ES2543167T3 - Microorganismos con mayor actividad de sacarosa mutasa - Google Patents

Abstract

Célula microbiana con una tasa de síntesis de isomaltulosa como mínimo 2 veces mayor que con el tipo natural, la cual presenta en el genoma un gen smuA que codifica una sacarosa mutasa SmuA, de manera que al menos un elemento promotor de smuA es reemplazado por al menos 5 otro promotor (promotor sucedáneo) elegido entre: a) un promotor endógeno del gen de la 3,4-dihidroxi-2-butanon-4-fosfato sintasa (ribB) b) un promotor homólogo del promotor endógeno según a) procedente de una cepa donante ajena y c) un fragmento funcional del promotor a) o b), donde el promotor sucedáneo está caracterizado por un polinucleótido elegido del grupo formado por moléculas polinucleótidas con una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº: 2 hasta SEQ ID Nº: 3 y secuencias homólogas de las mismas con al menos un 85% de coincidencia.

Description

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variante preferida el vector de la presente invención sirve para infiltrar el casete de expresión de la sacarosa mutasa en el genoma cromosómico de la célula huésped.

También es objeto del segundo aspecto de la presente invención un método para preparar una célula recombinante según la presente invención capaz de transformar sacarosa en isomaltulosa o composiciones de isomaltulosa, que consta al menos de las siguientes etapas: en una primera etapa se prepara una cepa de tipo natural de la célula; en una segunda etapa se pone en contacto esta cepa con al menos una de las moléculas polinucleótidas de la presente invención, en concreto con el casete de expresión de la sacarosa mutasa, y/o con al menos uno de los vectores anteriormente caracterizados, en concreto con el vector de expresión de la sacarosa mutasa. Entonces la molécula polinucleótida y/o el vector se integran preferentemente en la célula de forma expresable.

En este contexto también figura el empleo de las moléculas polinucleótidas, de los promotores sucedáneos y sus fragmentos o de los casetes de expresión completos, anteriormente caracterizados, para obtener una célula de la presente invención; por tanto una cepa autoclonada según el primer aspecto de la presente invención y una célula recombinante según el segundo aspecto de la presente invención.

En este contexto también figura el uso del vector anteriormente caracterizado, por tanto un plásmido de intercambio según el primer aspecto de la presente invención y un vector de expresión según el segundo aspecto de la presente invención, para obtener dicha célula.

Por último la presente invención también se refiere a métodos de preparación biotecnológica de isomaltulosa y/o de una composición de isomaltulosa a partir de un substrato de sacarosa o que contiene sacarosa. Según la presente invención el método consta al menos de la siguiente etapa: cultivo de la célula en un medio que contiene el substrato y en unas condiciones que permiten la transformación del substrato en isomaltulosa, preferiblemente mediante el uso de la sacarosa mutasa homóloga (SmuA) propia de la célula. Preferiblemente, en una etapa preferentemente subsiguiente, la isomaltulosa o la composición de isomaltulosa se aísla del medio de cultivo y/o de la célula.

La expresión de la sacarosa mutasa en las células huésped según la presente invención tiene la ventaja de ser independiente o muy independiente de la concentración de sacarosa y la presente invención permite el cultivo de las células huésped de la presente invención, es decir la formación de biomasa en un medio de glucosa (fuente de C).

En el contexto de la presente invención se entiende por “composición de isomaltulosa” el producto de isomerización de la sacarosa, el cual contiene isomaltulosa en proporción muy predominante. Otros componentes son trehalulosa e isomelecitosa. Se entiende sobre todo la siguiente composición: 70 hasta 90% de isomaltulosa, 5 hasta 10% de trehalulosa, 0 hasta 0,5% de isomelecitosa, 0 hasta 0,2% de trisacáridos y 0 hasta 0,2% de sacáridos residuales.

Por consiguiente también es objeto de la presente invención el empleo de una célula según la presente invención, anteriormente definida, para la producción biotecnológica de isomaltulosa o de una composición de isomaltulosa, preferiblemente a partir de sacarosa o de un substrato que contenga sacarosa y según el método aquí descrito.

La presente invención se ilustra más detalladamente mediante las siguientes figuras y ejemplos, sin que éstos deban entenderse como una limitación:

La figura 1 ilustra la organización cromosómica anterior al gen smuA con secuencias reguladoras en la 5'-UTR (promotor, operador); SEQ ID Nº: 1: en esta región se pudo detectar un “marco de lectura abierto“ (ORF) de 234 aminoácidos que muestra homologías significativas con los llamados reguladores de transcripción del tipo GntR; el respectivo gen se designa en lo sucesivo como gntR. Entre gntR y smuA se halla una región intergenética de unos 400 pb que presenta elementos reguladores (promotor, operador) de la expresión de smuA (véase también la figura 3A). La figura 2 muestra ejemplos de tipos de vectores utilizables en la presente invención, el plásmido de “muchas copias” pUCTT-gusA (figura 2A) y el plásmido de “pocas copias” pSCTT-gusA (figura 2B) para la obtención de bancos de genes promotores de P. rubrum. Como gen indicador de promotor se usó preferentemente el gen de β-glucuronidasa gusA. Con preferencia se usaron las secuencias sucedáneas SEQ ID Nº: 2 hasta SEQ ID Nº: 11 (tabla 1A) junto con el plásmido de la figura 2A; las secuencias sucedáneas SEQ ID Nº: 12 hasta SEQ ID Nº: 21 (tabla 1B) junto con el plásmido de la figura 2B. La figura 3 muestra fragmentos de secuencias de ADN de la región intergenética entre la zona 3' del gen gntR recién encontrada que codifica un regulador de transcripción potencial de la familia GntR y la zona 5' del gen de sacarosa mutasa smuA de P. rubrum. Esta figura también ilustra la estrategia preferida de la presente invención para insertar promotores sucedáneos homólogos sin dejar huella: se selecciona un sitio de corte MunI situado naturalmente unos 35 pb antes del gen putativo de gntR. Además se usa preferiblemente una secuencia AAAC situada inmediatamente antes del sitio natural de unión del ribosoma (RBS) de smuA, que constituye una parte GTTT/AAAC del sitio de unión PmeI (figura 3B). Una introducción episomal de un fragmento intermedio en MunI/PmeI (figura 3B) permite la inserción dirigida de promotores sucedáneos. La figura 3C muestra el ejemplo de la inserción del promotor ribB -aquí también denominado 3C1 -sin dejar huella. En las figuras 3A–C están resaltadas las secuencias importantes.

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La figura 4 muestra como ejemplo un mapa vectorial del plásmido de intercambio de promotor pUT-GntR-Pr3C1-SmuA, producido preferentemente según la presente invención, que contiene la secuencia de intercambio según SEQ ID Nº: 2. La figura 5 ilustra esquemáticamente como ejemplo el proceso de preparación de los organismos de la presente invención: intercambio de la región promotora de smuA con un promotor homólogo por autoclonación. Basado en un vector preferiblemente no replicativo en la célula huésped de P. rubrum (p.ej. el vector de pUT) se construye preferentemente en E. coli un plásmido de intercambio de promotor que contiene el promotor sucedáneo. Éste se flanquea sin dejar huella entre un fragmento de ADN de unos 1000 pb de tamaño, que codifica el regulador putativo de gntR, y un fragmento de ADN de la región SmuA, de unos 1000 pb de tamaño, posterior al regulador putativo de gntR, que codifica la zona 5’ de SmuA. El plásmido producido se transfiere a la célula huésped, aquí

P. rubrum de tipo natural. Por selección, preferiblemente con kanamicina, se eligen aquellas colonias que llevan plásmidos de intercambio integrados en el cromosoma, preferentemente mediante al menos una de ambas regiones homólogas. La incubación en medio exento de kanamicina permite seleccionar cepas de intercambio de promotores en las cuales el plásmido integrado se desune nuevamente del cromosoma mediante un segundo entrecruzamiento (segundo paso de recombinación). De manera preferente estas colonias pueden detectarse fenotípicamente, como es sabido, por la falta de actividad de xylE tras la adición de catecol (no hay coloración amarilla). La obtención de la cepa de reorganización del promotor puede comprobarse a continuación usando métodos de biología molecular (p.ej. PCR) del modo ya conocido, para poder excluir asimismo la disgregación completa del plásmido de intercambio que conduce a la reconstrucción del tipo natural. La figura 6 muestra el desarrollo de la transformación del carbohidrato durante 24 horas en organismos según la presente invención (nº 3C1A) y en el tipo natural (WT).

El protocolo de secuencias contiene:

SEQ ID Nº: 1: secuencia de ADN antes del gen smuA, que contiene el promotor/operador natural de smuA, el cual se puede sustituir total o parcialmente por el promotor sucedáneo según la presente invención o por su fragmento funcional; SEQ ID Nº: 2 hasta 21: secuencia de promotores sucedáneos funcionales que pueden regular la expresión del gen smuA en la célula en lugar del promotor natural de smuA.

Para identificar los promotores fuertes frente al promotor natural de smuA tiene lugar preferiblemente según la presente invención un intercambio sin la introducción de nuevas secuencias no homólogas en el organismo. Para ello según la presente invención se procede básicamente del siguiente modo: se crea un plásmido de intercambio de promotores que contiene preferiblemente unas 1000 pb de una región de ADN antes y después del promotor de smuA. A continuación tiene lugar un intercambio sin dejar huella entre el promotor natural de smuA localizado en el plásmido, cuyo tamaño es de unas 400 pb, y otro promotor homólogo. El intercambio exacto de bases se puede confirmar, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN. El plásmido de intercambio de promotores resultante se transfiere al organismo y el plásmido se integra por recombinación homóloga en la unidad cromosómica de smuA. El intercambio de promotores tiene lugar preferentemente por eliminación simultánea del plásmido de intercambio, seleccionando específicamente el segundo paso de recombinación.

Si es preciso, el intercambio correcto de promotores sin dejar huella y la ausencia de cualquier secuencia ajena en el organismo se puede verificar del modo conocido por métodos de PCR y/o de secuenciación. Mediante hibridación Southern se pueden obtener más seguridades.

Para el intercambio del promotor natural de smuA se selecciona preferentemente la región intergenética entre una zona codificadora de un regulador potencial de la expresión de la sacarosa mutasa y una zona codificadora de la sacarosa mutasa en el cromosoma bacteriano. El fragmento intermedio se elimina con especial preferencia por hidrólisis en las regiones MunI y PmeI. La inserción selectiva del promotor sucedáneo homólogo preferido según la presente invención tiene lugar en forma de fragmento MunI o EcoRI/PmeI.

Ejemplo 1: intercambio del promotor de smuA por autoclonación en P. rubrum

Todas las clonaciones y modificaciones de ADN se efectúan de la manera descrita por Sambrook y otros, 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY). De no indicarse lo contrario, las preparaciones de PCR, los kits de clonación de ácidos nucleicos, los métodos de detección y selección y los cultivos se llevaron a cabo del modo conocido, siguiendo las instrucciones del correspondiente fabricante.

1.1 Promotores homólogos de P. rubrum

El ADN cromosómico del P. rubrum de tipo natural se aísla y se digiere parcialmente con AluI. Los fragmentos se clonan en los sitios de corte StuI de dos vectores distintos promotor-sonda representados en la figura 2, que se diferencian básicamente por el número de copias: mientras el vector pUCTT-gusA es un derivado de pUC con gran número de copias que lleva el gen de resistencia al cloranfenicol cat de pBR328 (DSMZ, Braunschweig), el vector pSCTT-gusA es un vector con poco número de copias que proviene del conocido plásmido pSC101 (DSMZ,

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Braunschweig) y lleva el gen de resistencia a la kanamicina aphII. Como gen indicador de promotor se emplea en ambos vectores el gen gusA, el cual codifica una β-glucuronidasa y se expresa tras la inserción de un fragmento funcional del promotor.

Después de añadir el substrato ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico (X-Gluc) la expresión resultante se puede detectar por coloración azul (procedimiento según Platteeuw C. y otros, 1994, Appl Environ Microbiol. 60: 587–93). Mediante tres terminadores (Ter) se puede inhibir una expresión no deseada del gen indicador por parte de potenciales elementos promotores propios del plásmido. Ambos tipos de vector replican tanto en E. coli como en P. rubrum.

Para comprobar la función promotora de los fragmentos del promotor sucedáneo propios de la célula huésped, el gen cromosómico de β-glucuronidasa uidA presente naturalmente en E. coli se puede inactivar usando métodos conocidos del especialista, a fin de producir una cepa de ensayo gusA de E. coli DH10B∆uidA de E. coli.

La transformación del banco genético de pUCTT-gusA o de pSCTT-gusA de los promotores sucedáneos en la DH10B∆uidA de E. coli produce colonia azules en las cuales el gen indicador gusA sin promotor se expresa por medio del fragmento de promotor autoclonado.

El análisis de restricción del ADN plásmido aislado de colonia azules demuestra que los fragmentos cromosómicos de P. rubrum de distinto tamaño también tienen funciones promotoras.

Con la ayuda de la electroporación (preparación de células electrocompetentes y realización según Dower y otros, 1988, Nucleic Acids Res., 16: 6127–6145) se pueden transferir los clones según P. rubrum y se puede confirmar la actividad promotora ya detectada en E. coli.

1.2 Inserción de promotores sucedáneos sin dejar huella

Los promotores sucedáneos de la presente invención (SEQ ID Nº: 2 hasta 21) se intercambian respectivamente con la región del promotor/operador de smuA (véase SEQ ID Nº: 1 y 3ABC) mediante recombinación homóloga, sin dejar huella.

Esta preparación se basa en la integración cromosómica de un plásmido de intercambio de promotores mediante recombinación homóloga. Se prepara un vector base que no replica en P. rubrum, al menos condicionalmente. Se usan por ejemplo derivados de pUT basados en un origen de replicación R6K (Herrero y otros, 1990, J. Bacteriol.,

172: 6557–67). Estos vectores solo replican en presencia del gen pir, que codifica la proteína π esencial para la replicación. Una cepa de este tipo es la E. coli S17-1λpir (Herrero y otros, 1990, J. Bacteriol., 172: 6557–67), que se usa para construir los correspondientes plásmidos de intercambio de promotores.

Todos los plásmidos de intercambio de promotores basados en el vector de pUT según la presente invención se construyen de forma que el nuevo promotor sucedáneo intercambiado si dejar huella quede flanqueado arriba por un fragmento de ADN de 925 pb de tamaño, que codifica el regulador del gen gntR, y abajo por un fragmento de ADN de 1066 de tamaño, que codifica la región 5‘ de smuA. En la figura 3 está representada con detalle la estrategia de clonación, tomando como ejemplo el fragmento de promotor sucedáneo ribB (3C1). En la figura 4 está representado como ejemplo el plásmido final de intercambio de promotores (pUT-GntR-Pr3C1-SmuA'), que vehicula el intercambio del fragmento 3C1 con el promotor de smuA.

1.3 Producción de cepas de reorganización del promotor

Una vez preparados, los plásmidos de intercambio de promotores se transfieren a P. rubrum, preferentemente mediante una conjugación intergenética entre E. coli S17-1λpir y P. rubrum. Los plásmidos de pUT utilizados llevan un “origen de transferencia” (oriT) del plásmido RP4 y pueden moverse hacia P. rubrum mediante el plásmido RP4 integrado cromosómicamente en E. coli S17-λpir (Herrero y otros, 1990, J. Bacteriol., 172: 6557–67).

Las condiciones de la conjugación intergenética se optimizaron del modo siguiente: la selección de transconjugados potenciales de P. rubrum requiere un marcador seleccionable en P. rubrum (p.ej. aphII, resistencia a kanamicina) y la posibilidad de inhibir específicamente el donante de E. coli. Por aplicación sobre placa de agar con un medio que contiene rifamicina (100 µg/ml) se generan espontáneamente colonias de P. rubrum de tipo natural resistentes a la rifamicina, que por lo demás no se diferencian del tipo natural. La conjugación se lleva cabo de la manera siguiente:

Se cultivan por la noche en 5 ml de medio dYT (por litro: 16 g de Bacto triptona, 10 g de extracto de levadura Bacto y 5 g de NaCl) a 37ºC, añadiendo kanamicina (50 µg/ml), cepas donantes de E. coli S17-λpir que llevan el respectivo plásmido de intercambio de promotores. El recipiente P. rubrum también se cultivó por la noche en 5 ml de dYT con adición de rifamicina (100 µg/ml) a 30ºC. En matraces Erlenmeyer con 100 ml de medio dYT (véase composición arriba) se inoculó respectivamente 1 ml de este cultivo nocturno y se incubó a 30ºC (P. rubrum) o a 37ºC (E. coli)y 250 rpm hasta una DO (600 nm) de 0,4 a 0,8. Donante y recipiente se mezclaron en relación 1:4, se separaron por centrifugación, se lavaron con 1 ml de dYT y por último se recogieron en 100 µl de medio dYT. La suspensión se

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La tabla 3 muestra los resultados del análisis por HPLC de los sobrenadantes tras la fermentación en cultivo de sacarosa (S) o glucosa (G) de dos cepas de intercambio de promotores producidas individualmente (nº 3C1A y nº 3C1B) en comparación con el tipo natural (WT):

5 La cantidad de isomaltulosa producida en el cultivo de sacarosa (S) por las cepas 3C1 (3C1A2S y 3C1B2S) aumenta por un factor aproximado de 3,2 en comparación con el tipo natural respectivo (WT2S).

En el cultivo de glucosa (G) la diferencia es más marcada, pues bajo estas condiciones el SmuA solo se expresa en cantidades mínimas en el tipo natural (WT2G). En comparación con el cultivo de sacarosa las cepas de la presente

10 invención (3C1A2G, 3C1B2G) producen solo un 10% menos de isomaltulosa.

En el transcurso posterior de la fermentación (superior a 24 horas) se alcanza un rendimiento de isomaltulosa del 70 hasta el 90% y ocasionalmente superior al 90%.

15 2.3 Biotransformación celular completa en el fermentador

Se cultivaron en el mismo medio P. rubrum Z12 de tipo natural y las cepas de intercambio de P. rubrum producidas por autoclonación. El crecimiento del cultivo previo tuvo lugar en el matraz agitado a 30ºC en condiciones aeróbicas.

20 Se realizaron fermentaciones comparativas en unos fermentadores de 500 ml (de la firma Sixfors): medio nutriente: peptona de soja: 15,0 g; melaza (80ºBx): 20,0 g; (NH4)2HPO4: 2,0 g; sacarosa: 40,0 g; H2O hasta 1000 ml, pH 7,2– 7,4; parámetros de fermentación: tasa de aireación (inicio de la fermentación): 0,5 VVm; número de revoluciones del agitador: 500 rpm; pO2: 20%.

25 Los fermentadores se inocularon con 5 ml de un cultivo previo en fase exponencial de crecimiento. La fermentación en los fermentadores de 500 ml tuvo lugar bajo los parámetros arriba indicados durante 15 horas a 30ºC. Al final de las fermentaciones se separaron las células por centrifugación a 17.600 × g durante 30 minutos y se desechó el sobrenadante transparente. A continuación se determinó el rendimiento celular (biomasa seca) y su actividad de sacarosa mutasa.

30 La biomasa seca se determinó filtrando 10 ml de suspensión de la fermentación a través de un filtro de 0,45 µmy secando este filtro a 105ºC. Se llevaron a cabo respectivamente dos fermentaciones por cepa. El tipo natural produjo tras 15 horas de fermentación una biomasa seca de 85,1 ± 5,6 g/kg y la cepa de intercambio de promotores nº 3C1 tomada como ejemplo dio un rendimiento de 80,9 ± 1,0 g/kg. En base a estos datos no pudo observarse ninguna

35 diferencia significativa en el rendimiento de biomasa.

Para determinar la actividad de sacarosa mutasa se suspendió respectivamente 1 g de biomasa húmeda (BFM) del tipo natural y de las cepas autoclonadas según la presente invención en 50 g respectivamente de tampón de acetato de Ca 10 mmol/l que contenía 40% [p/v] de sacarosa. La suspensión celular se incubó durante 24 horas a 25ºC bajo

40 agitación y a diferentes intervalos se tomaron muestras que se analizaron por HPLC para determinar la sacarosa residual e isomaltulosa, trehalulosa, glucosa y fructosa.

En la figura 6 están representados los datos analíticos de formación de isomaltulosa a partir de una sacarosa al 40% en tampón de acetato de Ca 10 mmol/l a pH 5,5. Las muestras se tomaron a intervalos distintos y se analizaron para

45 determinar la composición de hidratos de carbono. La figura presenta la transposición de una sacarosa del 40% a isomaltulosa mediante la sacarosa mutasa del tipo natural (WT) frente a la cepa de intercambio de promotores nº 3C1A elegida como ejemplo. Tras un tiempo de incubación de 5 horas, con la sacarosa mutasa del tipo natural se pudieron detectar 150 g de isomaltulosa, pero con la cepa de intercambio de promotores nº 3C1A ya se pudieron detectar 320 g de isomaltulosa.

50 Mediante las cinéticas de transposición se pudieron calcular las siguientes actividades específicas: actividad del tipo natural: 1020 ± 17,8 unidades/g de biomasa seca; actividad de las cepas (nº 3C1A y nº 3C1B): 3118 ± 86,2 unidades/g de biomasa seca. La actividad de sacarosa mutasa en las cepas de intercambio de la presente invención aumentó aproximadamente en un factor de 3 frente al tipo natural.

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