表达外源基因中的应用。
本发明的有益效果：本发明在多种基因启动子中经过大量研究筛选，优选了HmGPD基因并设计出HmGPD启动子，能够高效地驱动外源基因在斑玉蕈中表达，为通过遗传方法改良符合生产需求和消费者喜爱的斑玉蕈新品种奠定基础，具有良好的市场应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为斑玉蕈转化质粒HmGPD-p021的PCR引物示意图；
图2为斑玉蕈转化质粒CaMV35S-p012的PCR引物示意图；
图3为RT-PCR检测CaMV35S-p012转化子中外源基因的表达和内含子的切割；
图4为RT-PCR检测HmGPD-p021转化子中外源基因的表达；
图5为RT-PCR检测HmGPD-p021转化子中内含子的切割；
图6为CaMV35S-p012和HmGPD-p021转化子花青素合成基因的相对表达量。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
一、斑玉蕈基因组编码的HmGPD启动子的获得：
提取斑玉蕈单核菌丝全基因组DNA，检测DNA质量和浓度。利用基因组DNA为模板，利用引物SEQ ID NO.2：CCATGACATCACTGCAAGTG和SEQ ID NO.3：GTTAACCTATTTACCTCAAGTCAGTC进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO.1所示的HmGPD启动子序列。
二、HmGPD-p021和CaMV35S-p012转化质粒的构建：
植物花青素合成基因是由矮牵牛中的花青素合成酶基因(基因登录号：AB027454)和拟南芥中的类黄酮3-O-葡萄糖转移酶基因(基因登录号：AY072325)融合而成。HmGPD启动子驱动花青素合成基因表达框(图1)，以及CaMV35S启动子结合蓖麻CBC基因内含子驱动花青素合成基因表达框(图2)，分别连接到去除了含萎锈灵抗性筛选基因的转化载体pSdi-GUS上，分别得到HmGPD-p021和CaMV35S-p012转化质粒。
三、农杆菌介导的斑玉蕈单核菌丝节孢子转化：
分别将CaMV35S-p012和HmGPD-p021质粒用冻融法转入根癌农杆菌EHA105中，以斑玉蕈单核菌丝节孢子作为受体材料，根据农杆菌介导的斑玉蕈节孢子转化方法进行转化。(1)活化培养农杆菌菌株：将含有转化质粒的农杆菌菌株EHA105在LBAKR培养基上划线培养2d，挑取单菌落于5mL LBKR培养基中，200r/min 28℃培养1d。将菌液倒入10mL离心管中，5000r/min室温离心10min，弃上清后用5mL IM培养基重悬，重复操作一次。再用IM培养基调整OD600到0.4-0.5，于150r/min 28℃培养6h。再次测OD600，并用IM培养基调整到0.4-0.5。(2)收集斑玉蕈单核体菌株‘F4’节孢子：用3mL灭菌的0.05％tween-20洗脱培养了15d左右的‘F4’菌株的节孢子，过滤后用血球计数板计数，用0.05％tween-20稀释至106/mL供侵染。(3)农杆菌侵染：混合1mL农杆菌菌液与1mL节孢子，25℃80r/min摇床上侵染20min，涂布在IMA培养基上，28℃暗培养2天。(4)转化子筛选：使用2mL 0.05％tween-20洗脱3块共培养平板上的节孢子，涂布于YMGACC筛选培养基，直至转化子长出。通过萎锈灵对转化子进行筛选，分别得到32个具有萎锈灵抗性的CaMV35S-p012转化子和23个HmGPD-p021转化子。这些转化子在含有萎锈灵的YMG培养基上能正常生长，而对照菌株‘F4’的生长受到明显抑制，表明外源DNA片段转化后得到的转化子中已经具有萎锈灵抗性。
四、PCR验证转化子中外源基因的转入：
收集22℃恒温培养20天的CaMV35S-p012和HmGPD-p021转化子菌丝，在经液氮预冷过的研钵中研磨成粉末。分别用真菌基因组DNA提取试剂盒和TRIzol提取转化子基因组DNA(gDNA)和总RNA，用Nanodrop仪器测总RNA浓度后，使用DEPC水将所有转化子的总RNA稀释至1000ng/μL。再根据TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser操作说明，去除gDNA后反转录成cDNA。以gDNA和cDNA为模板，根据转化质粒上的花青素合成基因序列设计引物1和2，7和2，3和4(表1)对花青素合成基因进行扩增。PCR扩增体系：10μLVazyme公司的2×Taq PCR Mix，正向和反向引物(10μM)各0.5μL，模板1μL，去离子水补齐20μL。PCR扩增条件：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃15s，30个循环；72℃3min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
随机各挑选CaMV35S-p012和HmGPD-p021的3个转化子提取基因组DNA(gDNA)和总RNA，并将总RNA去除gDNA后反转录成cDNA。CaMV35S-p012转化子用引物1和2(表1)对花青素合成基因片段进行扩增，引物位置如图1所示；HmGPD-p021转化子用引物7和2(表1)与引物3和4(表1)对花青素合成基因片段进行扩增，引物位置如图2所示，其中引物7位于引入的GPD基因内含子上。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳结果显示，以CaMV35S-p012转化子的gDNA为模板，引物1和引物2扩增片段为622bp；以其cDNA为模板，引物1和引物2扩增片段为433bp，表明我们在CaMV35S启动子-CBC内含子-花青素合成基因表达框中引入的CBC基因内含子已被正确切割(图3)。以HmGPD-p021转化子的gDNA和cDNA为模板，用引物3和引物4都能扩增出278bp片段(图4)；而用引物7和引物2扩增时，可以从HmGPD-p021转化子的gDNA中扩增出467bp片段，但由于引物7位于内含子上，以HmGPD-p021转化子的cDNA为模板无无扩增片段(图5)，表明我们在HmGPD启动子-GPD内含子-花青素合成基因表达框中引入的内含子已被正确切割。以上实验结果证明转化质粒中的外源DNA已成功转入斑玉蕈单核体菌株基因组中，并且HmGPD和CaMV35S基因的启动子能驱动外源基因在斑玉蕈中表达，引入的内含子在转录过程中均被正确切割。
五、实时荧光定量PCR检测花青素合成基因的表达水平：
分别以CaMV35S-p012和HmGPD-p021转化子的cDNA为模板，用引物8和引物9扩增斑玉蕈18S内参基因片段，引物3和4，5和6(表1)扩增花青素合成基因片段。在StepOnePlusReal-Time PCR System仪器上检测花青素合成基因的转录表达水平。实时荧光定量PCR扩增体系：TB Green Premix Ex TaqTM II 10μL，上下游引物(10μM)各0.8μL，Rox ReferenceDye(50X)0.4μL，cDNA 2μL，去离子水补齐20μL。实时荧光定量PCR扩增条件：95℃20s；95℃5s，60℃(荧光采集)15s，72℃15s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。采用2-ΔΔCt法计算花青素合成基因的相对表达量。采用GraphPad7软件绘制柱形图，数据以均值和标准误差呈现。结果显示，当引物3和4扩增时，CaMV35S-p012转化子的平均相对表达量为185左右，HmGPD-p021转化子的平均相对表达量为4108左右(图6A)；当引物5和6扩增时，CaMV35S-p012转化子的平均相对表达量为14左右，HmGPD-p021转化子的平均相对表达量为499左右(图6B)(HmGPD启动子比CaMV35S启动子驱动花青素合成基因表达水平强36倍左右)。结果证明，HmGPD启动子比CaMV35S启动子驱动花青素合成基因表达水平可提高36倍。
表1本专利实施中使用的引物
编号 引物 引物序列
1 p012-1F ATGACCAAACCCTCCGACCCAAC
2 p012-1R TCCAGAAGGCGATCCAGCTG
3 p012-2F CGCCACTAAGATCCTCACTG
4 p012-2R CGATGTGCATGATGATGGAG
5 p012-3F AGTGTCTCGACAAGGTCCTC
6 p012-3R GAGTAGTGACGACAGCGTTG
7 HmGPDP-3F TTTCTTCTGACTGACTTGAG
8 Hm18sF GAGGGACCTGAGAAACG
9 Hm18sR ATAAGACCCGAAAGAGCC
本发明在全基因组测序的基础上，经过大量研究，最终优选出HmGPD基因启动子，对斑玉蕈编码的HmGPD基因进行了生物信息学分析，并在设计HmGPD启动子驱动外源基因表达框架时将GPD基因启动子包含了其第一个外显子(3bp)以及第一个内含子(55bp)。为了检测优化后的HmGPD启动子的效果，我们构建了HmGPD启动子结合其第一个内含子驱动外源花青素合成基因的表达质粒(图1)，并通过农杆菌介导的斑玉蕈单核菌丝节孢子转化获得了转化子。与CaMV35S基因启动子结合CBC基因内含子驱动花青素基因(图2)的转化子进行比较，HmGPD启动子驱动外源基因表达水平比CaMV35S启动子驱动外源基因表达水平可提高36倍，说明我们选择HmGPD基因启动子并优化了HmGPD启动子能够高效地驱动外源基因再斑玉蕈中表达。
本发明可以高效地驱动外源基因在斑玉蕈中表达，为通过遗传方法改良符合生产需求和消费者喜爱的斑玉蕈新品种奠定基础，具有良好的市场应用前景。
SEQ ID NO.1：
CCATGACATCACTGCAAGTGCCTCGCGGACGCCGTGGATGATTCATCCTCCTCGTCAGCGATACATCCTTGAAGTTGAAACTGCAAGTTCGCGGCAATCTACTCCATGGGTTCGCGCGGTGGATAGGGCTAGGATTCCGATTGGCATCCGATGCCGACGGTGGAGGTCTCGGGAGCATCTAAGGATCCGGGCATCGTGCCATGTGCTGTCCCAGTAATACCCACGACGACGGGGCTGTAACATCTGCAATTTGTTTGCATCATAGCACTGTACAGAATTCGGGGAAGGTTTCGGAGGTGGGGGTATTTCCCCATGATTTCCCCGTTGTCGAGACGGATGTCAGCATTGAACATCCCAAAACACGGACGTATGCGCTTTGGGGATGCTTGTAGTTCGGTTTCACCGTATGCCGTGGCCCATCGGTGCCAACTATGTATCGACGAACGTTGATTCATTTCCTGTTCACTATGTTTATAGCTACAGCACCTGTTCCGTTTGGGTCTGCCAGGTTTGCGTGTGTACCGTGGTTCCCCAGAAGGATATATGGTGTTGACGTGACGTACATACTTTGAGCTTCTTGGAATTCCAGCTTGCTCTGGGGCAGACGCGGACAGAGAACGTTCTTGAACATTCGATTTCAGGAATCAGGATCCCAGTCGAGGGGCATTCACATTTGTCCAGCCGCGTCTTCCCGGTCACTGTGGCACGGACATCCGAGTCCGTTCTATGGCCGAAAACGGGGGGACAAACTTGGTCTGCACTGAAGCTTGGCTGCTACGGAGAATGCTGCGCATTTTGGTGCTTATTGGACGTAGTGTAATGGGGAAGGGCATTATATACTGTCTTAGTCTATTCGAGGATATAAGATGAATGGATACACATCCGTTGGGGAGAAAGGGGTAGATTTTGGTGCGTATTATTGAGAGAAATGTACCGAATTTGCGATGACGACACCATCGATTTCCGAATCCGATGGATTGATTATCTAGCCAGGGGCGTTATAAAACCCTCTCCCCGCCCTTTCCTTTCAACACCCATCACCCCAAACAACACACATCCACCATGGTCAGTACTCCCTATACTTACCTTTCCTTTCTTCTGACTGACTTGAGGTAAATAGGTTAAC
SEQ ID NO.2：
CCATGACATCACTGCAAGTG
SEQ ID NO.3：
GTTAACCTATTTACCTCAAGTCAGTC
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种斑玉蕈强启动子及其应用
<130> 2021041505-zf-wjn
<141> 2021-04-15
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatgacatc actgcaagtg cctcgcggac gccgtggatg attcatcctc ctcgtcagcg 60
atacatcctt gaagttgaaa ctgcaagttc gcggcaatct actccatggg ttcgcgcggt 120
ggatagggct aggattccga ttggcatccg atgccgacgg tggaggtctc gggagcatct 180
aaggatccgg gcatcgtgcc atgtgctgtc ccagtaatac ccacgacgac ggggctgtaa 240
catctgcaat ttgtttgcat catagcactg tacagaattc ggggaaggtt tcggaggtgg 300
gggtatttcc ccatgatttc cccgttgtcg agacggatgt cagcattgaa catcccaaaa 360
cacggacgta tgcgctttgg ggatgcttgt agttcggttt caccgtatgc cgtggcccat 420
cggtgccaac tatgtatcga cgaacgttga ttcatttcct gttcactatg tttatagcta 480
cagcacctgt tccgtttggg tctgccaggt ttgcgtgtgt accgtggttc cccagaagga 540
tatatggtgt tgacgtgacg tacatacttt gagcttcttg gaattccagc ttgctctggg 600
gcagacgcgg acagagaacg ttcttgaaca ttcgatttca ggaatcagga tcccagtcga 660
ggggcattca catttgtcca gccgcgtctt cccggtcact gtggcacgga catccgagtc 720
cgttctatgg ccgaaaacgg ggggacaaac ttggtctgca ctgaagcttg gctgctacgg 780
agaatgctgc gcattttggt gcttattgga cgtagtgtaa tggggaaggg cattatatac 840
tgtcttagtc tattcgagga tataagatga atggatacac atccgttggg gagaaagggg 900
tagattttgg tgcgtattat tgagagaaat gtaccgaatt tgcgatgacg acaccatcga 960
tttccgaatc cgatggattg attatctagc caggggcgtt ataaaaccct ctccccgccc 1020
tttcctttca acacccatca ccccaaacaa cacacatcca ccatggtcag tactccctat 1080
acttaccttt cctttcttct gactgacttg aggtaaatag gttaac 1126
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatgacatc actgcaagtg 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttaacctat ttacctcaag tcagtc 26

Claims (2)

1.一种斑玉蕈强启动子在斑玉蕈中表达外源基因中的应用，其特征在在于：所述启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在在于：所述启动子，其扩增引物序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。
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Title
An efficient Agrobacterium-mediated transformation method for the edible mushroom Hypsizygus marmoreus;Jin jingZhang等;《Microbiological Research》;20140208;第169卷(第9-10期);摘要，第743页图2 *
Hypsizygus marmoreus strain SIEF 3133 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene, complete cds，JN048800.1;Zhang,Jj.等;《NCBI》;20150422;第1-2页 *

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