CN104293723A - 一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法 - Google Patents

一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种操纵子 bacABC 拷贝数倍增和敲除 recA 基因的地衣芽孢杆菌DW2△ recA / bacABCs ，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6月12日。该菌株的基因组同时具有操纵子 bacABC 拷贝数倍增和敲除 recA 基因双重特性，并且，该菌株操纵子 bacABC 拷贝数倍增和敲除 recA 基因的地衣芽孢杆菌应用于杆菌肽生产中，可使杆菌肽产量提高11.5%。

Description

一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。 
背景技术
杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。 
 目前，杆菌肽主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其通过微生物发酵法生产。 
杆菌肽是通过硫模板机理缩合氨基酸而成的，而操纵子bacABC为编码杆菌肽合成过程中三个关键酶的基因。理论上来说，操纵子bacABC编码的肽合成酶的增多将有利于杆菌肽的合成，根据中心法则，即DNA的信息通过转录和翻译最终表现在蛋白质上，增加操纵子bacABC在菌体的拷贝数，从而提高bacABC的表达。但是，由于操纵子bacABC基因序列过长，约42kb，故无法构建含有如此大基因片段的质粒表达载体，也就无法以构建游离型或整合型质粒表达载体的方式来实现操纵子bacABC拷贝数的倍增，因此，操纵子bacABC的拷贝数增加变得极为困难。另外，recA基因为编码细菌DNA重组蛋白的基因，染色体上存在的同源序列在细菌DNA重组蛋白的作用下会进行交换重组，对菌株保持拷贝数的稳定性不利。 
发明内容
本发明旨在提供一种能够高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌及其构建方法，此地衣芽孢杆菌的基因组同时具有操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的双重特性。  
一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs （简称为：Bacillus licheniformis DW2△recA/ bacABCs），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。此菌株的基因组同时具有操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因双重特性，生产杆菌肽的能力强。
一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤： 
（1）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；  
（2）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和bacABC上、下游同源臂基因片段，同时，以载体pHY300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段；
（3）将这5个基因片段融合，得到融合DNA片段，具体操作为：以bacABC上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过soe-PCR（即重叠延伸PCR）得到第一融合片段，同时，以bacABC下游同源臂和启动子为模板，通过soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正确排列顺序为：bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；
（4）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamHI对融合DNA片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段；
（5）将酶切后的融合片段与步骤（1）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到整合质粒T2（2）-ori-bacABCs，将整合质粒T2（2）-ori- bacABCs通过电转化转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过45℃和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经PCR验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正确排列序列为：启动子—bacABC 开放阅读框（简称：bacABCORF）—bacABC终止子—bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；
（6）采用四环素浓度梯度升高的培养基对整合菌株进行bacABC的诱导倍增，得到bacABC拷贝数扩增的整合菌株；
（7）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；
（8）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出recA同源臂，recA同源臂经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切，并将酶切后的recA同源臂与步骤（7）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到recA敲除质粒T2（2）-ori-recA；
（9）将质粒T2（2）-ori- recA通过电转化转入步骤（6）得到的bacABC拷贝数扩增的整合菌株中，经卡那霉素筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经45℃和卡那霉素抗性双重筛选，PCR验证得到recA基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs。
本发明的有益技术效果为： 
（1）本发明的整合质粒并不含有操纵子bacABC的开放阅读框，即并不能仅仅通过将整合质粒转入菌株内实现操纵子bacABC的倍增，但是，本发明的整合质粒中含有启动子基因片段，本发明通过将此含有启动子基因片段的整合质粒转入菌株内，以启动子基因片段为同源区域，利用菌株本身的同源重组交换功能，成功得到了bacABC阅读框倍增（即操纵子bacABC拷贝数倍增）的地衣芽孢杆菌菌株；
（2）本发明的融合DNA片段中还含有四环素抗性基因片段，此四环素抗性基因片段同启动子一起整合进入菌株的基因组内，随着bacABC开放阅读框的倍增而倍增，这为bacABC拷贝数扩增的整合菌株的筛选提供了有利的条件；
（3）本发明的采用质粒T2（2）-ori作为载体，由于质粒T2（2）-ori含有一个温敏型复制子，在37℃时质粒可正常复制，45℃质粒无法进行复制，故，它也为bacABC拷贝数扩增的整合菌株以及地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs的筛选提供了有利的条件；
（4）在对淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段进行整合时，本申请人将这5个基因片段同时进行soePCR时，反复多次均得不到所需排列顺序的融合DNA片段，为了克服此问题，本申请人经过无数次试验，最终确定采用分段整合（即上游同源臂与淀粉酶终止子相连，下游同源臂与启动子相连，得到的两个片段再与四环素基因片段相连）的方式，最终成功得到了所需排列顺序的融合DNA片段；
（5）在菌株基因组中的bacABCORF后仅插入bacABC上游同源臂—四环素基因——启动子—bacABC下游同源臂基因片段时，由于所获得的bacABC拷贝数扩增的整合菌株基因组中bacABCORF与下一个bacABCORF相距过于接近，会破坏bacABC终止子区，从而对菌株的操纵子bacABC造成结构上的影响，为了克服此问题，本申请人在构建整合PCR片段时，加入了淀粉酶终止子基因片段；
（6）与现有技术中的地衣芽孢杆菌DW2相比，本发明的菌株使菌体杆菌肽效价提高了11.5%。
进一步的，为了提高上述步骤（3）中融合DNA片段的成功率，上述步骤（3）的中融合DNA片段对应的soePCR体系的反应条件均为： 
1）预变性：95℃   5min；
2）第1阶段融合：
变性：95℃   30sec，退火：50℃   30sec，延伸：72℃   60sec，循环8次；再延伸：72℃   5min；
3）第2阶段融合：
变性：95℃   30sec，退火：55℃   30sec，延伸：72℃  90 sec
循环30次；再延伸：72℃   5min；
4）终止：10℃   5min。
本发明的融合DNA片段对应的soePCR体系分2个阶段进行融合，且，第1、2阶段融合对应的退火温度分别为50、55℃，避免了淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段在整合时，由于各个基因片段长短不一、所需退火温度不同，造成融合DNA片段成功率低的问题。 
本发明的操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌的应用，其应用于杆菌肽生产。 
附图说明
图1为质粒T2（2）-ori的结构示意图，其中，图1中的Kan为卡那霉素抗性基因，XbaⅠ和BamH I分别为限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I的酶切位点； 
图2为整合质粒T2（2）-ori-bacABCs的结构示意图，其中，图2中的bacABC-L为bacABC上游同源臂，Amy terminator为淀粉酶终止子，Tet抗性基因为四环素抗性基因片段，bacABC Promoter为启动子，bacABC-R为bacABC下游同源臂，Kan为卡那霉素抗性基因；
图3为recA敲除质粒T2（2）-ori-recA的结构示意图，其中，图3中的recA为recA同源臂，Kan为卡那霉素抗性基因，Spe I和Sac I分别为限制性DNA内切酶Spe I和Sac I的酶切位点；
图4为DW2/bacABCs的实时荧光定量PCR测定结果图；
图5为现有技术中的地衣芽孢杆菌DW2与本发明的地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs的杆菌肽效价对比图。
具体实施方式
一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs （简称为：Bacillus licheniformis DW2△recA/ bacABCs），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。此菌株的基因组同时具有操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因双重特性，生产杆菌肽的能力强。 
一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤： 
（1）质粒T2（2）-ori（其结构示意图，如图1所示）经过限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒。 
（2）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和bacABC上、下游同源臂基因片段，同时，以载体pHY300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段； 
其中，bacABC上游同源臂的扩增引物为：
上游引物（UP-F）：CGCGGATCCAAGAATTGAACCGGCAAG，
下游引物（UP-soe-R）：
CTCTCTGCTCTTCTATCTTAAGGATGCCGTTTTGTTC；
淀粉酶终止子的扩增引物为：
上游引物（Amy-soe-F ）: 
GAACAAAACGGCATCCTTAAGATAGAAGAGCAGAGAG，
下游引物（Amy-soe-R）：
TCAAATCGCCTTCTTCTGGATCACCCGCGATACCGTC；
四环素抗性基因片段的扩增引物为：
上游引物（Tet-soe-F ）：
GACGGTATCGCGGGTGATCCAGAAGAAGGCGATTTGA，
下游引物（Tet-soe-R）：
TTCTTCATAGTTTCCAGGTGCCTGTTATAAAAAAAGGATC；
启动子的扩增引物为：
上游引物（Pbac-soe-F）：
GATCCTTTTTTTATAACAGGCACCTGGAAACTATGAAGAA，
下游引物（Pbac-soe-R）：
CAAAAGGCACCCTGAAAAGTTCTATCATTCCCTTTCG；
bacABC下游同源臂的扩增引物为：
上游引物（DOWN-soe-F）：
CGAAAGGGAATGATAGAACTTTTCAGGGTGCCTTTTG，
下游引物（DOWN-R）：CTAGTCTAGACCTCAGCATGGCTTTGAT。
所述的PCR的扩增体系均为： 
Buffer：   5μL；dNTP:     2.5μL；Fastpfμ：  0.5μL；引物1:     1μL；引物2:     1μL；DNA：    1μL；水：      14μL，引物1和引物2为分别对应为待扩增基因片段的上、下游引物。
所述的PCR的扩增条件均为： 
1）预变性：95℃   5min
2）变性：95℃   30sec ，退火：55℃   30sec，延伸：72℃   60 sec
循环30次
3）再延伸：72℃   5min
4）终止：10℃   5min。
（3）将这5个基因片段融合，得到融合DNA片段，具体操作为：以bacABC上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过soe-PCR（即重叠延伸PCR）得到第一融合片段，同时，以bacABC下游同源臂和启动子为模板，通过soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正确排列顺序为：bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂； 
其中，第一融合片段的扩增引物为：
UP-F：CGCGGATCCAAGAATTGAACCGGCAAG，
Amy-soe-R：
TCAAATCGCCTTCTTCTGGATCACCCGCGATACCGTC；
    第二融合片段的扩增引物为：
Pbac-soe-F：
GATCCTTTTTTTATAACAGGCACCTGGAAACTATGAAGAA，
DOWN-R：CTAGTCTAGACCTCAGCATGGCTTTGAT；
融合DNA片段的扩增引物为：
UP-F：CGCGGATCCAAGAATTGAACCGGCAAG，
DOWN-R：CTAGTCTAGACCTCAGCATGGCTTTGAT。
所述的第一、二融合片段对应的soePCR的扩增条件均为： 
1）预变性：95℃   5min；
2）变性：95℃   30sec，退火：50℃   30sec，延伸：72℃   60sec
循环8次；
3）再延伸：72℃   5min；
4）终止：10℃   5min。
所述的融合DNA片段对应的soePCR的扩增条件为： 
1）预变性：95℃   5min；
2）第1阶段融合：
变性：95℃   30sec，退火：50℃   30sec，延伸：72℃   60sec，循环8次；再延伸：72℃   5min；
3）第2阶段融合：
变性：95℃   30sec，退火：55℃   30sec，延伸：72℃  90 sec
循环30次；再延伸：72℃   5min；
4）终止：10℃   5min。
（4）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamHI对融合DNA片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段； 
其中，XbaⅠ和BamHI双酶切体系为：
   XbaⅠ：           3μL
BamH I：          3μL
10×M buffer：     6μL
DNA片段或质粒： DNA片段40μL或者质粒20μL
水：              补水至总体积60μL；
XbaⅠ和BamHI双酶切条件为：37℃，8小时
XbaⅠ和BamHI均为限制性DNA内切酶，10×M buffer为配套的限制性内切酶缓冲液。XbaⅠ和BamHI以及10×M buffer均购自宝生物工程（大连）有限公司。
（5）将酶切后的融合片段与步骤（1）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到整合质粒T2（2）-ori-bacABCs（其结构示意图，如图2所示），将整合质粒T2（2）-ori- bacABCs通过电转化转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过45℃和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经PCR验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正确排列序列为：启动子—bacABC 开放阅读框（简称：bacABCORF）—bacABC终止子—bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；此步骤中所涉及到的酶切后融合片段与线性T2（2）-ori质粒的连接、整合质粒T2（2）-ori-bacABCs转入地衣芽孢杆菌DW2、卡那霉素筛选的具体实施方式均为本领域的公知常识，在此不做赘述。 
45℃和卡那霉素抗性双重筛的具体操作为： 
1）将实施例2所得菌株DW2（T2（2）-ori-bacABCs）混合接种于5ml液体LB培养基中，45℃振荡培养12h, 再转接与5ml液体LB培养基中，45℃振荡培养12h；取上述菌液进行稀释，然后涂布与固体LB平板上，37℃培养16h，使其长出单菌落；
2）将上述单菌落用无菌牙签挑起，分别点种到卡纳霉素抗性平板和LB平板上的对应位置，37℃培养16h；
3）挑取在LB平板上生长，而在卡纳霉素抗性平板上不生长的菌落，然后以引物：
bacABC验-F：CATTCCATCCGCAAACAG、
bacABC验-R：CGATTGTTCATCGGAGCG，进行PCR验证。
PCR反应条件为： 
①预变性：95℃ 10min；
②变性：95℃ 30 sec，退火：55℃ 50 sec，延伸：72℃ 4 min，
30个循环；
③再延伸：72℃ 10 min；
能扩增出4.5kb左右条带的菌落即为大片段整合成功的菌株，即具有正确排列序列的整合菌株，命名为地衣芽孢杆菌DW2/bacABC。
（6）采用四环素浓度梯度升高的培养基对整合菌株进行bacABC的诱导倍增，得到bacABC拷贝数扩增的整合菌株。例如，bacABC开放阅读框的拷贝数增加1次，所对应的整合菌株的染色体排序为：启动子—bacABCORF—bacABC终止子—bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABCORF—bacABC终止子—bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂； 
具体步骤为：将上述整合菌株单菌落接至 5mL LB （含有 20μg/mL 四环素）培养基中，37℃，180 r/min 振荡培养 12 h 后，取 100 μL 菌液转接至 5  mL LB（含有 30 μg/mL 四环素）培养基中继续培养，重复上述步骤，每次转接时增加四环素的浓度 10 μg/mL，直至 四环素浓度为80 μg/mL 时结束诱导倍增操作，并以诱导后的菌株基因组为模板，使用实时荧光定量PCR（简称qPCR）确定其拷贝数（如图4所示），bacAB拷贝数增加的菌株命名为DW2/bacABCs，从图4可知，实时荧光定量PCR测定的bacABC拷贝数相对定量值（RQ）为5，而现有技术中的地衣芽孢杆菌DW2仅为1，即，相对于地衣芽孢杆菌DW2来说，此菌株DW2/bacABCs的基因组中 bacABC开放阅读框的拷贝数增加了4次。
其中，qPCR的扩增引物为： 
BAC-RT-F: CCTGCTAAGCGGAGAC、
BAC-RT-R: TACCCGCTTGCTACCC、
IR-RT-F: TGCATACCTTGCCCAATCCT、
IR-RT-R: TCTTCCTTGCTCATGGCGTC；
qPCR的反应体系为：
Tag mixture                 5 μL、
引物F+R                 0.5 μL、
模板DNA                  1 μL、
水                       3.5 μL；
qPCR反应条件：
1）预变性：95℃ 5min ，
2）变性：95℃ 20 sec，退火：58℃ 15 sec，延伸：72℃ 30 sec，
40个循环 ；
qPCR反应中使用的Tag mixture来自英潍捷基（上海）贸易有限公司的SYBR SELECT MASTE MIX 试剂盒，反应的进行与结果的检测分析使用的是ABI 96孔实时荧光定量PCR仪。
（7）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；其酶切体系和酶切条件均与步骤（4）相同，XbaⅠ和BamHI也是限制性DNA内切酶，XbaⅠ和BamHI均购自宝生物工程（大连）有限公司。 
（8）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板， PCR扩增出recA同源臂，recA同源臂经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切，并将酶切后的recA同源臂与步骤（7）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到recA敲除质粒T2（2）-ori-recA（其结构示意图，如图3所示）； 
其中，recA同源臂的扩增引物为：
上游引物（RecA-F）： GGACTAGTCTGCCAAATACGGCTGCCATCT
下游引物（RecA-R）：CCGAGCTCTGTCCGCCCTGCTGCT；
    酶切后的recA同源臂与步骤（7）得到的线性T2（2）-ori质粒的具体连接步骤均为本领域的公知常识，在此不做赘述。
（9）将质粒T2（2）-ori- recA通过电转化转入步骤（6）得到的bacABC拷贝数扩增的整合菌株中，经卡那霉素筛选，得到具有卡那霉素抗性的转化子，转化子再经45℃和卡那霉素抗性双重筛选，PCR验证得到recA基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs。地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs的染色体排序为： recA部分基因—recA同源臂—T2（2）—recA同源臂—剩余的recA部分基因（其中，T2(2)指T2（2）-ori- recA除recA同源臂外的其余部分基因），从而致使recA基因插入失活。 
其中，质粒T2（2）-ori-recA转入步骤（6）得到的bacABC拷贝数扩增的整合菌株中的具体实施方式为本领域的公知常识，筛选具有卡那霉素抗性的转化子，抽提质粒，利用下述引物： 
T2-L：ATGTGATAACTCGGCGTA、
T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC，进行PCR扩增验证。
PCR反应条件: 
1）预变性：95℃，5 min；
2）变性：95℃ 30 sec，退火：55℃ 50 sec，延伸：72℃ 45 sec，
30个循环；
3）再延伸：72℃，10 min。
选取能扩增出75bp左右条带的菌株，命名为地衣芽孢杆菌DW2/bacABCs（T2（2）-ori-recA）［简称Bacillus licheniformis  DW2/bacABCs（T2（2）-ori-recA）］。 
按照步骤（5）中45℃和卡那霉素抗性双重筛的具体操作的步骤 
1）、2）、3）中的方法进行培养，挑取在LB平板上生长，而在卡纳霉素抗性平板上不生长的菌落，然后以引物：
recA验-F：TCTGCGGTGCGAAAGCG、
recA验-R：CCGAGCTCTGTCCGCCCTGCTGCT，进行PCR验证。
PCR反应条件: 
1）预变性：95℃ 10min；
2）变性：95℃ 30 sec，退火：55℃ 50 sec，延伸：72℃ 45 sec，
30个循环；
3）再延伸：72℃ 10 min；
能扩增出770 bp左右条带的菌落即为recA基因成功敲除的菌株，命名为地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs（Bacillus licheniformis DW2△recA/bacABCs）。
当然，本发明的构建方法中步骤（3）的融合DNA片段所对应的soePCR也可采用单段融合和单一退火温度的方式来进行，但是，得到正确排列序列的融合DNA片段的时间较长，成功率较低。 
本发明所涉及到的DNA回收均采用上海赛百盛基因技术有限公司生产的PCR产物纯化及胶回收试剂盒（树脂型）进行回收。 
所述的地衣芽孢杆菌DW2（简称：Bacillus licheniformis DW2），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011344，保藏日期为2011年10月12日。 
本发明的操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌的应用，其应用于杆菌肽生产。 
衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs在杆菌肽发酵中的应用步骤包括： A菌种活化，B摇瓶发酵。 
所述步骤A菌种活化的菌种活化培养基配方为（g/L）：酵母粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%， pH 7.0-7.4。 
所述步骤A菌种活化的培养条件为从甘油管以体积百分比1%接种于装有5ml 液体LB培养基的PA瓶中，180～300rpm，37℃，10～14h。 
所述步骤B摇瓶发酵的发酵培养基配方为（g/L）：豆粕 100、玉米淀粉 45、CaCO3  6.0、 (NH4)2SO4  1.0。 
所述步骤B发酵培养基的培养条件为250 mL三角瓶发酵培养基的装液量为20 mL，将经步骤A菌种活化后的菌液以体积百分比2% 接种后180 r/min，37℃培养48 h。采用高效液相色谱法测定发酵液杆菌肽效价（如图5所示），从图5可看出，地衣芽孢杆菌DW2相对应的杆菌肽效价为935U，本发明的地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs对应的杆菌肽效价为1013U，即，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌DW2来说，本发明的地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs经发酵后的杆菌肽效价提高了11.5%。 

Claims (4)

1.一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。
2.一种权利要求1所述的一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：
（1）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；  
（2）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和bacABC上、下游同源臂基因片段，同时，以载体pHY300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段；
（3）将这5个基因片段融合，得到融合DNA片段，具体操作为：以bacABC上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过soe-PCR（即重叠延伸PCR）得到第一融合片段，同时，以bacABC下游同源臂和启动子为模板，通过soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正确排列顺序为：bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；
（4）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I对融合DNA片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段；
（5）将酶切后的融合片段与步骤（1）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到整合质粒T2（2）-ori-bacABCs，将整合质粒T2（2）-ori- bacABCs通过电转化转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过45℃和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经PCR验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正确排列序列为：启动子—bacABC 开放阅读框—bacABC终止子—bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；
（6）采用四环素浓度梯度升高的培养基对整合菌株进行bacABC的诱导倍增，得到bacABC拷贝数扩增的整合菌株；
（7）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；
（8）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出recA同源臂，recA同源臂经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切，并将酶切后的recA同源臂与步骤（7）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到recA敲除质粒T2（2）-ori-recA；
（9）将质粒T2（2）-ori- recA通过电转化转入步骤（6）得到的bacABC拷贝数扩增的整合菌株中，经卡那霉素筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经45℃和卡那霉素抗性双重筛选，PCR验证得到recA基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs。
3.根据权利要求2所述的一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征在于：步骤（3）的中融合DNA片段对应的soePCR体系的反应条件均为：
1）预变性：95℃   5min；
2）第1阶段融合：
变性：95℃   30sec，退火：50℃   30sec，延伸：72℃   60sec，循环8次；再延伸：72℃   5min；
3）第2阶段融合：
变性：95℃   30sec，退火：55℃   30sec，延伸：72℃  90 sec
循环30次；再延伸：72℃   5min；
4）终止：10℃   5min。
4.根据权利要求1所述的一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于：其应用于杆菌肽生产中。
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