CN111206047B - OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了OsSWEET13突变体，并公开了一种提高水稻产量的方法包括通过CRISPR/Cas9技术编辑OsSWEET13基因，在OsSWEET13基因的第一外显子和第二外显子的第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点插入一个碱基；或者在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基的片段被反向，在第三个靶点上有一个碱基插入。本发明通过编辑编辑OsSWEET13基因，获得提高水稻产量的水稻植株，并具有耗时短且不会影响水稻其他品质的优点。

Description

OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用。
背景技术
现阶段水稻品种主要还是通过传统育种和分子育种相结合的方法来进行培育，希望通过水稻育种获得既优质又高产的水稻品种。这种方法通常是将高产水稻品种和优质水稻品种进行杂交，随后通过和优质水稻品种回交，筛选既高产又优质的水稻株系，至少需要六代才能获得稳定遗传的高产优质水稻品种。传统育种和分子育种主要具有以下缺点：
1、耗时长：至少需要7代的杂交、回交或者自交才能获得稳定遗传的高产优质水稻品种，一年种两季水稻，那么最短也需要3年半的时间。
2、稻米品质可能受到影响：稻米品质这一指标无法用肉眼进行筛选，如果没有合适的检测机器，那么有可能在经过几代的筛选之后，最后的稳定遗传水稻株系的稻米品质有所下降。
3、筛选难：稻米品质是否优质很难通过观察进行判断；稻米品质由多基因位点控制，很难通过简单的分子检测准确地判断出稻米品质是否优质；如果每一代都利用检测仪器对稻米品质进行检测筛选，那么费用会很高。
因此有可能在经过几代的筛选之后，最后的稳定遗传水稻株系的稻米品质有所下降。
OsSWEET13基因之前报道为水稻白叶枯病的感病基因，将其启动子编辑之后可对部分白叶枯病菌产生抗性。但是没有该基因和水稻产量等相关农艺性状关系的报道。此外，之前对OsSWEET13基因的编辑应用都集中在白叶枯抗性方面。OsSWEET13基因启动子被编辑之后，OsSWEET13无法被病原菌激活，可以产生白叶枯抗性，但是OsSWEET13基因在生长发育中仍然能够正常表达，所以可能无法产生增产的效果。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种提高水稻产量的方法，该方法通过编辑OsSWEET13基因，可以稳定有效地提高水稻的产量。
实现上述目的的技术方案如下。
一种提高水稻产量的方法，包括通过CRISPR/Cas9技术编辑OsSWEET13基因，在OsSWEET13基因的第一外显子和第二外显子的第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点插入一个碱基A；或者在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基片段被反向，在第三个靶点上有一个碱基A插入。
在其中一些实施例中，
所述第一个靶点：5’-GAGAGGAATGAAGGGAGTTG-3’位于
chr12:17305328..17305347
所述第二个靶点：5’-AGGCCGAAGGCAAAAGCCCA-3’位于
chr12:17305088..17305107
所述第三个靶点：5’-GATAGGTCGTGAAGGATATG-3’位于chr12:17304108..17304127。
在其中一些实施例中，所述方法包括以下步骤：(1)第一轮PCR：(i)以pYLgRNA-OsU3/LacZ质粒为模板，进行PCR反应，(ii)以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板,进行PCR反应，(iii)以pYLgRNA-OsU6a质粒为模板,进行PCR反应；
(2)第二轮PCR：对(i)(ii)和(iii)得到的PCR反应的产物为模板，分别进行PCR反应，分别得到第二轮的PCR产物；
(3)得到的第二轮的PCR产物进行双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应，得到连接产物；
(4)连接产物转化(热激发)：将连接产物电激转化感受态细胞，电激后培养；
(5)提取质粒，Mlu I或Asc I酶切电泳检测sgRNA表达盒连接片段；
(6)导入农杆菌，获得的克隆转化农杆菌；
(7)获得的阳性农杆菌可用于侵染植物组织；
(8)获得OsSWEET13转基因T0植株；
(9)经过一代自交繁种，T1代获得产量提高的水稻植株。
在其中一些实施例中，步骤(1)中第一轮PCR的引物序列依次为：SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.7、和SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.9。
在其中一些实施例中，步骤(1)中第一轮PCR的引物序列依次为：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.6、和SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.8。
在其中一些实施例中，步骤(2)中第一轮PCR的引物序列分别为：SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、和SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17。
在其中一个实施例中，所述农杆菌为EHA105。
本发明的另一目的是提供OsSWEET13基因突变体。
OsSWEET13基因突变体CR-S13-1，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
OsSWEET13基因突变体CR-S13-2，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的另一目的是提供上述OsSWEET13基因突变体在提高水稻产量的方法或者生物制剂中应用。
本发明利用CRISPR/Cas9技术直接编辑水稻品种中花11(ZH11)中的OsSWEET13基因。在OsSWEET13的启动子，第一外显子和第二外显子各选定一个靶点。被编辑后的OsSWEET13突变体CR-S13-1在第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点有一个碱基A插入。另一个编辑后的OsSWEET13突变体CR-S13-2在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基的片段被反向，在第三个靶点上有一个碱基A插入。
本发明的所述提高水稻产量的方法，具有以下优点：
1、同时提高水稻抗性和产量。OsSWEET13是一个水稻白叶枯感病基因，其缺失或者启动子的突变之前已经被证实可以对小部分水稻白叶枯病菌小种产生抗性。我们通过找到合适的靶点，用CRISPR/Cas9技术编辑(敲除)OsSWEET13基因之后发现水稻在正常生长条件下产量有了显著的提高。说明我们在本发明中获得的两个OsSWEET13突变体CR-S13-1和CR-S13-2同时提高了水稻抗性和产量。在选择OsSWEET13的靶点时，我们在启动子区域，第一外显子和第二外显子分别选取一个靶点，达到了能够彻底破坏OsSWEET13这个基因的功能。将启动和编码区域都破坏之后其还能再编码有功能的OSWEET13蛋白的可能性大大降低。实际上从最后结果来看，我们获得的两个突变体都彻底破坏了OsSWEET13的编码区域，为两个OsSWEET13敲除突变体。
2、耗时短。理论上来说水稻品种中的一个基因被CRISPR/Cas9编辑破坏其基因功能之后，只需要两代(一年)就能拿到编辑纯合并且无筛选标记的水稻株系，和传统育种三年半的耗时相比大大缩短了品种培育所需要的时间。
3、不引入影响稻米品质的基因。CRISPR/Cas9特异地编辑OsSWEET13，理论上并不影响基因组里面的其它基因，因此理论上不会影响水稻的稻米品种。
附图说明
图1.野生型OsSWEET13和被编辑的CR-S13示意图，其中，A.野生型OsSWEET13：黑色方框代表对应的CDS编码区，白色方框对应的为转录本的非编码区，横线代表启动子区域或者内含子区域；B.CR-S13-1和CR-S13-2：虚线代表缺失的碱基部分，黑色箭头代表三个靶点的位置，CR-S13-2中靶点一和靶点二之间的箭头头代表被反向的238个碱基片段。
图2.实施例2中主穗产量和千粒重的统计结果示意图。
具体实施方式
下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
OsSWEET13在中花11基因组的位置为12号染色体负链chr12:17302127..17305326。本发明在OsSWEET13的启动子(chr12:17305328..17305347)、第一外显子(chr12:17305088..17305107)和第二外显子(17304108..17304127)各选定一个靶点，利用CRISPR/Cas9技术直接编辑水稻品种中花11(ZH11)中的OsSWEET13基因，被编辑后的OsSWEET13突变体CR-S13-1在第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点有一个碱基插入，另一个CR-S13-2在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基的片段被反向，在第三个靶点上有一个碱基插入(图1)。
具体的野生型OsSWEET13和部分启动子序列以及被编辑后的CR-S13-1和CR-S13-2序列如下。斜体字体为靶标序列，下划线部分为OsSWEET13的外显子区域，灰色背景为OSWEET13的5’UTR，加粗和斜体为CR-S13-2中反向的片段，----代表CR-S13-1中缺失240个碱基的位置。
野生型水稻ZH11中OsSWEET13基因序列。
>OsSWEET13(chr12:17302087..17305825)
CAATTATCTTTTTCTCCGCGATTAATATTTTTCGAGTAGTAAAATTTAAGTCAAAAGCCGTATCAGGATTCAGGAATAATCCTTCACTGGGAGAGATCTCATGTGATTTGCTGTTGCACTCGGCGGCTATCTTTTACCGTTCCCAGCAGGAAGCTGCAGACGTTGGAGAGATCGATCTCTACTGACAATGCACAAAGCAATTACTCACTAAATTGGCTATGGCTAGTGAGAGGTGCGCTGCGCACAAAGCCAATGCAACTTTTTTTGAAAATTAGCCAGGATTATCTCCAACAGTAGCTCATTTTTGTAAAAGCCTAATTATTGTGCGTGTCCAAAAGACTTTCCTCAAAAGCAAATAAAGAAAAAAAATCTTTGCATAATTATTCTATGATTACTTTGATGCGTACGTGAATGGCCATGGGTAGGAGGCAACCAAGTGATTCCCACCTAGCTAGCTTTGCTCCTATATAAAGCACCACAACTCCCTTCATTCCTCTCCAAGAGTTTTCAGCCAACACATTGAACTCTTCTTCAGAGCTCTCCCTTCCCTCCACAAAGGGGGTCTAGGGTTAGAGTGTGTGTGTCTGTGACAAGTTCCAAGCTAGCAACAACAAGCTCAATTCCTTGCTTGTTTGCTTCCATATTACACTACATCTCTTCCCTTCAATTACCCCCCTTTTAGCACACAAAAATGGCTGGCCTGTCCCTGCAGCATCCCTGGGCTTTTGCCTTCGGCCTCCTTGGTATATCATCATCACCTACCACAACTAAGACATTCCCTTCATTGCCAACATTTTACTTCTTTTTATTAGAAACCATTGAGTTTGTACATATAAGCTCAGAGTTATTACTTGCTGGCAGATACGCATAGCTAGCGACGACATTTAGTGAGGATTACACTTTAGTGGTCATCATATATAAAATAATAAAATTGTTGTGTTTCTTTATTTGTTTTTTATTTTCTAGCTAGCTTCTTTCAGTTATTTTCAACAAAAAGAATTTCTTCTAGCACTTTTATTTACAGCAGTTTATTATGTCTATTTGGGCATATTAATTAGCTACTAGCGCATAAGCTAAAAACCCTACTAGCCTTCCGAAGGCAATATGGATGGTACTCTTGTAGTAATAAGCCAAAAGCTAGATTTGATTTTTTTTATTTCTTTTGGCTTTTGTCTATTAGAATTATACGCGCGGCGCCACCCTTAAAATTGCAGGCTTAAAATCCACAAGCATATAAACTACAAGGGCCTAAGCATACTTAATGAGATGCACATAGCCATATAATTTTTCTGCTTCTTGTTAAACTATATATATACAGCAAGTCCTCATCATTTGTATGTATATCCTACTTGTGGAGCAAACATTCGATCCTTTGGTGCAACCTCTATATATTTATGTTGCCATGGAGAGAGAGTGGAATTAATAGGTCAAGCTATATAGTACTCTAATTAATGACATCATAGTGCACCATGTAACACAATAATTTAAAGAACAAGTTAAAAGCCAAGGCACAATCTTTGTTGCAAAGGAAGGCAAGGGCTAGACATAAAGTTTGTAAACGTGTCTATCTATCACAACTTATCACGTCTGGTCGCTACCTTAGCTGCCTCCATGGGGCTCTTTACTCGCATTACTTTGCCTTTTTTCCTTTACAAAATCCTGATCTTGTTTCTGTTCCTTTGGCTTTGCAGGCAACCTCATATCCTTCACGACCTATCTGGCACCAATGTAAGTAACTGAATTTCTACATGATATATACATATATAGCTTTTGTGTAATTTTAATTCCCAATCCGCACCGCGTTCCGTATCCGATAATATATGTGCATAATATTTTATGCAGCCCGACGTTCTACCGGATCTACAAGAGCAAGTCGACGGAGGGGTTCCAGT CGGTGCCGTACGTGGTGGCGCTCTTCAGCGCCATGCTGTGGATCTTCTACGCGCTGATCAAGTCCAACGAGGCCCT CCTCATCACCATCAACGCCGCCGGTTGCGTCATCGAGACCATCTACATCGTCATGTACCTCGCCTACGCCCCCAAG AAGGCCAAGGTTCGATCCATGTCATCCAAACCCTAGCACTACCACAGAAACCCTATTTCGATGCCGGTGGGGACTTGGGAACCACCCTTTGATTCTCGAGTCGCAACCGGCACCGATGAGAGGCCCCTTACAGGTGTCATCGGTTGTGAACAAGAACCGGCACCTATATAAGATTGTTCCATATTTACCGTTTTGTAGTAGTAAAATATAATAATTGACAAGTATATATGGTTCGACGTCGTTTTTGCAGGTGTTCACGACGAAGATCCTGCTGCTGCTGAACGTGGGGGTGTTCGGGGTGATC CTGCTGCTGACGCTGCTGCTCTCCCATGGCGAGCAGCGCGTCGTCTCCCTCGGCTGGGTCTGCGTCGCCTTCTCCG TCAGCGTCTTTGTCGCGCCGCTCAGCATCATCGTATGTGCATATATACGATCAGTCGTCGTCAATCTCTAGCTAGCTCATCTTTACTTCGTGTCTTGGTTTGATCGATCGATCTCGTTGCTAACTGAACTGCTTCCATGGACGATGGATGCGATATTGCAGAAGCGAGTGATCCAGTCGAGGAGCGTGGAGTACATGCCCTTCTCCCTCTCCCTCACGCTCACCCTCA GCGCCGTCGTCTGGTTCCTCTACGGCCTTCTCATCAAGGACAAATACGTCGCGGTAATTATTCAATCAATTACCTAATTATTTCTTCAAATCACAAACTGCTCAATTCAAATTTATGTGTGTGACCACATGAATTGTAATTAAGCTAAAATTGTGTGAATTTTTGCAGCTTCCCAACATCCTGGGCTTCACATTCGGTGTGGTCCAGATGGGGCTCTACGTGTTCTAC ATGAACGCGACGCCGGTGGCCGGCGAGGGGAAAGAAGGGAAGGGGAAGCTGGCGGCGGCGGAGGAGCTCCCCGTCG TCGTCAACGTCGGCAAGCTCGCCGCCGCCACGCCCGACAGGAGCACCGGCGCCGTGCACGTGCACCCAGTCCCGAG GAGCTGCGCGGCGGAGGCGGCGGCGGCCGAGCCGGAGGTGCTCGTCGACATTCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCC GTCGAGGTGGCCGCCGTGTAGGGTCCCCGGCCGGTCAACGCGTGCTTGCATGGGCCATGCACGTGTGCAGTACCACGTGCCACGTACACTTTAATATGAACTCCAGGGCAAACTTGGAGGAGACAAGCTACCACCAATTAATTAACTTAATTATTATTACTCATCTTTCCCAAAATATAATTACTTTTAGCCTCTAAAATTTATCTCAAAATATAGCAACTTCTTCACCTATATTCTCTTATAAAACAATCGTAACCTTCCATTAATTAAATTTCTTACATATATATTTCTCCTCTTATCAATCAATCCCAACTGCCTTTTTTTTTCATTTTATTCCTGTAACTTTCGTAATATATCCGTATATCCTATCTAAAACTTATTATATTTTGGGATGGTGATGGTATTATATATCTTTCTTGCATGCCATGCAACTAGAGACGGGGGAAGCTATGTGTAATGTATGTGCATGTGTTTCTCTGGTGTTGGTTTCCGCTTCTGTTGTATTCATTTGTATCGGTCAATGGGTATCTATTATTCCTAATTAGTTCCTTGTACTTGTAATGTATGTCAAAATTAATAAAAATGTAATCGATAAATATCTCTTCTATCAATTGTGAAATACTCATGCACA(SEQ ID NO.1)。
CR-S13-1中被编辑后的基因序列
>CR-S13-1
CAATTATCTTTTTCTCCGCGATTAATATTTTTCGAGTAGTAAAATTTAAGTCAAAAGCCGTATCAGGATTCAGGAATAATCCTTCACTGGGAGAGATCTCATGTGATTTGCTGTTGCACTCGGCGGCTATCTTTTACCGTTCCCAGCAGGAAGCTGCAGACGTTGGAGAGATCGATCTCTACTGACAATGCACAAAGCAATTACTCACTAAATTGGCTATGGCTAGTGAGAGGTGCGCTGCGCACAAAGCCAATGCAACTTTTTTTGAAAATTAGCCAGGATTATCTCCAACAGTAGCTCATTTTTGTAAAAGCCTAATTATTGTGCGTGTCCAAAAGACTTTCCTCAAAAGCAAATAAAGAAAAAAAATCTTTGCATAATTATTCTATGATTACTTTGATGCGTACGTGAATGGCCATGGGTAGGAGGCAACCAAGTGATTCCCACCTAGCTAGCTTTGCTCCTATATAAAGCACCACAA----GCTTTTGCCTTCGGCCTCCTTGGTATATCATCATCACCTACCACAACTAAGACATTCCCTTCATTGCCAACATTTTACTTCTTTTTATTAGAAACCATTGAGTTTGTACATATAAGCTCAGAGTTATTACTTGCTGGCAGATACGCATAGCTAGCGACGACATTTAGTGAGGATTACACTTTAGTGGTCATCATATATAAAATAATAAAATTGTTGTGTTTCTTTATTTGTTTTTTATTTTCTAGCTAGCTTCTTTCAGTTATTTTCAACAAAAAGAATTTCTTCTAGCACTTTTATTTACAGCAGTTTATTATGTCTATTTGGGCATATTAATTAGCTACTAGCGCATAAGCTAAAAACCCTACTAGCCTTCCGAAGGCAATATGGATGGTACTCTTGTAGTAATAAGCCAAAAGCTAGATTTGATTTTTTTTATTTCTTTTGGCTTTTGTCTATTAGAATTATACGCGCGGCGCCACCCTTAAAATTGCAGGCTTAAAATCCACAAGCATATAAACTACAAGGGCCTAAGCATACTTAATGAGATGCACATAGCCATATAATTTTTCTGCTTCTTGTTAAACTATATATATACAGCAAGTCCTCATCATTTGTATGTATATCCTACTTGTGGAGCAAACATTCGATCCTTTGGTGCAACCTCTATATATTTATGTTGCCATGGAGAGAGAGTGGAATTAATAGGTCAAGCTATATAGTACTCTAATTAATGACATCATAGTGCACCATGTAACACAATAATTTAAAGAACAAGTTAAAAGCCAAGGCACAATCTTTGTTGCAAAGGAAGGCAAGGGCTAGACATAAAGTTTGTAAACGTGTCTATCTATCACAACTTATCACGTCTGGTCGCTACCTTAGCTGCCTCCATGGGGCTCTTTACTCGCATTACTTTGCCTTTTTTCCTTTACAAAATCCTGATCTTGTTTCTGTTCCTTTGGCTTTGCAGGCAACCTCATAATCCTTCACGACCTATCTGGCACCAATGTAAGTAACTGAATTTCTACATGATATATACATATATAGCTTTTGTGTAATTTTAATTCCCAATCCGCACCGCGTTCCGTATCCGATAATATATGTGCATAATATTTTATGCAGCCCGACGTTCTACCGGATCTACAAGAGCAAGTCGACGGAGGGGTTCCAGTCGGTGCC GTACGTGGTGGCGCTCTTCAGCGCCATGCTGTGGATCTTCTACGCGCTGATCAAGTCCAACGAGGCCCTCCTCATC ACCATCAACGCCGCCGGTTGCGTCATCGAGACCATCTACATCGTCATGTACCTCGCCTACGCCCCCAAGAAGGCCA AGGTTCGATCCATGTCATCCAAACCCTAGCACTACCACAGAAACCCTATTTCGATGCCGGTGGGGACTTGGGAACCACCCTTTGATTCTCGAGTCGCAACCGGCACCGATGAGAGGCCCCTTACAGGTGTCATCGGTTGTGAACAAGAACCGGCACCTATATAAGATTGTTCCATATTTACCGTTTTGTAGTAGTAAAATATAATAATTGACAAGTATATATGGTTCGACGTCGTTTTTGCAGGTGTTCACGACGAAGATCCTGCTGCTGCTGAACGTGGGGGTGTTCGGGGTGATCCTGCTGCTGACGCTGCTGCTCTCCCATGGCGAGCAGCGCGTCGTCTCCCTCGGCTGGGTCTGCGTCGCCTTCTCCGTCAGCGTCTTTGTCGCGCCGCTCAGCATCATCGTATGTGCATATATACGATCAGTCGTCGTCAATCTCTAGCTAGCTCATCTTTACTTCGTGTCTTGGTTTGATCGATCGATCTCGTTGCTAACTGAACTGCTTCCATGGACGATGGATGCGATATTGCAGAAGCGAGTGATCCAGTCGAGGAGCGTGGAGTACATGCCCTTCTCCCTCTCCCTCACGCTCACCCTCAGCGCCGT CGTCTGGTTCCTCTACGGCCTTCTCATCAAGGACAAATACGTCGCGGTAATTATTCAATCAATTACCTAATTATTTCTTCAAATCACAAACTGCTCAATTCAAATTTATGTGTGTGACCACATGAATTGTAATTAAGCTAAAATTGTGTGAATTTTTGCAGCTTCCCAACATCCTGGGCTTCACATTCGGTGTGGTCCAGATGGGGCTCTACGTGTTCTACATGAACG CGACGCCGGTGGCCGGCGAGGGGAAAGAAGGGAAGGGGAAGCTGGCGGCGGCGGAGGAGCTCCCCGTCGTCGTCAA CGTCGGCAAGCTCGCCGCCGCCACGCCCGACAGGAGCACCGGCGCCGTGCACGTGCACCCAGTCCCGAGGAGCTGC GCGGCGGAGGCGGCGGCGGCCGAGCCGGAGGTGCTCGTCGACATTCCGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGTCGAGG TGGCCGCCGTGTAGGGTCCCCGGCCGGTCAACGCGTGCTTGCATGGGCCATGCACGTGTGCAGTACCACGTGCCACGTACACTTTAATATGAACTCCAGGGCAAACTTGGAGGAGACAAGCTACCACCAATTAATTAACTTAATTATTATTACTCATCTTTCCCAAAATATAATTACTTTTAGCCTCTAAAATTTATCTCAAAATATAGCAACTTCTTCACCTATATTCTCTTATAAAACAATCGTAACCTTCCATTAATTAAATTTCTTACATATATATTTCTCCTCTTATCAATCAATCCCAACTGCCTTTTTTTTTCATTTTATTCCTGTAACTTTCGTAATATATCCGTATATCCTATCTAAAACTTATTATATTTTGGGATGGTGATGGTATTATATATCTTTCTTGCATGCCATGCAACTAGAGACGGGGGAAGCTATGTGTAATGTATGTGCATGTGTTTCTCTGGTGTTGGTTTCCGCTTCTGTTGTATTCATTTGTATCGGTCAATGGGTATCTATTATTCCTAATTAGTTCCTTGTACTTGTAATGTATGTCAAAATTAATAAAAATGTAATCGATAAATATCTCTTCTATCAATTGTGAAATACTCATGCACA(SEQ ID NO.2)
CR-S13-2中被编辑后的基因序列
>CR-S13-2
Figure BDA0002384175010000101
Figure BDA0002384175010000111
Figure BDA0002384175010000121
引物序列如下：
Figure BDA0002384175010000122
Figure BDA0002384175010000131
实施例1
1、CRISPR/Cas9克隆的构建
(1)菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F’)和CRISPR/sgRNAvectors菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养用于提取质粒。用2-3U Bsa I试切～150ng质粒(10μl反应)，电泳检查是否切出690bp的ccdB条带(未切的80ng质粒为对照)。
(2)sgRNA表达盒构建：
1)第一轮PCR:(i)取2-5ng pYLgRNA-OsU3/LacZ质粒为模板，做两个PCR反应。一个反应使用引物：U-F和OsU3-PthXo2(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.5)，产物为a，另一个反应使用引物gR-R和gR-PthXo2(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.4),产物为b。25-28循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s；(ii)取2-5ng pYLgRNA-OsU6b质粒为模板,做两个PCR反应。一个反应使用引物：U-F和OsU6b-S13E1(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.7)，产物为c，另一个反应使用引物gR-R和gR-S13E1(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.6),产物为d。25-28循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s。(iii)取2-5ng pYLgRNA-OsU6a质粒为模板,做两个PCR反应。一个反应使用引物：U-F和U6a-S13E2(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.9)，产物为e，另一个反应使用引物gR-R和gR-S13E2(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.8),产物为f。25-28循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s
2)第二轮PCR:预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5μM。取第一轮PCR产物1μl用H2O稀释10倍，各取1μl混合为模板。各表达盒30ul PCR。Pps-GGL和Pgs-GG2(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13)为引物，a和b为模板；Pps-GG2和Pgs-GG3(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)为引物，c和d为模板；Pps-GG3和Pgs-GGR(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17)为引物，e和f为模板。使用适量PRIMESTAR MAX PCR酶。25-28循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s。
(3)双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应：
Figure BDA0002384175010000141
用变温循环进行酶切连接:先3cycles(37℃for 10min,10℃for 5min,20℃for5min)；再10cycles(37℃for 3min,10℃for 5min,20℃for 5min)。最后37℃for 5min。
(4)连接产物转化(热激发)：取1-1.5μl连接产物电激转化E.coli DH5alpha感受态细胞，电激后加入1ml LB，37℃培养1h。涂板培养基为LB+25μg/ml Kan,0.3～0.5mMIPTG，适量X-gal。
(5)提取质粒，Mlu I或Asc I酶切电泳检测sgRNA表达盒连接片段。
(6)将验证成功的质粒导入农杆菌。获得的克隆转化农杆菌(EHA105)。
(7)获得的阳性农杆菌可用于侵染植物组织。
(8)获得转基因T0植株的打靶效果检测：利用引物Target-PthXo2-F和Target-S13E2-R(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19)将突变体中包括三个靶标在内的基因组序列进行扩增，随后利用一代测序技术对扩增产物进行测序，将突变体中的基因组测序结果同野生型中的序列进行对比，分析打靶是否成功以及编辑类型。
实施例2
主穗产量和千粒重的统计
水稻种植在广东省广州市的大田当中，正常光照灌溉和施肥。最先抽出来的穗为主穗。谷粒脱粒将空壳去掉，称取实粒重量即为每个主穗的产量。通过每穗粒数和每穗谷粒重量计算出每一千颗谷粒的重量即为千粒重。CR-S13-1，CR-S13-2和ZH11各自都有至少30株植株进行了主穗产量和千粒重的统计。连续统计两季数据。利用two-tailed Student’st test进行显著性分析。
经过统计，CR-S13-1和CR-S13-2的主穗产量和千粒重相对于亲本ZH11都有了显著的提高(请参见图2)。
根据统计数据，ZH11的平均主穗产量为每穗2.07克，CR-S13-1和CR-S13-2分别为2.47和2.42克，也就是在野生型的基础上分别提高了19.3％和16.9％，CR-S13-1,CR-S13-2分别和ZH11进行显著性分析的P值为0.0013和0.0012，说明和野生型ZH11相比，CR-S13-1和CR-S13-2的产量分别提高了19.3％和16.9％。
ZH11的千粒重平均值为21.52克，CR-S13-1和CR-S13-2分别为23.73和25.31，在野生型的基础上分别提高了10.2％和17.6％。CR-S13-1，CR-S13-2分别和ZH11进行显著性分析的P值为2.1X10-5和4.0X10-11，说明和野生型相比，CR-S13-1和CR-S13-2的千粒重分别提高10.2％和17.6％。
从主穗产量和千粒重的统计数值来看，OsSWEET13的编辑对于这两个指标都有极大的提高(大于10％，甚至有的接近20％)，如果能够应用到生产当中将极大提升水稻的产量。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> OsSWEET13基因突变体及其在提高水稻产量中的应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3739
<212> DNA
<213> OsSWEET13 基因(OsSWEET13 gene)
<400> 1
caattatctt tttctccgcg attaatattt ttcgagtagt aaaatttaag tcaaaagccg 60
tatcaggatt caggaataat ccttcactgg gagagatctc atgtgatttg ctgttgcact 120
cggcggctat cttttaccgt tcccagcagg aagctgcaga cgttggagag atcgatctct 180
actgacaatg cacaaagcaa ttactcacta aattggctat ggctagtgag aggtgcgctg 240
cgcacaaagc caatgcaact ttttttgaaa attagccagg attatctcca acagtagctc 300
atttttgtaa aagcctaatt attgtgcgtg tccaaaagac tttcctcaaa agcaaataaa 360
gaaaaaaaat ctttgcataa ttattctatg attactttga tgcgtacgtg aatggccatg 420
ggtaggaggc aaccaagtga ttcccaccta gctagctttg ctcctatata aagcaccaca 480
actcccttca ttcctctcca agagttttca gccaacacat tgaactcttc ttcagagctc 540
tcccttccct ccacaaaggg ggtctagggt tagagtgtgt gtgtctgtga caagttccaa 600
gctagcaaca acaagctcaa ttccttgctt gtttgcttcc atattacact acatctcttc 660
ccttcaatta cccccctttt agcacacaaa aatggctggc ctgtccctgc agcatccctg 720
ggcttttgcc ttcggcctcc ttggtatatc atcatcacct accacaacta agacattccc 780
ttcattgcca acattttact tctttttatt agaaaccatt gagtttgtac atataagctc 840
agagttatta cttgctggca gatacgcata gctagcgacg acatttagtg aggattacac 900
tttagtggtc atcatatata aaataataaa attgttgtgt ttctttattt gttttttatt 960
ttctagctag cttctttcag ttattttcaa caaaaagaat ttcttctagc acttttattt 1020
acagcagttt attatgtcta tttgggcata ttaattagct actagcgcat aagctaaaaa 1080
ccctactagc cttccgaagg caatatggat ggtactcttg tagtaataag ccaaaagcta 1140
gatttgattt tttttatttc ttttggcttt tgtctattag aattatacgc gcggcgccac 1200
ccttaaaatt gcaggcttaa aatccacaag catataaact acaagggcct aagcatactt 1260
aatgagatgc acatagccat ataatttttc tgcttcttgt taaactatat atatacagca 1320
agtcctcatc atttgtatgt atatcctact tgtggagcaa acattcgatc ctttggtgca 1380
acctctatat atttatgttg ccatggagag agagtggaat taataggtca agctatatag 1440
tactctaatt aatgacatca tagtgcacca tgtaacacaa taatttaaag aacaagttaa 1500
aagccaaggc acaatctttg ttgcaaagga aggcaagggc tagacataaa gtttgtaaac 1560
gtgtctatct atcacaactt atcacgtctg gtcgctacct tagctgcctc catggggctc 1620
tttactcgca ttactttgcc ttttttcctt tacaaaatcc tgatcttgtt tctgttcctt 1680
tggctttgca ggcaacctca tatccttcac gacctatctg gcaccaatgt aagtaactga 1740
atttctacat gatatataca tatatagctt ttgtgtaatt ttaattccca atccgcaccg 1800
cgttccgtat ccgataatat atgtgcataa tattttatgc agcccgacgt tctaccggat 1860
ctacaagagc aagtcgacgg aggggttcca gtcggtgccg tacgtggtgg cgctcttcag 1920
cgccatgctg tggatcttct acgcgctgat caagtccaac gaggccctcc tcatcaccat 1980
caacgccgcc ggttgcgtca tcgagaccat ctacatcgtc atgtacctcg cctacgcccc 2040
caagaaggcc aaggttcgat ccatgtcatc caaaccctag cactaccaca gaaaccctat 2100
ttcgatgccg gtggggactt gggaaccacc ctttgattct cgagtcgcaa ccggcaccga 2160
tgagaggccc cttacaggtg tcatcggttg tgaacaagaa ccggcaccta tataagattg 2220
ttccatattt accgttttgt agtagtaaaa tataataatt gacaagtata tatggttcga 2280
cgtcgttttt gcaggtgttc acgacgaaga tcctgctgct gctgaacgtg ggggtgttcg 2340
gggtgatcct gctgctgacg ctgctgctct cccatggcga gcagcgcgtc gtctccctcg 2400
gctgggtctg cgtcgccttc tccgtcagcg tctttgtcgc gccgctcagc atcatcgtat 2460
gtgcatatat acgatcagtc gtcgtcaatc tctagctagc tcatctttac ttcgtgtctt 2520
ggtttgatcg atcgatctcg ttgctaactg aactgcttcc atggacgatg gatgcgatat 2580
tgcagaagcg agtgatccag tcgaggagcg tggagtacat gcccttctcc ctctccctca 2640
cgctcaccct cagcgccgtc gtctggttcc tctacggcct tctcatcaag gacaaatacg 2700
tcgcggtaat tattcaatca attacctaat tatttcttca aatcacaaac tgctcaattc 2760
aaatttatgt gtgtgaccac atgaattgta attaagctaa aattgtgtga atttttgcag 2820
cttcccaaca tcctgggctt cacattcggt gtggtccaga tggggctcta cgtgttctac 2880
atgaacgcga cgccggtggc cggcgagggg aaagaaggga aggggaagct ggcggcggcg 2940
gaggagctcc ccgtcgtcgt caacgtcggc aagctcgccg ccgccacgcc cgacaggagc 3000
accggcgccg tgcacgtgca cccagtcccg aggagctgcg cggcggaggc ggcggcggcc 3060
gagccggagg tgctcgtcga cattccgccg ccgccgccgc cgcgcgccgt cgaggtggcc 3120
gccgtgtagg gtccccggcc ggtcaacgcg tgcttgcatg ggccatgcac gtgtgcagta 3180
ccacgtgcca cgtacacttt aatatgaact ccagggcaaa cttggaggag acaagctacc 3240
accaattaat taacttaatt attattactc atctttccca aaatataatt acttttagcc 3300
tctaaaattt atctcaaaat atagcaactt cttcacctat attctcttat aaaacaatcg 3360
taaccttcca ttaattaaat ttcttacata tatatttctc ctcttatcaa tcaatcccaa 3420
ctgccttttt ttttcatttt attcctgtaa ctttcgtaat atatccgtat atcctatcta 3480
aaacttatta tattttggga tggtgatggt attatatatc tttcttgcat gccatgcaac 3540
tagagacggg ggaagctatg tgtaatgtat gtgcatgtgt ttctctggtg ttggtttccg 3600
cttctgttgt attcatttgt atcggtcaat gggtatctat tattcctaat tagttccttg 3660
tacttgtaat gtatgtcaaa attaataaaa atgtaatcga taaatatctc ttctatcaat 3720
tgtgaaatac tcatgcaca 3739
<210> 2
<211> 3500
<212> DNA
<213> CR-S13-1 基因(CR-S13-1 gene)
<400> 2
caattatctt tttctccgcg attaatattt ttcgagtagt aaaatttaag tcaaaagccg 60
tatcaggatt caggaataat ccttcactgg gagagatctc atgtgatttg ctgttgcact 120
cggcggctat cttttaccgt tcccagcagg aagctgcaga cgttggagag atcgatctct 180
actgacaatg cacaaagcaa ttactcacta aattggctat ggctagtgag aggtgcgctg 240
cgcacaaagc caatgcaact ttttttgaaa attagccagg attatctcca acagtagctc 300
atttttgtaa aagcctaatt attgtgcgtg tccaaaagac tttcctcaaa agcaaataaa 360
gaaaaaaaat ctttgcataa ttattctatg attactttga tgcgtacgtg aatggccatg 420
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agcttttgcc ttcggcctcc ttggtatatc atcatcacct accacaacta agacattccc 540
ttcattgcca acattttact tctttttatt agaaaccatt gagtttgtac atataagctc 600
agagttatta cttgctggca gatacgcata gctagcgacg acatttagtg aggattacac 660
tttagtggtc atcatatata aaataataaa attgttgtgt ttctttattt gttttttatt 720
ttctagctag cttctttcag ttattttcaa caaaaagaat ttcttctagc acttttattt 780
acagcagttt attatgtcta tttgggcata ttaattagct actagcgcat aagctaaaaa 840
ccctactagc cttccgaagg caatatggat ggtactcttg tagtaataag ccaaaagcta 900
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aatgagatgc acatagccat ataatttttc tgcttcttgt taaactatat atatacagca 1080
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tactctaatt aatgacatca tagtgcacca tgtaacacaa taatttaaag aacaagttaa 1260
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actgcctttt tttttcattt tattcctgta actttcgtaa tatatccgta tatcctatct 3240
aaaacttatt atattttggg atggtgatgg tattatatat ctttcttgca tgccatgcaa 3300
ctagagacgg gggaagctat gtgtaatgta tgtgcatgtg tttctctggt gttggtttcc 3360
gcttctgttg tattcatttg tatcggtcaa tgggtatcta ttattcctaa ttagttcctt 3420
gtacttgtaa tgtatgtcaa aattaataaa aatgtaatcg ataaatatct cttctatcaa 3480
ttgtgaaata ctcatgcaca 3500
<210> 3
<211> 3740
<212> DNA
<213> CR-S13-2 基因(CR-S13-2 gene)
<400> 3
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actgacaatg cacaaagcaa ttactcacta aattggctat ggctagtgag aggtgcgctg 240
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accagggatg ctgcagggac aggccagcca tttttgtgtg ctaaaagggg ggtaattgaa 540
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gcttggaact tgtcacagac acacacactc taaccctaga ccccctttgt ggagggaagg 660
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ggcttttgcc ttcggcctcc ttggtatatc atcatcacct accacaacta agacattccc 780
ttcattgcca acattttact tctttttatt agaaaccatt gagtttgtac atataagctc 840
agagttatta cttgctggca gatacgcata gctagcgacg acatttagtg aggattacac 900
tttagtggtc atcatatata aaataataaa attgttgtgt ttctttattt gttttttatt 960
ttctagctag cttctttcag ttattttcaa caaaaagaat ttcttctagc acttttattt 1020
acagcagttt attatgtcta tttgggcata ttaattagct actagcgcat aagctaaaaa 1080
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tggctttgca ggcaacctca taatccttca cgacctatct ggcaccaatg taagtaactg 1740
aatttctaca tgatatatac atatatagct tttgtgtaat tttaattccc aatccgcacc 1800
gcgttccgta tccgataata tatgtgcata atattttatg cagcccgacg ttctaccgga 1860
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gcgccatgct gtggatcttc tacgcgctga tcaagtccaa cgaggccctc ctcatcacca 1980
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ccaagaaggc caaggttcga tccatgtcat ccaaacccta gcactaccac agaaacccta 2100
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acgtcgtttt tgcaggtgtt cacgacgaag atcctgctgc tgctgaacgt gggggtgttc 2340
ggggtgatcc tgctgctgac gctgctgctc tcccatggcg agcagcgcgt cgtctccctc 2400
ggctgggtct gcgtcgcctt ctccgtcagc gtctttgtcg cgccgctcag catcatcgta 2460
tgtgcatata tacgatcagt cgtcgtcaat ctctagctag ctcatcttta cttcgtgtct 2520
tggtttgatc gatcgatctc gttgctaact gaactgcttc catggacgat ggatgcgata 2580
ttgcagaagc gagtgatcca gtcgaggagc gtggagtaca tgcccttctc cctctccctc 2640
acgctcaccc tcagcgccgt cgtctggttc ctctacggcc ttctcatcaa ggacaaatac 2700
gtcgcggtaa ttattcaatc aattacctaa ttatttcttc aaatcacaaa ctgctcaatt 2760
caaatttatg tgtgtgacca catgaattgt aattaagcta aaattgtgtg aatttttgca 2820
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ggaggagctc cccgtcgtcg tcaacgtcgg caagctcgcc gccgccacgc ccgacaggag 3000
caccggcgcc gtgcacgtgc acccagtccc gaggagctgc gcggcggagg cggcggcggc 3060
cgagccggag gtgctcgtcg acattccgcc gccgccgccg ccgcgcgccg tcgaggtggc 3120
cgccgtgtag ggtccccggc cggtcaacgc gtgcttgcat gggccatgca cgtgtgcagt 3180
accacgtgcc acgtacactt taatatgaac tccagggcaa acttggagga gacaagctac 3240
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ctctaaaatt tatctcaaaa tatagcaact tcttcaccta tattctctta taaaacaatc 3360
gtaaccttcc attaattaaa tttcttacat atatatttct cctcttatca atcaatccca 3420
actgcctttt tttttcattt tattcctgta actttcgtaa tatatccgta tatcctatct 3480
aaaacttatt atattttggg atggtgatgg tattatatat ctttcttgca tgccatgcaa 3540
ctagagacgg gggaagctat gtgtaatgta tgtgcatgtg tttctctggt gttggtttcc 3600
gcttctgttg tattcatttg tatcggtcaa tgggtatcta ttattcctaa ttagttcctt 3660
gtacttgtaa tgtatgtcaa aattaataaa aatgtaatcg ataaatatct cttctatcaa 3720
ttgtgaaata ctcatgcaca 3740
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagaggaatg aagggagttg gttttagagc tagaaat 37
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caactccctt cattcctctc tgccacggat catctgc 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggccgaagg caaaagccca gttttagagc tagaaat 37
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgggcttttg ccttcggcct caacacaagc ggcagc 36
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gataggtcgt gaaggatatg gttttagagc tagaaat 37
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catatccttc acgacctatc cggcagccaa gccagca 37
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcgtgggtc tcgtcttcac tccatccact ccaagctc 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcgtgggtc tcgtcttcac tccatccact ccaagctc 38
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cactcggcgg ctatctttta cc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aacccctccg tcgacttgct ct 22

Claims (4)

1.一种提高水稻产量的方法，其特征是，包括通过CRISPR/Cas9技术编辑OsSWEET13基因，在OsSWEET13基因的第一外显子和第二外显子的第一靶点和第二靶点之间有240个碱基缺失，在第三个靶点插入一个A碱基；或者在第一个靶点和第二个靶点之间有238个碱基片段被反向，在第三个靶点上有一个A碱基插入；
所述第一个靶点：5’-GAGAGGAATGAAGGGAGTTG-3’，位于chr12:17305328..17305347；
第二个靶点：5’- AGGCCGAAGGCAAAAGCCCA-3’，位于chr12:17305088..17305107；
第三个靶点：5’- GATAGGTCGTGAAGGATATG-3’，位于chr12: 17304108.. 17304127。
2.OsSWEET13基因突变体CR-S13-1，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.OsSWEET13基因突变体CR-S13-2，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求2或3所述的OsSWEET13基因突变体在提高水稻产量的方法中应用。
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利用CRISPR/Cas9技术对水稻百叶枯病感病相关基因HW3进行低定点修饰及功能分析;郝巍;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20170215(第2期);第1-59页 *

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