KR20120095962A - 강화된 수크로스 뮤타제 활성을 가지는 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이소말툴로스(isomaltulose)와 이소말툴로스를 포함하는 조성물의 생명공학적 제조 및 개선된 수단, 특히 미생물 세포에 관한 것이다.

Description

강화된 수크로스 뮤타제 활성을 가지는 미생물{MICROORGANISMS HAVING ENHANCED SUCROSE MUTASE ACTIVITY}

본 발명은 이소말툴로스(isomaltulose)와 이소말툴로스를 포함하는 조성물의 생명공학적 제조에 관한 것이고, 이를 위한 개선된 수단, 특히 미생물 세포를 제공한다.

디사카라이드 이소말툴로스(palatinose)와 트레할룰로스는 수크로스(사탕수수 당, 사탕무우 당)의 재배열(이성질체화)에 의해 제조할 수 있다. 수크로스의 이성질체화 생성물, 특히 이소말툴로스는 식품과 유사 제품들에서 수크로스 대체품으로 점점 더 많이 사용되고 있다. 이소말툴로스는 낮은 당지수(glycemic index)를 가지는 아크로젠성(acrogenic) 당이며 2005년 이후에 식품 또는 식품 첨가제로 허가되었다. 또한, 이소말툴로스 또는 이소말툴로스를 포함하는 조성물은 수크로스로부터 제조할 수 있으며, 당 알코올 이소말트, 1,6-GPS (6-O-α-D-글루코피라노실-D-소르비트) 및 1,1-GPM (1-O-α-D-글루코스-D-만니트)의 라세믹 혼합물뿐만 아니라 이들로부터의 데비에이션(deviation), 특히 GPS- 또는 GPM-이 풍부한 이들의 혼합물 생산을 위한 원료물질이다. 한편, 이소말트는 식품과 유사제품에서 당 대체물질로서 사용되고 있다. 이소말툴로스의 이소말트 및 유사한 물질로의 전환은 일반적으로 알려진 촉매적 수화반응, 임의로 생명공학적 전환에 의해 일어난다.

이소말툴로스와 트레할룰로스의 생명공학적 제조는 바람직하게 고정된 박테리아 세포 또는 그의 단편을 사용하여 수크로스의 효소적 이성질체화에 일어나는 것으로 알려져 있다. 이성질체화는 박테리아 효소 수크로스 뮤타제, E.C. 5.4.99.11(동의어: 수크로스-아이소머라제, 수크로스 뮤타제, 수크로스-이소머라제, 이소말툴로스-신타제)의 활성에 의해 일어난다. 수크로스 뮤타제 활성을 나타내며 생명공학적 방법에 사용될 수 있는 것으로 알려진 미생물은 특히 프로타미노박터 루브럼(protaminobacter rubrum), 에르위니아 라폰티시(erwinia rhapontici), 수도모나스 메소아시도필라(pseudomonas mesoacidophila), 판토이아 디스퍼사(pantoea dispersa) 및 세라티아 플리무티카(serratia plymuthica)이다. 이들의 수크로스 뮤타제는 또한 SmuA, Pal I, SmtA, MutB, SIM 등의 명칭으로 알려져 있다. 박테리아 수크로스 뮤타제는 염색체 유전자에 의해 코딩된다. 유전적 발현은 수크로스 뮤타제 프로모터 성분에 의해 조절된다. 이하에서, 수크로스 뮤타제가 P. rubrum 유래의 수크로스 뮤타제에 제한되는 것 없이, 수크로스 뮤타제는 P. rubrum의 수크로스 뮤타제 "SmuA"로 지칭된다. P. rubrum에서 SmuA는 smuA로 표시된 염색체 유전자에 의해 코딩되며; 발현은 smuA-프로모터 성분에 의해 제어된다. 이하에서, smuA라는 명칭은 또한 다른 개체의 수크로스 뮤타제 유전자를 나타낸다.

유전적으로 변형된 형질전환 미생물은 EP 0751218 A와 WO 95/20047 A에서 알려졌으며, 이들은 수크로스 뮤타제 활성을 나타내며, 여기에서 세포 돌연변이에 의해 수크로스 대사의 효소활성을 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킨다.

공지된 미생물에서 수크로스 기질이 이소말툴로스와, 추측컨대 추가적으로 트레할룰로스로 대사하는 속도는 개선이 필요하다. 또한, 공지된 미생물에서 수크로스 뮤타제 활성은 배양 배지에서 수크로스의 농도 또는 존재에 의존하여 생명공학적 방법을 복잡하게 만든다. 게다가 유전자 변형 생물체(GmO)에 대해서는, 예를 들면 German Safety Regulation for Gene-technology (GenTSV) 같은 법적 규제와 규정이 있다. 이소말툴로스의 수율이 개선된 미생물의 제공 이외에, 법적 규제를 받지 않는 개선된 미생물도 필요하다.

본 발명에 의해 달성된 근원적 기술적 문제는 이소말툴로스와 이소말툴로스를 포함하는 조성물의 생명공학적 제조를 위한 개선된 방법과 수단, 특히 개선된 미생물 제공을 포함하는 것으로, 종래기술에서 알려진 단점을 극복한다.

본 발명은 신규한 미생물 세포를 제공하여 이러한 기술적 문제를 완전히 해결하여, 이 세포의 야생형, 바람직하게 달리 변형되지 않은 것과 관련하여 이소말툴로스의 형성률, 즉 합성률이 2 팩터, 바람직하게 2.5 팩터, 특히 바람직하게 3 또는 4 또는 5 팩터 이상의 증가를 나타낸다.

본 내용에 있어서, 본 발명은 바람직하게 야생형과 관련하여 적어도 2 팩터, 바람직하게 2.5 팩터, 특히 바람직하게 3 또는 4 또는 5 팩터 이상의 상승된 활성, 즉 세포에 의해 발현된 수크로스 뮤타제의 특정한 부피 활성을 포함하는 세포를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 그의 야생형과 관련하여 기질, 특히 수크로스의 농도와는 별도로 수크로스 뮤타제의 발현을 나타낸다.

본 발명에 따른 세포를 생산하기 위하여, 본 발명은 수크로스 뮤타제 SmuA를 코딩하는 유전자 smuA의 비코딩 프로모터 영역을, 바람직하게 세포의 달리 변형되지 않은 야생형의 다른 강력한, 바람직한 내부 내생성(endogen) 또는 상동성 프로모터 또는 그의 작용성 프로모터 단편(= 대체 프로모터)으로 치환하는 것을 제공한다. 본 발명자들은 놀라웁게도 매우 효과적인 상동성 및 특히 내생성인, 즉 유기체 내부 프로모터뿐만 아니라 그의 단편을 발견하였으며, 그에 의해 smuA-유전자의 발현과 결과적으로 특히 세포의 주변 세포질 내의 수크로스 뮤타제의 농도 및 특별하게 이소말툴로스의 부피 활성 및 특히 형성율을 세포의 야생형과 비교하여 증가시킬수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 특별히 게놈, 바람직하게 수크로스 뮤타제(SmuA)를 코딩하는 내생성 수크로스 뮤타제 유전자(smuA-유전자)를 포함하는 세포이고, smuA-수크로스 뮤타제 프로모터 성분 또는 프로모터(smuA-프로모터), 즉 적어도 하나의 단위가 적어도 하나의 다른 프로모터 또는 그의 단편(대체 프로모터)으로 치환된 유전자의 발현을 조절하거나 제어하고, 대체 프로모터는: (a) 세포의 내부 스템으로부터의 smuA-프로모터(내부의 내생성 프로모터)와는 상이한 내생성 프로모터, (b) 외부 공여체 스템(외부 상동성 프로모터)으로부터의 (a)에 따른 내생성 프로모터와 관련하여 상동인 프로모터, 및 (c) 특히 세포의 야생형과 관련하여, 특히 smuA-유전자의 발현을 조절 또는 제어할 수 있는 (a) 또는 (b)의 작용성 프로모터 단편에서 선택된다.

특별히 바람직한 구체예에서, 세포는 자기 클로닝 스템이며, 이것은 자기 클로닝에 의해 세포 내부(내생성) 유전자 서열을 사용하여 생성되었다. 그러므로, 본 발명에 따른 세포는 바람직하게 프로모터 재구성 스템을 나타낸다. 여기에서 개선된 특징을 가지는 스템은 본 발명에 따라 단백질을 코딩하지 않는, 바람직하게 또다른 스템 내부(내생성) 조절 단편, 즉 프로모터 또는 그의 작용성 단편의 카피에 의해 생성되며, 프로모터 재구성에 의해 사용되어 내부 수크로스 뮤타제를 발현한다. 유리하게 이 프로모터 재구성 스템은 새로운 단백질을 형성하지 않으며; 바람직하게 상당량의 세포 내부 수크로스 뮤타제 SmuA의 발현을 촉발할 뿐으로, 또한 세포의 야생형에 의한 동일한 형태로 발현된다. 바람직하게, 어떠한 외부 유전자 및/또는 유전자 단편도 세포 내에 포함되지 않으며, 바람직하게 외부 코딩 및/또는 비코딩 폴리핵산 분자는 본 발명에 따른 세포 내에, 즉 에피솜으로 또는 염색체로 포함되지 않는다. 구체예의 이러한 변경에서 자기 클로닝 스템의 제조에 있어서, 일시적으로 중간체 벡터 성분은 세포에 도입되어, 지속적으로 나타나지 않지만 바람직하게 본 발명에 따른 제2 재조합에 대한 선택에 의해 바람직하게 세포에서 다시 제거된다. 유전자 서열은 바람직하게 반흔(scarring) 없이 치환된다. 본 발명에 따르면, 이 구체예에서 GenTSV에 따른 외부 "공여 유기체"에서의 유전물질의 지속적 도입을 포기한다. 개선된 미생물 세포가 제공되는 이 방법은 적용가능한 법률과 규정에 따라 "유전자 변형 생물"(GMO)로 간주되지 않는다. GMO에 대해 적용가능한 안전 규정, 사용규제 및 조건의 이행은 의무적이거나 전적으로 의무적인 것은 아니며, 특히 본 발명에 따른 세포의 경제적 이용성을 용이하게 한다.

대안적 제2 구체예에 있어서, 본 발명은 상동성 프로모터를 나타내는 재조합 세포를 제공한다. 이 세포는 자연적인 smuA-프로모터의 위치에 상동성 공여 유기체에서 유래한 적어도 하나의 다른 프로모터 또는 그의 작용성 프로모터 단편을 가진다. 이것은 바람직하게 본 발명의 제1 구체예의 내생성 대체 프로모터와 관련하여 상동성이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 대체 프로모터는 다음을 포함하는 군의 프로모터에 의해 선택되거나 특성화된다:

- 3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제 ribB 유전자의 프로모터,

- "외막 단백질"을 코딩하는 ompA 유전자의 프로모터,

- "추정 전사 활성제 ECA2934"를 코딩하는 유전자의 프로모터,

- 리보뉴클레아제 E me 유전자의 프로모터,

- 50S 리보솜 L21-단백질의 오페론의 프로모터,

- 저온 충격 단백질 CspE의 오페론의 프로모터,

- 50S 리보솜 L28 단백질의 오페론의 프로모터, 및

- NAD 의존성 에피머라제-데히드라타제 유전자의 프로모터.

바람직한 변경에서, 전체 프로모터의 작용성 프로모터 단편은 본 발명에 따른 smuA-유전자의 발현을 제어할 수 있는 대체 프로모터로서 제공된다.

표 1A와 1B에는 본 발명에 따른 바람직한 대체 프로모터와 이들의 특징적 공급원을 기재하였다.

3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제 ribB의 유전자 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 바람직하게 사용되는 대용 단편은 서열번호 2와 서열번호 3에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 2에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

외막 단백질을 코딩하는 ompA 유전자 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 바람직하게 사용되는 대용 단편은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 4에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

추정 전사 활성제 ECA2934의 유전자 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 바람직하게 사용되는 대용 단편은 서열번호 7 및 서열번호 8에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 7에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

리보뉴클레아제 E me의 유전자 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 바람직하게 사용되는 대용 단편은 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 9에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

50S 리보솜 L21-단백질의 오페론 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 바람직하게 사용되는 대용 단편은 서열번호 12 및 서열번호 13에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 12에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

저온 충격 단백질 CspE의 오페론 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 바람직하게 사용되는 대용 단편은 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 다른 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 14에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

50S 리보솜 L28 단백질의 오페론 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 사용된 바람직한 대용 단편은 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 17에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

최종적으로, NAD 의존성 에피머라제-데히드라타제의 유전자 또는 상동성 영역의 프로모터에서 유래하는, 본 발명에 따라 사용된 바람직한 대용 단편은 서열번호 20 및 서열번호 21에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 P rubrum으로부터의 서열번호 20에 따른 대용 단편으로 자기 클론된, P rubrum 세포이다.

따라서, 본 발명에 따른 내생성 또는 선택적으로 상동성 대체 프로모터는 폴리뉴클레오티드 또는 바람직하게 그로부터 형성된 폴리뉴클레오티드를 특징으로 하며, 이것은 바람직하게 서열번호 2 내지 21과 이들의 작용성 변형 및 단편을 포함하는 본 발명에 따른 내생성 또는 상동성 대체 서열의 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 함유한다. 특히 이 폴리뉴클레오티드는 대체 프로모터로서 사용되며; 선택적으로 이 폴리뉴클레오티드를 본질적 또는 특징적 작용성 성분으로 포함하는 것이 바람직하다. 그러므로, 본 발명은 이들이 프로모터 또는 수크로스 뮤타제 유전자 smuA의 발현을 조절하는 성분으로서 작용할 수 있는 범위까지 및 작용할 수 있을 때 당업자들이 용이하게 접근할 수 있는 구체적으로 언급된 이들 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편 또는 변형에 관한 것이다.

본 발명은 또한 바람직하게 이와 관련하여 상동인 서열을 가지는 작용성 폴리뉴클레오티드 분자에 관한 것으로, 이들은 위에서 구체적으로 명명된 서열과 적어도 85%, 바람직하게 90% 이상 또는 95% 이상, 또는 97% 이상의 서열 일치성을 나타낸다. 당업자들이라면 서열 상동성과 작용적 유사성을 결정하는 실험 방법과 알고리즘을 알고 있을 것이다.

"작용성 단편"이란 특히 구체적으로 명명된 서열과 관련하여 단축된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 분자로 간주되며, 이것은 실질적 프로모터 모티브, 즉 smuA-유전자의 발현을 개시하는 조절 단위를 함유하고, 바람직하게 포함한다. 당업자라면 본 발명의 측면에서 적합한 작용성 단편을 결정하기 위한 적합한 일반적인 스크리닝 방법을 알고 있을 것이다. 이러한 용이하게 결정된 작용성 단편 또한 본 발명의 목표이다. 바람직하게, 단편은 여기에 구체적으로 명명된 뉴클레오티드 분자와 관련하여 약 100 bp, 50 bp, 20 bp, 10 bp, 5 bp 또는 2 bp, 또는 약 50, 20, 10, 5 또는 2의 원래 염기수로 단축된다.

구체적으로 명명된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 분자의 "작용적 변형"은 조절 단위로서 작용하는 폴리뉴클레오티드 분자인 것으로 이해되며, 이것은 smuA-유전자의 발현을 개시할 수 있고, 특히 구체적인 폴리뉴클레오티드 분자로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 직접적으로 다르다. 당업자라면 본 발명을 시행하는데 적합한 변형 분자를 용이하게 찾을 수 있는 적합한 스크리닝 방법을 알 수 있다. 이러한 변형은 구체적으로 명명된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 1 이상, 2, 3, 4, 5, 또는 약 10, 20, 50 또는 100 이상 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 바람직하게 제할 수 있다.

이러한 작용적 변형 또는 단편은 본 발명의 바람직한 변경에서 내생적으로 숙주 세포, 특히 바람직하게 그의 게놈으로부터 유래한다. 선택적 변경에서, 이러한 변형 또는 단편은 다른 개체로부터 유래한 상동 성분이다.

추가적으로, 본 발명은 또한 세포에서 smuA-유전자의 발현을 개시하는 조절 단위로서 적합한 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하며, 이것은 본 발명에 따른 대체 프로모터 분자로 사용될 수 있고, 그 자체로 알려진 방법으로 상기한 대체 프로모터의 무작위 합성 또는 변형에서 얻어진다. 당업자라면 이것을 공지된 방식 자체로 여기에 기술된 내용으로부터 일반적 방법을 사용하여 제공할 수 있다.

바람직하게 본 발명에 따른 치환된 또는 "대체된" smuA-프로모터 성분은 smuA-단위, 즉 바람직하게 smuA 유전자와 여기에서 새롭게 발견된 ORF에 위치한 상부 사이의 유전자간(inter-genetic) 영역에 국한된다. 여기에서 "smuA-단위"는 smuA-발현의 5'-UTR(프로모터, 작동인자)에서 조절 서열을 가지는 smuA-유전자와 관련하여 염색체 구성 상부로 간주된다. 특히, smuA-단위는 서열번호 1(도 1)을 가지는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 하며; 도 3abc는 P. rubrum의 smuA-단위의 유전자간 영역에 바람직하게 치환되는 성분을 나타낸 것이다.

본 발명은 바람직하게 감마 프로테오박테리아(proteobacteria) 및 분류되지 않은 감마 프로테오박테리아 군의 미생물로부터 선택된 숙주세포를 제공한다. 바람직하게 세포는 다음 종류의 미생물을 포함하는 군에서 선택된다: 에스케리키아(escherichia), 살모넬라(salmonella), 세라티아(serratia), 에르위니아(erwinia), 엔테로박터(enterobacter), 클렙시엘라(klebsiella), 라우올텔라(rauoltella), 펙토박테리움(pectobacterium), 슈도모나스(pseudomonas), 아조토박터(azotobacter), 판토이아(pantoea), 로이카니아(leucanea), 및 프로타미노박터(protaminobacter). 특히 바람직하게 세포는 다음을 포함하는 군에서 선택된다: klebsiella sp., 특히 LX3 스템과 NK33-98-8 스템, klebsiella pneumoniae, 특히 342 스템; enterobacter sp ., 특히 SZ62 스템; enterobacter sp., 특히 FMB1 스템; rauoltella planticola; pantoea dispersa; erwinia rhapontici; erwinia tasmaniensis, 특히 Et1/99 스템; pectobacterium atrosepticum, 특히 SCRI 1043 스템; pectobacterium carovotum, 특히 brasiliensis 아종, 특히 PBR 1692 스템; protaminobacter rubrum; pseudomonas mesoacidophila; serratia plymuthica , azotobacter vinelandii 및 leucanea leucocephalia. 특히 바람직한 변경에 있어서 protaminobacter rubrum (P. rubrum) 세포 또는 생명공학적으로 변형된 이들의 스템이 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 숙주세포의 고정 및/또는 달리 변형된 형태를 포함하며, 이들은 생명공학적 방법에 특히 적합할 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 본 발명에 따른 세포, 특히 자기 클로닝 스템을 제조하는 수단을 포함한다. 이러한 수단 중 하나는 바람직하게 smuA-유전자의 발현을 조절할 수 있는 위에서 특성화된 대체 프로모터 또는 그의 작용성 단편을 함유하거나 또는 포함하는 자체가 이미 보다 상세하게 기술된 단리된 형태로 존재하는 폴리뉴클레오티드 분자이다.

본 발명의 목적은 또한 벡터 또는 벡터 시스템, 특히 위에서 보다 상세하게 기술된, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 도입하는데 적합한, 대용 플라스미드, 즉 대체 프로모터 또는 대체 프로모터의 단편이다. 숙주세포는 바람직하게 위에서 특성화된 미생물 중 하나이다. 바람직하게 벡터는 세포의 염색체 게놈에 대체 프로모터 또는 대체 프로모터의 단편을 통합시키며, 이 방법으로 특히 자기 클로닝 스템을 만들기 위해 세포의 염색체에서 smuA-유전자의 고유 프로모터를 치환시킨다.

프로모터 치환을 개시하는 대용 벡터는 바람직하게 도입된 숙주세포에서 재생되지 않도록 설계된다. 바람직한 벡터 구조물은 pUT-유도체이며, 이것은 R6K 복제원에 기초하고; 이 벡터는 특히 P. rubrum에서 재생산하는 것을 적어도 조건에 따라 자제한다.

본 발명의 목적은 또한 적어도 다음 단계들을 포함하는, 수크로스를 이소말툴로스 또는 이소말툴로스 조성물로 전환하는 본 발명에 따른 세포를 제조하는 방법이다: 제1 단계에서, 세포의 야생형 스템 또는 -관행적으로 또는 재조합방법으로-이미 변형된 스템을 제조하고; 제2 단계에서 이 스템을 적어도 하나의 위에서 특성화된 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 분자, 특히 대체 프로모터 또는 대체 프로모터의 단편 및/또는 대체 프로모터 또는 대체 프로모터의 단편을 포함하는 위에서 특성화된 적어도 하나의 벡터에 접촉시키거나 연결시켜서, 즉 바람직하게 대체 프로모터 또는 대체 플라스미드를 세포에 도입시킨다. 바람직한 방법은 특히 공여 스템인 E. coli와의 유전자간 컨쥬게이션이다.

바람직한 다른, 바람직하게 직접 후속하는 단계에서, 세포는 도입된 폴리뉴클레오티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 분자와 개별 영역을 가지는 벡터 또는 대체 플라스미드를 세포 게놈 내에서 상동성 재조합이 가능한 조건 하에 대체 프로모터가 세포의 게놈 내에 통합되도록 배양된다. 바람직한 구체예에서, 더 이상 원래 포함된 대체 프로모터를 포함하지 않는, 바람직하게 치환된 smuA-프로모터를 포함하는 벡터 또는 대체 플라스미드는 제2 재조합의 선택에 의해 제거된다.

본 발명의 제2 측면에 따르면, 본 발명의 목적은 smuA-유전자가, 특히 적어도 하나의 상기에서 특정된 대체 프로모터 또는 대체 프로모터의 작용성 단편의 조절 하에서 선택적으로 또는 바람직하게 추가적으로 외부 염색체(에피솜)적으로 발현되는 세포뿐만 아니라 이 세포들의 제조를 위한 수단이다. 이러한 수단의 하나는 다른 폴리뉴클레오티드이며, 이것은 적어도 하나 또는 여러 카피에서 수크로스 뮤타제를 발현할 수 있고 추가적으로 적어도 하나 또는 여러 카피에서 수크로스 뮤타제의 발현을 조절하는 적어도 하나의 다른 성분, 특히 프로모터 성분을 나타내는 코딩 부분을 포함한다. 수크로스 뮤타제 유전자의 발현을 조절하는 성분은 위에서 특성화된 본 발명에 따른 대체 프로모터와 그의 작용성 단편의 군에서 선택된다. 그러므로, 본 발명의 목적은 수크로스 뮤타제 발현 메거진 (magazine)이다.

본 발명의 이 측면의 선택적 변경에 있어서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 분자, 특히 발현 메가진은 단리된 형태로 존재한다. 예를 들면, 이것은 알려진 방식 자체로 숙주세포에 전달될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 분자, 특히 발현 메거진을 사용하여 세포 자유 시스템과 생촉매를 개발하는 것이 제공된다.

본 발명의 제2 측면의 목적은 또한 벡터, 특히 발현벡터이며, 이것은 적어도 1 카피의 위에서 특성화된 폴리뉴클레오티드 분자, 특히 발현 메거진을 발현될 수 있는 바람직한 형태로 포함한다. 발현벡터는 수크로스 뮤타제 유전자(smuA)를 바람직하게 에피솜 발현하기 위해 바람직하게 숙주세포에 도입될 수 있다. 바람직한 선택적 변경에서 본 발명에 따른 벡터는 수크로스 뮤타제 발현 메거진을 숙주세포의 염색체 게놈에 삽입시킨다.

본 발명의 제2 측면의 목적은 또한 적어도 다음 단계들을 포함하는, 수크로스를 이소말툴로스 또는 이소말툴로스 조성물로 전환하기 위해 재조합할 수 있는 본 발명에 따른 세포를 제조하는 방법이다: 제1 단계에서, 세포의 야생형 스템을 제공하고; 제2 단계에서 이 스템을 적어도 하나의 위에서 특성화된, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 분자, 특히 수크로스 뮤타제 발현 메거진 및/또는 적어도 하나의 위에서 특성화된 벡터, 특히 수크로스 뮤타제 발현벡터와 접촉시킨다. 바람직하게 폴리뉴클레오티드 분자 및/또는 벡터는 발현될 수 있는 형태로 세포에 통합된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포의 생산을 위한, 위에서 특성화된 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 분자, 대체 프로모터 및 이들의 단편, 또는 완전한 수크로스 뮤타제 발현 메거진의 용도에 관한 것으로; 그러므로 본 발명의 제1 측면에 따라 자기 클로닝 스템, 그러므로 본 발명의 제2 측면에 따라 재조합 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 위에서 특성화된 벡터, 본 발명의 제1 측면에 따라 대체 플라스미드, 본 발명의 제2 측면에 따라 발현벡터의 세포를 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 바람직하게 수크로스 기질 또는 수크로스 포함 기질을 포함하는, 이소말툴로스 및/또는 이소말툴로스-포함/트레할룰로스-포함 조성물, 특히 이소말툴로스-조성물의 생명공학적 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 방법은 적어도 하나의 단계를 포함한다: 본 발명에 따른 세포를 기질을 포함하는 배양배지에서, 즉 기질을 이소말툴로스로 전환할 수 있는 조건 하에서, 바람직하게 세포 내부의 상동성 수크로스 뮤타제(SmuA) 사용 하에 배양. 바람직하게 바람직한 다음 단계에서, 이소말툴로스 또는 이소말툴로스-조성물을 배양배지 및/또는 세포에서 단리한다.

본 발명에 따른 숙주세포에서 수크로스 뮤타제의 발현은 수크로스 농도에 유리하게 또는 크게 독립적이며, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주세포의 생육, 즉 글루코스 배지(C-공급원)에서 바이오매스를 생성할 수 있다.

본 발명에 있어서, "이소말툴로스-조성물"은 수크로스의 이성질체화 생성물에 관한 것이다. 이 기질은 압도적으로 이소말툴로스를 포함한다. 추가 성분은 트레할룰로스 및 이소멜레지토스(isomelezitose)이다. 이것은 특히 다음 조성물에 관한 것이다: 70 내지 90% 이소말툴로스, 5 내지 10% 트레할룰로스, 0 내지 0.5% 이소멜레지토스, 0 내지 0.2% 트리사카라이드 및 0 내지 0.2% 잔여 수크로스.

따라서, 본 발명의 목적은 바람직하게 수크로스 또는 수크로스 포함 기질을 포함하고, 바람직하게 여기에 기술된 방법에 따라 제조된, 이소말툴로스 또는 이소말툴로스-조성물의 생명공학적 제조를 위한 위에서 특성화된, 본 발명에 따른 세포의 용도이다.

이하, 본 발명을 도면과 실시예에 의해 더옥 상세히 설명하였으며, 본 발명이 이로 인해 제한되지는 않는다:
도 1은 5'-UTR (프로모터, 작동인자); 서열번호: 1에서 조절 서열을 가지는 smuA-유전자와 관련하여 염색체 구성 상부를 나타낸 것이다: 이 영역에서 234 아미노산의 "오픈 리딩 프레임"(ORF)을 확인할 수 있다. 이것은 이하에서 이른바 GntR-형 전사 조절인자에 대해 상당한 상동성을 나타내며; 각각의 유전자는 gntR로 불린다. 약 400 bp를 포함하는 유전자간 영역은 smuA-발현의 조절성분(프로모터, 작동인자)을 포함하는, gntR와 smuA 사이에 위치한다(도 3a 참조).
도 2는 P. rubrum 프로모터 유전자 은행을 제조하기 위한 "하이-카피"-플라스미드 pUCTT-gusA (도 2a) 및 "로우-카피"-플라스미드-pSCTT-gusA (도 2b)를 본 발명에 따라 사용될 수 있는 벡터의 실시예 벡터 카드로서 나타내었다. 바람직하게 β-글루쿠로니다제 유전자 gusA를 프로모터 리포터 유전자로 사용하였다. 바람직하게 대체 서열 서열번호: 2 내지 서열번호: 11 (표 1A)이 도 2a에 따른 플라스미드와 관련하여 사용되었고; 대체 서열 서열번호: 12 내지 서열번호: 21 (표 1B)이 도 2b에 따른 플라스미드와 관련하여 사용되었다.
도 3은 GntR계의 잠재적 전사 조절인자를 코딩하는 gntR 유전자의 새로 발견된 3'-영역과 P. rubrum의 수크로스 뮤타제 유전자 smuA의 5'-영역 사이의 유전자간 영역의 DNA-서열 부분을 나타낸다. 이 도면에는 또한 상동성 대체 프로모터의 반흔 없는 도입을 위한 본 발명에 따른 바람직한 전략을 나타내었으며; MunI 계면을 선택하였고, 추정 gntR 유전자와 관련하여 자연적으로 약 35 bp 하부에 위치한다. 또한, 바람직하게 PmeI 계면 GTTT/AAAC의 일부를 나타내는 자연적인 smuA 리보솜 결합부위(RBS) 바로 앞에 위치된 AAAC 서열을 사용하였다(도 3b). MunI / PmeI-중간 단편(도 3b)의 에피솜 도입은 대체 프로모터의 표적화된 도입을 가능하게 한다. 도 3c는 일 예로서 여기에서 3C1이라고 지칭되는 ribB 프로모터의 반흔 없는 도입을 나타낸 것이다. 도 3a-c에서 관련 서열을 강조하여 표시하였다.
도 4는 서열번호 2에 따른 대체 서열을 포함하는, 본 발명에서 제조된 바람직한 프로모터 대체 플라스미드 pUT-GntR-Pr3C1-SmuA의 벡터 지도의 예를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 유기체를 생산하기 위한 본 발명의 방법을 도해적으로 예시하여 나타낸 것이다: 자기 클로닝 방법에 의한 자연적 smuA-프로모터 영역의 상동성 프로모터에 의한 치환. 숙주세포 P. rubrum에서 바람직한 비복제성 벡터(예를 들면, pUT-벡터)에 기초하여 바람직하게 프로모터 대체 플라스미드를 치환될 프로모터를 함유하는 E. coli에서 구성하였다. 이것은 상부를 반흔 없이 약 1000 bp 크기 DNA-단편에 의해 코딩되고, 추정 gntR-조절인자를 코딩하며, 하부에서 smuA의 5'-영역을 코딩하는 SmuA-영역의 약 1000 bp 크기의 DNA 단편이 측면에 있다. 생성된 플라스미드는 숙주세포: P. rubrum 야생형으로 전이된다. 바람직하게 카나마이신(canamycin) 상에서의 선택으로 이러한 콜로니들이 염색체 내에 대용 플라스미드를 담지하는 이들로부터 선택되며, 바람직하게 2개 상동성 영역 중 적어도 하나에 의해 염색체 내에 통합된다. 카나마이신이 없는 배지에서의 인큐베이션은 프로모터 대체 스템의 선택을 가능하게 하고, 여기에서 통합된 플라스미드는 염색에로부터의 제2 크로스오버(제2 재조합)에 의해 다시 분해된다. 이러한 콜로니들은 바람직하게 카테콜을 그 자체가 공지된 방법으로 첨가한 후 xylE-활성의 부재에 의해 표현형(노란색 착색 없음)으로 입증할 수 있다. 이후, 프로모터 재구성 스템의 성공적 제조를 추가적으로 야생형의 재구성을 유발하는 대체 플라스미드의 완전한 분해를 제외하기 위해 공지된 방법 자체로 분자생물학적 방법(예를 들면, PCR)에 의해 시험할 수 있다.
도 6은 본 발명에 따른 유기체(No. 3C1A)에서 24시간 동안 탄수화물 대사의 진행과 야생형(WT)과의 비교를 나타낸다.

서열 프로토콜은 다음과 같다:

서열번호 1: 본 발명에 따른 대체 프로모터 또는 그의 작용성 대체 프로모터 단편에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 치환될 수 있는, 자연적 smuA-프로모터/작동인자를 포함하는 smuA-유전자 관련 DNA-서열 상부

서열번호 2 내지 21: 자연적 smuA-프로모터 대신에 세포에서 smuA-유전자의 발현을 조절할 수 있는 작용성 대체 프로모터의 서열

자연적 smuA-프로모터에 대하여 동정된 강력한 프로모터를 치환하기 위해서 본 발명에 따르면 바람직하게 치환이 발생하여 유기체에 신규한 비상동성 서열의 도입 없이 수행된다. 이를 위하여, 본 발명에 따르면 바람직하게 다음 과정이 기본적으로 일어난다: 프로모터 대체 플라스미드를 제조하고, 이것은 바람직하게 smuA-프로모터의 DNA 영역 상부와 하부의 약 1000 bp를 포함한다. 다음으로 자연적 smuA-프로모터의 비반흔 치환이 발생하고 플라스미드 내에 위치하며 다른 상동성 프로모터에 대하여 약 400 bp의 크기를 나타낸다. 염기 등가성 치환을, 예를 들면 DNA 시퀀싱에 의해 확인할 수 있다. 이 방법으로 얻어진 프로모터 대체 플라스미드를 유기체에 전이하고 플라스미드를 smuA-단위에 상동성 재조합에 의해 염색체 통합시켰다. 프로모터의 치환은 바람직하게 제2 재조합의 표적화된 선택에 의해 대체 플라스미드의 동시 제거로 발생한다.

적용할 수 있다면, 정확한 비반흔 프로모터 치환과 유기체 내의 어떠한 외부 서열의 부재가 PCR-방법 및/또는 공지된 방법 자체의 시퀀싱 방법에 의해 입증될 수 있다. 써던(southern)-하이브리다이제이션에 의해 추가적인 확보가 가능하다.

자연적 smuA-프로모터를 치환하기 위하여, 바람직하게 수크로스 뮤타제를 코딩하는 영역의 발현의 잠재적 레귤레이터와 수크로스 뮤타제 SmuA를 코딩하는 영역 사이의 유전자간 영역을 박테리아의 염색체에 대해 선택하였다. 특히 바람직하게, 중간 단편을 MunI과 PmeI 영역에서 가수분해에 의해 제거하였다. 바람직하게 상동성 대체 프로모터의 표적화된 도입은 바람직하게 본 발명에 따라 MunI 또는 EcoRI/PmeI-단편으로 발생한다.

실시예 1: P. rubrum 에서 자기 클로닝에 의한 smuA -프로모터의 치환

모든 클로닝과 DNA 변형은 Sambrook 등, 1989 (Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)에 기술된 바와 같이 수행하였다. PCR-충전, 핵산 단리용 키트, 검출 및 선택방법, 배양은 달리 규정하지 않는 한 공지된 방법으로 각각의 제조업체의 설명에 따라 수행하였다.

1.1 상동성 P. rubrum 프로모터

P. rubrum 야생형의 염색체 DNA를 단리하여 Alu1로 부분적으로 분해하였다. 단편을 StuI 경계면에 도 2에 나타낸 2개의 상이한 프로모터 프로브 벡터에 의해 클론하였고, 이것은 본질적으로 이들의 카피수가 다르다: 벡터 pUCTT-gusA는 높은 수의 카피를 가지며 클로람페니콜 저항성 유전자 cat of pBR328 (DSMZ, Brunswick)을 담지하는, pUC-유도체를 나타내는 반면, 벡터 pSCTT-gusA는 낮은 수의 카피를 가지고 공지된 플라스미드 pSC101 (DSMZ, Brunswick)에서 유도되고 카나마이신 저항성 유전자 aphII를 담지하는 벡터이다. 이들 벡터에서 gusA-유전자는 프로모터 리포트 유전자로 사용되고, 이것은 β-글루코시다제를 코딩하고 작용성 프로모터 단편의 첨가 후에 발현된다.

기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-D-글루쿠론산(X-Gluc)을 첨가한 후, 성공적 발현은 청색 발색(Platteeuw C. et al., 1994, Appl Environ Microbiol. 60:587-93)으로 검출될 수 있다. 3개 터미네이터(Ter)는 잠재적, 플라스미드 내부 프로모터 성분에 의해 리포터 유전자의 바람직하지 않은 발현을 방지할 수 있다. 2개의 벡터 타입은 P. rubrum뿐만 아니라 E. coli에서 복제되었다.

숙주세포 내부 대체 프로모터 단편의 프로모터 작용을 제어하기 위해, 당업자라면 그들이 알고 있는 방법을 사용하여 E. coli 내에 자연적으로 존재하는 염색체 β-글루쿠로니다제 유전자 uidA를 E. coli gusA-시험 스템 E. coli DH10BΔuidA를 생성하기 위해 불활성화할 수 있다.

E. coli DH10BΔuidA에서 대체 프로모터의 pUCTT-gusA 또는 pSCTT-gusA-유전자 은행의 형질전환은 청색 콜로니를 유발하고, 여기에서 프로모터가 없는 gusA--리포터 유전자는 클론된 대체 프로모터 단편에 의해 발현된다.

청색 콜로니에서 단리된 플라스미드-DNA의 제한분석에서는 상이한 크기의 염색체 P. rubrum 단편 또한 프로모터 작용을 가지는 것으로 나타났다.

전기천공법(전계-컴피턴트 세포의 제조 및 Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16:6127-6145에 따라 수행)을 사용하여 클론을 P. rubrum에 전이하고 미리 E. coli에서 검출된 프로모터 활성을 확인할 수 있다.

1.2 대체 프로모터의 비반흔 도입

본 발명에 따른 대체 프로모터(서열번호: 2 내지 21)를 각각 자연적인 염색체-프로모터/작동인자 범위에 대해 비반흔 형태로 상동성 재조합에 의해 치환하였다.

이러한 접근 방법은 상동성 재조합에 의해 프로모터 대체 플라스미드의 염색체 통합에 기초한다. 베이스 벡터가 제공되었으며, 적어도 조건에 따라 P. rubrum에서 재생되지 않았다. 일 예로, pUT-유도체는 R6K 복제 기원에 기초하여 도입되었다(Herrero et al ., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67). 이러한 벡터들은 π-단백질의 복제에 필수적인 코딩 pir-유전자가 존재할 때에만 재생산된다. 이러한 스템은 E. coli S17-1λpir (Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67)이며; 이것을 사용하여 각각의 프로모터 대체 플라스미드를 구성한다.

pUT-벡터에 기초한 본 발명에 따른 모든 프로모터 대체 플라스미드는 치환될 새로운 프로모터 단편이 비반흔 방식으로 gntR-레귤레이터를 코딩하는 925 bp 크기 DNA 단편이 상부에, smuA의 5' 영역을 코딩하는 1066 bp 크기 DNA 단편이 하부에 플랭크되도록 구성되었다. 도 3은 클로닝 전략의 구현을 상세히 나타낸 것으로, 일 예로 대체 프로모터 단편(3C1)인 ribB-프로모터에 대한 것이다. smuA-프로모터를 단편 3C1으로 치환하는 것을 촉발하는, 예시적인 최종 프로모터 대체 플라스미드(pUT-GntR-Pr3C1-SmuA')를 도 4에 나타내었다.

1.3 프로모터 재구성 스템 제조

P. rubrum을 형성하기 위한 프로모터 대체 플라스미드의 전이는 바람직하게 E. coli S17-1λpir and P. rubrum 사이의 유전자가 컨쥬게이션에 의해 수행되었다. 사용된 pUT-플라스미드는 RP4 플라스미드의 "전이 기원(Origin of Transfer)" (oriT)을 담지하여 E. coli S17-1λpir 내에 염색체 통합된 RP4 플라스미드에 의해 P. rubrum로 이동시킬 수 있다(Herrero et al., 1990, J. Bacteriol., 172:6557-67).

유전자간 컨쥬게이션의 조건은 다음과 같이 최적화되었다: 잠재적 P. rubrum 트랜스접합체의 선택은 P. rubrum에서 선택될 수 있는 플라스미드 마커(예를 들면, aphII, 카나마이신 저항성)와 E. coli 공여체를 선택적으로 저해하는 가능성이 필요하다. 리파마이신(rifamycin)을 함유하는 배지(100 g/ml)에 플레이팅하여 자발적 리파마이신 저항성 P. rubrum 야생형 콜로니를 생성하였고(P. rubrum Rif), 이것은 야생형과 다른 차이를 나타내지 않았다. 컨쥬게이션은 다음과 같이 수행되었다:

각각의 프로모터 대체 플라스미드를 담지한 E. coli S17-λpir 공여체 스템을 밤새 5 ml dYT 배지 (1 리터 당: 16 g 박토 트립톤(bacto trypton), 10 g 박토 효모 추출물, 및 5 g NaCl)에서 연장하고 카나마이신(50 g/ml)을 37 ℃에서 첨가하였다. 또한 수용체 P. rubrum를 밤새 5 ml dYT에서 리파마이신(100 g/ml) 첨가 하에 30 ℃에서 연장하였다. 각각의 밤샘 배양물 1 ml를 100 ml dYT-배지 (첨가물은 상기 참조)가 있는 삼각 플라스크에 주입하고 30 ℃(P. rubrum) 또는 37 ℃(E. coli)에서 250 rpm으로 0.4 내지 0.8 OD (600 nm)까지 인큐베이션하였다. 공여체와 수용체를 1:4의 비율로 혼합하고, 원심분리한 후, 1 ml dYT로 세척하고 최종적으로 100 μl의 dYT-배지에 취하였다. 현탁액을 피펫으로 dYT 플레이트 상의 니트로셀룰로스 필터(기공 크기 0.45 m)에 적용하고 30 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 1 ml dYT로 필터를 세정하여 희석하고 선별 플레이트(dYT + 카나마이신 50g/ml 및 리파마이신 100 g/ml)에 도포하여 30 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

카나마이신 선택에 의해, 이러한 P. rubrum 트랜스접합체를 얻고, 여기에서 플라스미드는 바람직하게 염색체에 2개의 상동성 영역에 의해 통합된다(도 5). The incubation of 카나마이신이 없는 배지를 인큐베이션하여 프로모터 대체 스템을 선택할 수 있으며, 여기에서 통합된 플라스미드는 제2 크로스오버에 의해 염색체에서 분리(disintegration)된다. 성공적 분리를 입증하기 위하여 컬러 마커 xylE를 대체 플라스미드에 도입할 수 있다. xylE-유전자는 카테콜을 2-하이드록시뮤콘산 세미알데히드로 전환하는 카테콜-2,3 디옥시게나제를 코딩하며, 이것은 눈에 띄는 노랑색 발색으로 표현형적으로 검출될 수 있다. 이전에 통합된 대체 플라스미드의 분리는 거의 일어나지 않으며(1000 콜로니 중 1), 카테콜의 첨가(스프레이 시약: 0.2 ml의 0.5 mol/l 수용액) 후 노란색 발색을 나타내지 않는 설계된 클론을 통하여 이러한 마커들에 의해 검출될 수 있다. 대체 플라스미드의 분리가 또한 야생형의 재구성을 유발할 수 있다는 사실로 인하여 생성된 모든 프로모터 재구성 스템은 PCR-실험, 써던 블롯 분석, 및 게놈 시퀀싱에 의해 시험되고 확인될 수 있다. 이 결과는 생성된 새로운 스템이 염기가 일치하는 치환(자기 클로닝)에 의해 반흔 없이 발생되었고 외부 서열이 없음을 나타낸다.

실시예 2: 생성물 스펙트럼과 합성 수행

2.1 HPLC를 사용한 탄수화물 조성물의 분석

분리된 탄수화물을 HPLC로 다음 성분을 사용하여 측정하였다: HPLC 펌프; 샘플 공급기; RI (회절률)-검출기; 프리(pre)-컬럼: 10 mm x 4.6mm, 아미노-페이스 (예: Zorbax-NH2); 분리 컬럼: 250 mm x 4.6 mm, 아미노-페이스 (예: Zorbax-NH2); 인터페이스, 컴퓨터, 및 기록과 공정 측정을 위한 소프트웨어.

다음 크로마토그래피 조건으로 측정하였다: 주입 부피: 10 μl; 유속: 1.0 내지 1.8 ml/분. 최적의 분리를 위해 조절되는 유속은 용리액의 조성뿐만 아니라 분리 컬럼의 종류 및 조건에 따라 다르다. 추가적인 분석 매개변수는 표 2를 참조할 수 있다.

2.2 진탕 플라스크에서 전체 세포의 생체 형질전환

본 발명에 따른 스템과 야생형 대조용 스템을 30 ml LB-배지 (출발-OD₆₀₀ 0.05)에서 생육하였다. 배양물을 각각 30 ℃, 200 rpm으로 수평 진탕 플라스크에서 인큐베이션하였다. 처음 24시간 발효 후, 5 x OD 세포를 꺼내어 원심분리하고 1 ml Ca-아세테이트 완충액 (0.01 mol/l, pH 5.5)로 세척하였다. 세포 펠릿(5 x OD 세포와 등가)을 각각 1.25 ml Ca-아세테이트 완충액 (0.01 mol/l, pH 5.5)와 0.584 mol/l (200 g/l)의 수크로스 용액에 재현탁하였다. 충전물을 생체 형질전환을 위해 딥웰 플레이트에서 약한 진탕하에 실온으로 90분 동안 인큐베이션하였다. 열처리(5 분, 98 ℃)하여 반응을 중지시켰다.

표 3은 수크로스 생육 (S) 또는 글루코스 생육 (G) 하에서 2개의 개별적으로 생성된 프로모터 대체 스템(No. 3C1A 및 No. 3C1B)으로 발효한 후 야생형(WT)과 관련하여 잔기의 HPLC-분석 결과를 나타낸다:

수크로스 생육(S) 하에서 생성된 3C1 스템(3C1A2S 및 3C1B2S)의 이소말툴로스 양은 각각의 야생형(WT2S)과 관련하여 약 3.2의 팩터로 상승되었다.

글루코스 생육(G) 하에서 차이는 더욱 분명한데, 왜냐하면 이러한 조건 하에서 SmuA는 야생형(WT2G)에서만 소량으로 발현되기 때문이다. 본 발명에 따른 스템(3C1A2G, 3C1B2G)은 수크로스 생육과 비교하여 약 10% 미만 이소말툴로스만을 생산한다.

발효를 추가로 진행하는 동안(24시간 이상), 이소말툴로스가 70 내지 90% 및 추측컨대 90% 이상으로 얻어졌다.

2.3 발효기에서 전체 세포의 생체 형질전환

야생형 P. rubrum Z12와 자기 클로닝 방법으로 생성된 P. rubrum의 대체 스템을 동일한 배지에서 배양하였다. 예비 배양물을 진탕 플라스크에서 30 ℃, 호기성 조건 하에 생육하였다.

비교 발효를 500 ml 발효기(Sixfors 제품): 배양배지: 소이 펩톤(Soy peptone): 15.0 g; 당밀 (80 °Bx): 20.0 g; (NH₄)₂HPO₄: 2.0g; 수크로스: 40.0 g; H₂O ad 1000 ml, pH 7.2-7.4; 발효 매개변수: 환기율 (발효 출발): 0.5 VVm; 교반기 회전: 500 rpm; pO₂: 20 %으로 수행하였다.

발효기에 대수기의 사전 배양물 5 ml가 주입되었다. 500 ml 발효기에서 위에서 언급된 매개변수 하에 30 ℃에서 15시간 동안 발효시켰다. 발효 종료 후, 세포를 30분 동안 17,600x g로 원심분리하여 투명한 잔류물을 버렸다. 다음으로, 세포를 수득(건조 바이오매스)하고 그의 수크로스 뮤타제 활성을 측정하였다.

건조 바이오매스를 10 ml 발효 현탁액의 0.45 μm 필터로의 여과와 이 필터의 105 ℃에서의 탈수 방법으로 측정하였다. 스템 당 2회의 발효가 각각 수행되었다. 야생형은 15시간 동안의 발효 후 85.1 ± 5.6 g/kg의 건조 바이오매스를 수득하였고, 모범적으로 프로모터 대체 스템 No. 3C1은 80.9 ± 1.0 g/kg을 수득하였다. 이 데이터에 기초하였을 때 건조 바이오매스의 수득량에서 유의할 만한 차이는 관찰할 수 없었다.

수크로스 뮤타제 활성을 측정하기 위하여, 야생형과 본 발명에 따른 자기 클론된 스템 각각의 습윤 바이오매스(BFM) 1 g을 40 % [w/v] 수크로스를 포함하는 50g 10 mmol/l Ca-아세테이트 완충액, pH5.5에 각각 현탁하였다. 세포 현탁액을 24시간 동안 25 ℃에서 진탕 하에 인큐베이션하고 샘플을 상이한 시간에 취하였다. 이들을 잔류 수크로스, 이소말툴로스, 트레할룰로스, 글루코스 및 프럭토스에 대하여 HPLC에 의해 시험하였다.

도 6은 10 mmol/l Ca-아세테이트 완충액, pH 5.5 중에서 40% 진한 수크로스로부터 이소말쿨로스의 형성에 대한 분석 데이터를 나타낸 것이다. 샘플을 상이한 시간에 취하여 탄수화물의 조성물에 대해 시험하였다. 이 도면은 예시로 선별된 프로모터 대체 스템 No. 3C1A와 관련하여 야생형(WT)의 수크로스 뮤타제에 의한 40% 진한 수크로스의 이소말툴로스의 전환을 나타낸다. 5시간 동안 인큐베이션한 후, 야생형의 수크로스 뮤타제를 사용하여 150 g 이소말툴로스를, 프로모터 대체 스템 No. 3C1A으로 320 g 이소말툴로스가 이미 입증될 수 있다.

전환 동역학에 기초하여, 다음과 같은 특이적 활성을 계산할 수 있다: 야생형의 활성: 1020 ± 17.8 units/g 건조 바이오매스; 스템의 활성 (No. 3C1A 및 No. 3C1B): 3118 ± 86.2 units/g 건조 바이오매스. 수크로스 뮤타제 활성은 본 발명에 따른 대체 스템에서 야생형과 관련하여 약 3 팩터로 상승되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Sudzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt <120> Micro-organisms with elevated sucrose mutase activity <130> 102780 <160> 21 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2409 <212> DNA <213> Protaminobacter rubrum <400> 1 ttttccattc aaagagtagg gactttgaaa aaaaaggtcg caaaactatt aatcattttg 60 tgatcgcatt catgttttct ccttcggtga agtggtctac ttttatggcg atttgtatac 120 attaaagtga tcaaggaaaa aatagccaga ggaatagcca aataaatttc aggttttaca 180 gtgcggtaac ctctttttgt tgcgcggtta tcaggattca tttagggata aagaggtctt 240 caagtgatct acaaaacgct tgctgaacgt ctgagaatac gtatcaattc tgctgatttt 300 gctatcggcg atgctttacc cagtgagaaa cgtctggctg ccgaattttc tgtatcgagg 360 atgacactcc gcaaagcggt aaatttactg attgaatggg ggctggtacg tcgctgtcac 420 ggcagcggaa ccttcgtcgc gcagaaagat ctccaacatg aaactcgtgg gctgatgggg 480 ttttcagaac tgatgaaaga actgggccgc cccacggtga gcgaggtgct ggagtttcga 540 atgatgggag cccccccagc catcgccagc cagctgcgaa tcaaggccga tgaacgcatt 600 tactattcgc gtcgcgtaag gtttgtggaa gggaagcctg tggtgctgga agatagttac 660 atgcctggca ggttatttgg caacctttca gtcgcacatc tggagggttc aaagttttcg 720 tatatagaag acgaatgcca tatcaatatc gcagggaatt acgaaagctt cagcccgatc 780 ttggcagaca gcacgatcgg cgcgctactg cacgttgccg aaggcacgcc gctgctgcgc 840 ctgacatcgc tttcttacag tgataccggc gactatatca actattcggt gatattcaga 900 aatgccaatg aataccacgt ggactaccat ttgaagagga ataaatagcg ggcgaagggg 960 agctacattc ctactatata gcaattgcaa taattcccag tctaatcatc acgttgatca 1020 acggaatttc ccgcaagata acatgaaaat gttttttgtt atcgcaaatt aatagtggtt 1080 tagagcgttc gcagccctct tgctaacacg gtttagcaag gtatgctaaa aaacagctga 1140 tttaaaacga atgtcactta aaaaatgtca atgctttata tttactttac ccagtcattg 1200 ttcgggaaca taattgaaaa gcttctatta gatactgaaa attaatcagt attaaattaa 1260 taaattaacg attaaatatt taaatgtcag gggaaacatt gaattaggtt tatttttcga 1320 ataagaaaca ggagagtatt gtaatgcccc gtcaaggatt gaaaactgca ctagcgattt 1380 ttctaaccac atcattatgc atctcatgcc agcaagcctt cggtacgcaa caacccttgc 1440 ttaacgaaaa gagtatcgaa cagtcgaaaa ccatacctaa atggtggaag gaggctgttt 1500 tttatcaggt gtatccgcgc tcctttaaag acaccaacgg agatggcatc ggggatatta 1560 acggcatcat agaaaaatta gactatctaa aagccttggg gattgatgcc atttggatca 1620 acccacatta tgattctccg aacacggata atggttacga tatacgtgat tatcgaaaaa 1680 tcatgaaaga atatggcacg atggaggatt ttgaccgcct gatttctgaa atgaaaaaac 1740 ggaatatgcg gttgatgatt gatgtggtca tcaaccacac cagcgatcaa aacgaatggt 1800 ttgttaaaag taaaagcagt aaggataatc cttatcgcgg ctattatttc tggaaagatg 1860 ctaaagaagg gcaggcgcct aataattacc cttcattctt tggtggctcg gcgtggcaaa 1920 aagatgaaaa gaccaatcaa tactacctgc actattttgc taaacaacag cctgacctaa 1980 actgggataa tcccaaagtc cgtcaagatc tttatgcaat gttacgtttc tggttagata 2040 aaggcgtgtc tggtttacgt tttgatacgg tagcgaccta ctcaaaaatt ccggatttcc 2100 caaatctcac ccaacaacag ctgaagaatt ttgcagcgga gtataccaag ggccctaata 2160 ttcatcgtta cgtcaatgaa atgaataaag aggtcttgtc tcattacgac attgcgactg 2220 ccggtgaaat ctttggcgta cccttggatc aatcgataaa gttcttcgat cgccgccgtg 2280 atgagctgaa cattgcattt acctttgact taatcagact cgatcgagac tctgatcaaa 2340 gatggcgtcg aaaagattgg aaattgtcgc aattccggca gatcatcgat aacgttgacc 2400 gtactgcag 2409 <210> 2 <211> 321 <212> DNA <213> Protaminobacter rubrum <400> 2 ctgttgccta gtgtaatgcg agttgcccgc cggataaacc aataaccgca ttctccgcag 60 ggggccgaat tgtgcttttg ccaattgccc tgattaatca ttagcgttat agtcagaatg 120 cttattctca gggcggggtg caagtcccca ccggcggtaa atcaccttct acggtgaaag 180 cccgcgagcg ctcagccagt ctcttgtagt ttggttagag gtcagcagat ccggtgtaat 240 tccggggccg acggttatag tccggatggg agagagtaac ggtatctgcc gggcttgcgc 300 ccgcttgcgt tattttttta g 321 <210> 3 <211> 313 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 3 ctgtcgccta gtgtaatgcg agttgcccgc cggataaact atttaaccgc attccctgcg 60 gctggccgaa ttgtgctttt gccaattgcc ctgattaatc attagcgtta tagtcgagag 120 gcttattctc agggcggggt gcaagtcccc accggcggta aatcaccttc tacggtgaaa 180 gcccgcgagc gctcagccag tctcttgcag tttggttaga ggtcagcaga tccggtgtaa 240 ttccggggcc gacggttata gtccggatgg gagagagtaa cggtatctgc cgggtttgcg 300 cccgcttgcg tta 313 <210> 4 <211> 228 <212> DNA <213> Protaminobacter rubrum <400> 4 tcttaccggt tagtgttagt aaatatgtac gattctgcgt ttttttttag agctttatca 60 catcacactt gtaactttcg cgccacgttg tagactttac atcgccaagg ttgctctata 120 acgccagaaa aactggccga gtaacaaacg agggctcaaa ccttggcgaa ggaatttaac 180 caagggctta aaacagcttt aaagctcatt gcctatttgg atgataac 228 <210> 5 <211> 180 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 5 agagctttat cacatcacac ttgtaacttt cgcgccacgt tgtagacttt acatcgccaa 60 ggttgctcta taacgccaga taaactggca gagtaacaaa cgagggctca aaccttggcg 120 aaggaattta accaagggct taaaacagct ttaaagctca ttgcctattt ggatgataac 180 <210> 6 <211> 178 <212> DNA <213> Serratia marcescens <400> 6 agagccttat cacatcacac ttgtaacttt cgcgccacgt tgtagacttt acatcgccaa 60 ggttgctcta taacgtcaga aaaatcggcg agtaacaaac gagggcttaa accttggcga 120 aggaatttaa ccaagggctt aaacagcttt aaagctcatt gcctatttgg atgataac 178 <210> 7 <211> 109 <212> DNA <213> Protaminobacter rubrum <400> 7 gttttttgcc tctctagaat taggggattg agcgtgtggc cactttatgg tgtacatgtt 60 aatcttgcaa gaacacacca aaaagtaagt aacacccaaa aaggtaagt 109 <210> 8 <211> 59 <212> DNA <213> Erwinia carotovora <400> 8 tgtacaggtt aatgtaacaa gaacacacca ataagtgggt aacaccctaa aaggtaagt 59 <210> 9 <211> 209 <212> DNA <213> Protaminobacter rubrum <400> 9 ggtttgaacg ttgcgatttc ttccacagtt aaggaaaagt caccttgcta taacggtatc 60 agcagtggaa taatgcgttt actttccacg ttgattctcg ttaaacaggg aaaacggtgg 120 gattataaaa tttgtctgat ggcgcaaaaa cgcagcaatg gcgtaagacg taatgcgaaa 180 tcaaacaatt agcgggctgc gggttgcag 209 <210> 10 <211> 210 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 10 ggtttgaacg tttgcgattt cttccgcagt taaggaaaag tcaccttgct ataacagtat 60 cagcagtgga ataatgcgtt tactttccac gttgattctc gttaaacagg gaaaactgtg 120 gaattataaa atttgtctga tggcacaaaa acgcagcaat ggcgtaagac gtaatgtgaa 180 atcaaacaat tagcgggctg cgggttgcag 210 <210> 11 <211> 165 <212> DNA <213> Serratia marcescens <400> 11 ttgctataac ggcatcagca gtggaataat gcagtcactt tccgcgttga ttctcgttaa 60 acagggaaaa cggtggaatt ataaaatttg tctgatcgcg caaaaacgca gcaatggcgt 120 aagacgtaat gcgaaatcaa acaattagcg ggctgcgggt tgcag 165 <210> 12 <211> 242 <212> DNA <213> Protaminobacter rubrum <400> 12 tgtgtttctc ttcaccgcgt tgagatcgct gctcacatcg gtacatggcg gtaactgtcc 60 tcctgattgt acttgaaaaa cggctcagat aaacgccatg aaagaaactg tgcttttttt 120 cttctttttt ctgcttctgg tcttattctg ctcttgtcat atgcgggatt attgcgtaga 180 attcgcgccc tattgtgaat atttatagcg cgctctgtac taaacagttg ggcacgcgga 240 aa 242 <210> 13 <211> 242 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 13 tgtgtttctc ttcaccgcgt tgagatcgct gctcacatcg gtacatggcg gtaactgtcc 60 ctctgattgt acttgaaaaa cggcccagat aaacgccatg aaagaaactg tgcttttttt 120 cttctttttt ctgcttctgg tcttattctg ctcttgtcat acgctggatt attgcgtaga 180 attcgcgccc tattgtgaat atttatagcg cgctctgtac tgaacagttg ggcacgcgga 240 aa 242 <210> 14 <211> 120 <212> DNA <213> Protaminobacter rumbrum <400> 14 ccgatttttt cactttttat cggttttatg tgatccaggt tgtggacaaa atccggtcta 60 attgctgtac tgtactggac acaggttcag tgtcttacat tcacgttaaa ggtaagtttg 120 <210> 15 <211> 118 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 15 gattttttca ctctttatcg attttatgtg atccaggttg tggacaaaat cccgtctaat 60 tgctgtactg tattggacac atgtttagtg tctttcattc acgttaaagg taagtttg 118 <210> 16 <211> 115 <212> DNA <213> Yersinia pseudotuberculosis <400> 16 tttttcactt tttctctctt ttttgtgatc tccattgtgg acaaaaaacg gttctattgc 60 tgtactgtaa ttgacacaat ttttgtgtcc aacattcacg ttaaaggtaa gtttg 115 <210> 17 <211> 238 <212> DNA <213> Protaminobacter rubrum <400> 17 gcgatttttt cgcgatcctt cggggatctt tagctgttcg ggacttgagc acttacgcct 60 cagagcgtat actacgccac ctttgagaat cttgggtttg gcgtaagagc ctatctcagc 120 aggtttctaa cctgatgtgt ggtttctgac ctgatgacgg gagtctcctc agtatggagt 180 ttgctgagat gggctctaaa agcctgacga ggcggccata ccctatacga agctcgag 238 <210> 18 <211> 238 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 18 gcgatttttt cgcgatcctt ctgggatctt tagctgttcg ggacttgagc acttacgctt 60 cagagcgtat actacgccac ctttgagaat cttgggtttg gcgtaagagc ctatctcagc 120 aggtttccaa cctgatgtgt ggtttctaac ctgatgacga gagtctcctc agtatgaagt 180 ttgctgagat gggctctaaa agcctgacga ggcggccata ctctatacga agctcgag 238 <210> 19 <211> 237 <212> DNA <213> Serratia marcescens <400> 19 gcgatttttt cgcgatcttt gtgggatctt tagctgatcg ggaattgagc acttacgctt 60 cagagcgtat actacgccac ctttgagaat cttgggtttg gcgcaagagc ctatctcagc 120 aggtttgtga cctgatgtgt ggtttctacc tgatgacgag agtctcctca gtatgaagtt 180 tgctgagatg ggctctaaaa gcctgacgag gcggccatac cctatacgaa gctcgag 237 <210> 20 <211> 152 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 20 gggttaaccg ctttttttct gtcttcatct tcttcgactt taggctgctt tggagtaatg 60 gatacgcatt taagatatca cttgatattt taaatgcacc ccactaaatt aagatatcat 120 atgaactttg aaactcactt aagattttaa tg 152 <210> 21 <211> 86 <212> DNA <213> Serratia proteamaculans <400> 21 gcattcaaga tatcacttga tattttaaac ctctaccact agatttggat atcacttgaa 60 ctttgaaatt cacttaagat tttaat 86

Claims (21)

1. 야생형과 관련하여 적어도 2배 증가된 이소말툴로스 합성율을 가지는 미생물 세포.
2. 제1항에 있어서, 수크로스 뮤타제 SmuA의 부피 활성이 야생형과 관련하여 적어도 2배 증가된 세포.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 야생형과 관련하여 수크로스 뮤타제 SmuA의 기질 독립적 발현을 가지는 세포.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포가 게놈 내에 수크로스 뮤타제 SmuA를 코딩하는 smuA-유전자를 포함하고, 적어도 하나의 smuA-프로모터 성분이 다음에서 선택된, 적어도 하나의 다른 프로모터(대체 프로모터)에 의해 치환되는 세포:
   a) smuA-프로모터와 상이한, 세포의 내부 스템으로부터의 내생성 프로모터,
   b) a)에 따른 내생성 프로모터와 관련하여 상동인 외부 공여 스템의 프로모터, 및
   c) a) 또는 b)의 작용성 프로모터 단편.
5. 제4항에 있어서, 교환 프로모터가 디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제(ribB) 유전자의 프로모터, "외막 단백질"을 코딩하는 ompA 유전자의 프로모터, 추정 전사 레귤레이터 단백질 ECA 2934를 코딩하는 유전자의 프로모터, 리보뉴클레아제 E (me) 유전자의 프로모터, 50S 리보솜 L21-단백질의 오페론의 프로모터, 저온 충격 단백질 CspE의 오페론의 프로모터, 50S 리보솜 L28 단백질의 오페론의 프로모터, 및 NAD 의존성 에피머라제-데히드라타제 유전자의 프로모터를 포함하는 군에서 선택되는 세포.
6. 제5항에 있어서, 대체 프로모터가 서열번호 2 내지 21에 따른 뉴클레오티드 서열 및 적어도 85% 일치하는 서열을 가지는 상동성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 분자를 특징으로 하는 세포.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치환된 smuA-프로모터가 smuA와 오픈 리딩 프레임(ORF)에 위치된 상부 사이의 유전자간 영역에 국한되는 세포.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 어떠한 재조합 유전정보, 이종성(heterologic) 유전자 또는 유전자 단편을 포함하지 않거나 이들을 발현하지 않는 세포.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다음 속의 미생물을 포함하는 군에서 선택된 세포: 에스케리키아(escherichia), 살모넬라(salmonella), 세라티아(serratia), 에르위니아(erwinia), 엔테로박터(enterobacter), 클렙시엘라(klebsiella), 라우올텔라(rauoltella), 펙토박테리움(pectobacterium), 슈도모나스(pseudomonas), 아조토박터(azotobacter), 판토이아(pantoea), 로이카니아(leucanea), 및 프로타미노박터(protaminobacter).
10. 제9항에 있어서, 프로타미노박터 루브럼(protaminobacter rubrum)종의 개체에서 선택된 세포.
11. 제4항 내지 제6항에서 특성화된 대체 프로모터의 군에서 선택된 수크로스 뮤타제의 발현을 조절하는 성분을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
12. 제11항에 있어서, 수크로스 뮤타제를 발현할 수 있는 코딩 부분을 추가로 포함하고 그의 발현이 조절성분에 의해 제어되는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
13. 제11항 또는 제12항에 따른 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터.
14. 제11항 또는 제12항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자 또는 제13항의 벡터를 포함하는 세포.
15. 제14항에 있어서, 세포의 염색체 내에 제13항 또는 제14항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 세포.
16. 제14항에 있어서, 제14항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 염색체 외적(에피솜)으로 포함하는 세포.
17. - 세포의 야생형 스템을 제공하고
    - 제11항 또는 제12항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자 및/또는 제13항에 따른 벡터와 스템을 접촉시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에서 특성화된 세포의 제조방법.
18. 제1항 내지 제3항 중 하나에서 특성화된 미생물 세포의 제조를 위한 제11항 또는 제12항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자의 용도.
19. 제1항 내지 10항 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 따른 세포, 또는 제17항에 따른 방법에 따른 세포를 기질을 포함하는 배양배지에서, 기질을 이소말툴로스 또는 이소말툴로스 조성물로 전환할 수 있는 조건 하에서 배양하는, 이소말툴로스 또는 수크로스 기질을 포함하는 이소말툴로스 조성물의 생명공학적 제조방법.
20. 제19항에 있어서, 배양배지 및/또는 세포 중의 이소말툴로스 또는 이소말툴로스 조성물을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
21. 이소말툴로스 또는 수크로스 기질의 이소말툴로스 조성물의 생명공학적 제조를 개선하기 위한 제1항 내지 10항 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 따른 세포, 또는 제17항의 방법에 따라 제조할 수 있는 세포의 용도.
    

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