JPH09252789A - アカルビオシルトランスフエラーゼの製造方法並びにアカルボース同族体のアカルボースへの転化に際し、そしてアカルボース同族体の調製のためのその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アカルボースの効率のよい調製法に利用でき
る手段の提供。 【解決手段】 アカルビオシルトランスフェラーゼ（Ａ
Ｔ）、ＡＴを使用するアカルボース微量成分のアカルボ
ースへの転化法、ならびにＡＴをコードするＤＮＡを含
む発現ベクター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、放線菌類、主にアクチノプラー
ネス・エスピー(Actinoplanes sp.)ＳＥ５０／１３また
はＳＥ５０／１１０及びその突然変異体からのアカルビ
オシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、この酵素を単離、
精製、及び特性化するための方法、アカルビオシルトラ
ンスフェラーゼをコードしているａｃｂＤ遺伝子の単離
及び特性化、異種宿主生物におけるアカルビオシルトラ
ンスフェラーゼの発現、アカルボース微量成分をアカル
ボースに転化またはアカルボース同族体を調製するため
のアカルビオシルトランスフェラーゼの使用、アカルボ
ースの精製におけるアカルビオシルトランスフェラーゼ
の使用、及びアカルビオシルトランスフェラーゼを不活
性化することにより微量成分の形成を減少させる生産突
然変異体の調製に関する。

【０００２】

【従来の技術】一連の放線菌類、特にアクチノプラーネ
ス科が、グリコシド加水分解酵素（主として消化管の炭
水化物切断酵素）のオリゴ糖様インヒビターを形成する
という発見は、先の特許出願（例えば、ＤＥ２０ ６４
０９２及びＤＥ２２ ０９８３４）の主題である。こ
れらのインヒビターは、マルトオリゴ糖または他の糖に
１，４−グリコシド結合により連結したアカルビオシル
単位からなる。このアカルビオシルコアは、異なる数の
グルコース単位を両側に連結することができる。コアに
おけるグルコース単位の数は、インヒビターの比活性を
決定する。比較的短い分子（１−５グルコース単位を含
んでいる成分）は、主に二糖類に作用し、一方、α−ア
ミラーゼへの効果は、グルコピラノースの数が増加する
のにつれて、より効率的になる。この群の最も強力なα
−グルコシダーゼインヒビターとして、化合物、Ｏ−
４，６−ジデオキシ−４−［［１Ｓ−（１Ｓ，４Ｒ，５
Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒド
ロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］−ア
ミノ］−Ｄ−グルコピラノシル−（１４）−Ｏ−Ｄ−グ
リコピラノシル−（１４）−Ｄ−グルコピラノースを、
アカルボースとして記述する［ＤＥ２３ ４７ ７８
２］。

【０００３】アカルボースは、糖尿病の制御におけるヒ
ト医薬に用いられる。二次代謝物質アカルボースは、ア
クチノプラーネス・エスピーＳＥ５０（ＣＢＳ番号９６
１．７０）及びこの種の天然変異体ＳＥ５０／１１０
（ＣＢＳ６７４．７３）、そうでなければＳＥ５０／１
３（ＣＢＳ６１４．７１）［ＤＥ２２ ０９ ８３］、
並びにこれらの選択体及び突然変異体により形成され
る。この生来のサッカラーゼインヒビターの単離は、前
述の特許出願、例えば該ドイツ特許出願Ｐ２０ ０９
８３４の実施例１ないし４において記述されている。こ
の単離に関連して、主産物としてのアカルボースに加え
て、異なる数のマルトオリゴ糖及び二糖残基を有するア
カルビオシル含有化合物が微量成分として生じる。

【０００４】アカルボースは、アカルビオシル残基から
なり、現状の知識によると、アカルビオシル残基は、生
合成中にまず形成され、次にマルトシル残基に連結され
る。１９８６年に、アカルボースの生合成を解明するた
めに考案された研究の間に、Ｇｏｅｋｅ（Ｇｏｅｋｅ、
Ｋ．、Ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈ
ｕｎｇｅｎ ｚｕｍ Ｚｕｃｋｅｒｓｔｏｆｆｗｅｃｈ
ｓｅｌ ｕｎｄ ｚｕｒ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ ｄ
ｅｓ α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒｓ Ａｃａｒｂｏｓｅ ｂｅｉ Ａｃｔｉｎｏｐｌａ
ｎｅｓ ｓｐｅｃ．［Ｅｎｚｙｍｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉ
ｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｓｕｇａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ ａｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｏｆｔｈｅ α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒ ａｃａｒｂｏｓｅ ｉｎ Ａｃｔｉｎｏ
ｐｌａｎｅｓ ｓｐｅｃ．］；博士論文、Ｍｕｅｎｓｔ
ｅｒ大学）は、アカルボース（アカルビオシル−マルト
ース）のマルトシル残基が放射性標識したマルトースに
酵素的に交換される、すなわち、［Ｕ−¹⁴Ｃ］−マルト
ースを用いると、マルトシル残基において放射性標識さ
れたアカルボースが形成されることを記述した。関係す
る酵素、すなわちアカルビオシルトランスフェラーゼ
（ＡＴ）は、最初、プソイドジサッカリジル（ＰＤＳ）
トランスフェラーゼと命名された。細胞破砕及び分画遠
心後のペレット画分の活性は、上清画分のアカルボース
／マルトース交換反応より３．２５倍高いという事実か
ら、ＰＤＳトランスフェラーゼは、膜に結合していると
結論された。１９９１年に、Ｓｃｈａｐｅｒ（Ｓｃｈａ
ｐｅｒ、Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ ｕｎｄ ｐ
ｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｓｔｕｄｉｅｎ ｚｕｒ
Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ ｄｅｓ α−Ｇｌｕｃｏｓ
ｉｄａｓｅ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ａｃａｒｂｏｓｅ
［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ α−ｇｌｕｃｏｓｉ
ｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｃａｒｂｏｓｅ］；
博士論文、Ｍｕｅｎｓｔｅｒ大学）は、この発見を確認
し、この膜結合酵素のための詳細な調製方法を研究し
た。部分的に精製された酵素に対して、３０℃の至適温
度で、Ｍｎ²⁺を補因子として用いて、４．５の至適ｐＨ
が言及された。

【０００５】

【発明の構成】意外にも、今回、アカルボースのマルト
シル残基を交換する能力を有するアカルビオシルトラン
スフェラーゼが膜結合形態で存在せず、これに反して、
このＡＴは、細胞増殖と同時に増加する酵素活性を有
し、培養濾過物中に主に存在することが見いだされた。
細胞上清から高純度でこの酵素を単離することが可能で
あった。このために、硫酸アンモニウムを用いて培養上
清からこの酵素を沈殿させた。遠心分離後、この沈殿物
を（グリセロール及びＣａＣｌ₂を含んでいる）バッフ
ァーに溶解し、その後、この溶液をもう一度遠心分離
し、得られた上清を陰イオン交換カラムに通した。その
素通りは、アカルビオシルトランスフェラーゼを含んで
いた。透析により、この溶液からＡＴを部分的に濃縮し
た調製物として得、そうでなければ、ＤＥＡＥ−Ｆｒａ
ｃｔｏｇｅｌ（商標）のクロマトグラフィー、沈殿可能
なデンプンでの二回の沈殿、及びアカルボースまたはマ
ルトースでの脱離により精製した。

【０００６】精製したアカルビオシルトランスフェラー
ゼは、７６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分子量及び２
０−４０℃の至適温度を有する。この酵素は、約４０℃
まで温度安定である。Ｃａ²⁺イオン依存性及び６．２−
６．９の至適ｐＨを測定した。

【０００７】精製した酵素をシークエンスした。意外に
も、得られた塩基配列は、生産生物のアクチノプラーネ
ス種ＳＥ５０／１１０のアカルボース遺伝子群からのａ
ｃｂＤ遺伝子の対応するＤＮＡ配列にかなり一致するこ
とを示す。

【０００８】さらに意外にも、アカルビオシルトランス
フェラーゼは、アカルボースのマルトシル残基を他の糖
残基と置換してアカルボース同族体を形成することがで
き、または、発酵中に形成されるアカルボース様微量成
分の糖残基をマルトース残基と置換することによりアカ
ルボースを形成することができる。この関連において、
アカルビオシルトランスフェラーゼは、一般反応、 アカルビオシル−Ｘ ＋ Ｙ → アカルビオシル−Ｙ ＋
Ｘ （Ｘ＝グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖、及び
他の糖類、Ｙ＝グルコース、マルトース、マルトオリゴ
糖、及び他の糖類） を触媒している。

【０００９】従って、本発明は、以下の主題を開示す
る。

【００１０】アクチノプラーネス・エスピーＳＥ５０／
１１０またはその突然変異体の培養物から、アカルビオ
シルトランスフェラーゼを単離及び精製するための完全
な方法。

【００１１】精製したアカルビオシルトランスフェラー
ゼの特性化。

【００１２】この酵素をトシプシン切断後、１００アミ
ノ酸以上にわたって決定したアミノ酸配列。このアミノ
酸配列から得た塩基配列は、ａｃｂＤ遺伝子の塩基配列
にかなり一致することを示す。

【００１３】各糖残基をマルトースで置換することによ
り、アカルボース微量成分からのアカルボースの製造方
法。

【００１４】アカルボースのマルトース残基を他の適当
な糖残基で置換することにより、変化した薬理学的性質
を有するアカルボース同族体の製造方法。

【００１５】同時にアカルボース同族体をアカルボース
に転化しながら、培養液からアカルボースを単離する
（アフィニティークロマトグラフィー）ためのアカルビ
オシルトランスフェラーゼまたは固定化したＡＴの使
用。

【００１６】アカルビオシルトランスフェラーゼをコー
ドしているａｃｂＤ遺伝子の単離及び特性化。

【００１７】異種宿主生物におけるアカルビオシルトラ
ンスフェラーゼの組換え調製。

【００１８】ａｃｂＤ遺伝子を不活性化することにより
微量成分の不要な形成を遮断することで、アクチノプラ
ーネスにおける生産物範囲が生合成の所望する主産物と
してアカルボースに限定された、改善された生産突然変
異体の調製。

【００１９】を開示する。

【００２０】本発明を、以下に詳細に記述する。

【００２１】Ｉ．酵素の精製アクチノプラーネス・エス
ピーＳＥ５０／１１０またはその突然変異体の２段階増
殖からの培養濾過物。

【００２２】 生水 ＮａＯＨを用いてｐＨ７．２に調製 １２５ｍｌの容量まで満たした、１０００ｍｌのエルレ
ンマイヤーフラスコ 接種材料：５ｍｌのストック培養物（７２時間種培養、
２０℃で保存） インキュベーション：３０℃及び２６０ｒｐｍで７２時
間 生水 １２５ｍｌの容量まで満たした、１０００ｍｌのエルレ
ンマイヤーフラスコ 接種材料：５ｍｌの種母培養物 インキュベーション：３０℃及び２６０ｒｐｍで９６−
１４４時間 １２０時間の培養時間の後に、２．６ｎｋａｔ／ｍｌの
培養濾過物は最大ＡＴ活性に達する。ＡＴは、その時、
培養濾過物において量的に顕著なタンパク質である。

【００２３】精製スキームを表１に表す。

【００２４】表１ アカルビオシルトランスフェラー
ゼを精製するための方法以下のバッファーを用いた。

【００２５】バッファー１：２５ｍＭトリス／ＨＣｌ
ｐＨ８．５ ＋ １０％グリセロール ＋１ｍＭ ＣａＣｌ
₂ バッファー２：２５ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５ ＋
１ｍＭ ＣａＣｌ₂ バッファー３：１０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５ ＋
１ｍＭ ＣａＣｌ₂ バッファー４：０．１ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．２
＋ ０．０１ ｍＭ ＣａＣｌ₂ デンプン＊：煮沸した可溶性デンプン、４℃で１２時間
（「低温沈殿」）、４０，０００ ｘ ｇで６０分間遠心
分離、この沈殿物を用いる。

【００２６】 ダイズ粉／デンプン培養物 ↓ ３，０００ ｘ ｇ、１０分 培養濾過物 ｜ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄分画沈殿（２０−４０％飽和） ↓ ２５，０００ ｘ ｇ、３０分（２ｘ） 沈殿物 ｜ バッファー１に可溶化 ↓ ２５，０００ ｘ ｇ、３０分 上 清 ↓ ＤＥＡＥ−陰イオン交換カラム、０−１Ｍ ＮａＣｌ 素通り ↓ 透析（１２時間）、バッファー１ 透析内液(Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ) ↓ ＤＥＡＥ−陰イオン交換カラム、０−１Ｍ ＮａＣｌ ０．１５−０．３５Ｍ ＮａＣｌ画分 ｜ デンプン＊とインキュベーション（１２時間） ↓ ４０，０００ ｘ ｇ、６０分 沈殿物（バッファー２中） ｜ アカルボースとインキュベーション（２５ｍＭ、室温で２時間） ↓ ４０，０００ ｘ ｇ、６０分 上 清 ｜ バッファー３を用いて透析（３ｘ６時間） ｜ デンプン＊とインキュベーション（１２時間） ↓ ４０，０００ ｘ ｇ、６０分 沈殿物（バッファー３中） ｜ マルトースとインキュベーション（２５０ｍＭ、１２時間） ↓ ４０，０００ ｘ ｇ、６０分 上 清 ↓ バッファー４を用いて透析（３ｘ６時間） 精製されたＡＴ この精製を表２に要約する。

【００２７】

【表１】

【００２８】このＡＴの精製は、２４％の収率で１７．
８倍の精製度をもたらす。

【００２９】II．アカルビオシルトランスフェラーゼ活
性の測定 １．放射性試験 ａ）アカルビオシルトランスフェラーゼを含んでいる調
製物の存在下で、アカルボースまたはアカルボース同族
体を、トリス−マレイン酸塩バッファー（ｐＨ６．３）
中の［¹⁴Ｃ］−マルトースと３０℃でインキュベートし
た。次に、陽イオン交換樹脂を用いて、マルトースから
アカルボースを分離した。全放射能に対するアカルボー
ス画分における［¹⁴Ｃ］放射能のレベルは置換率を与
え、この置換率はＡＴ活性に相関関係がある。

【００３０】アカルビオシル−（α−１，４）−（糖）
＋ ［¹⁴Ｃ］マルトース→アカルビオシル−（α−１，
４）−［¹⁴Ｃ］−マルトース ＋ 糖 ｂ）（マルトース単位において標識された）［¹⁴Ｃ］−
アカルボースを、ａ）のようにＡＴの存在下でマルトオ
リゴ糖または他の糖と共にインキュベートした。この混
合物を、ａ）において記述したように処理し、評価し
た。

【００３１】アカルビオシル−（α−１，４）−
［¹⁴Ｃ］−マルトース ＋ 糖→アカルビオシル−（糖）
＋ ［¹⁴Ｃ］マルトース ２．薄層クロマトグラフィー アカルボースまたはアカルボース同族体を、ａ）におい
て記述したように、マルトース、マルトオリゴ糖、また
は他の糖とインキュベートした。この反応混合物は、１
０μｌのＡＴ調製物（０．１ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ
７．２ ＋ ０．０１ｍＭ ＣａＣｌ₂中のＡＴ；４．５ｎ
ｋａｔ／ｍｌ）、１０μｌのアカルボース（７０ｍＭス
トック溶液）またはアカルボース同族体（約３０ｍ
Ｍ）、１０μｌの基質（７０ｍＭストック溶液）または
マルトース（６００ｍＭ）を含んでいた。

【００３２】 ＴＬＣ：シリカゲル６０ＴＬＣアルミ箔（Ｍｅｒｃ
ｋ）、移動相：ブタノール：エタノール：水（５０：３
０：２０）；染色：Ｃｅｒスプレー試薬；１１０℃で顕
色 ３．ＨＰＬＣ試験 アカルボースまたはアカルボース同族体を、２において
記述したように、マルトース、マルトオリゴ糖、または
他の糖とインキュベートした。タンパク質を沈殿させた
後、残りの溶液の化学組成をＥＣＤ ＨＰＬＣまたはＵ
Ｖ ＨＰＬＣにより分析した。

【００３３】III．アカルビオシルトランスフェラーゼ
の特性 モル質量 ７６ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 至適ｐＨ ６．２−６．９ 至適温度 ３０℃（２０−４０℃） 温度安定性 約４０℃まで 微量元素依存 Ｃａ²⁺ 以下に挙げる受容体特異性に基づいて、受容体分子の以
下の一般式を推定できる。

【００３４】

【化１】

【００３５】Ｒ¹は、Ｈ、ＣＨ₂ＯＨ、またはＣＨ₃ Ｒ²は、Ｈ、（ＣＨ₂）_mＣＨ₃、ｍ＝０−１０ ピラノース［α（１−＞２）、（１−＞３）（１−＞
４）、（１−＞６、β（１−＞２）、（１−＞３）、
（１−＞４）］ フラノース［α（１−＞６）］ グルシトール、フェニルー、ニトロフェニルー、などＲ
³は、Ｏ、Ｓ、またはＣＨＯＨ 受容体特異性 セロビオース デオキシ−Ｄ−グルコース Ｄ−グルコン酸ラクトン Ｄ−グルコース イソマルトース イソマルトトリオース ラミナリビオース（３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル
−Ｄ−グルコース） マルトース マルトトリオース マルトテトラオース マルトペンタオース マルトヘキサオース マルトヘプタオース メチル−Ｄ−グルコピラノシド パラチノース（ｐａｌａｔｉｎｏｓｅ） パノース（ｐａｎｏｓｅ）（６−α−グリコシル−マル
トース）ソホロース（２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシ
ル−α−Ｄ−グルコース） キシロビオース Ｌ−キシロース Ｄ−キシロース ニゲロース Ｌ（−）−グルコース ５−チオ−Ｄ−グルコース ミオ−イノシトール マルチトール（ｍａｌｔｉｔｏｌ） アミグダリン アミロペクチン デキストリン α−Ｄ（＋）−マルトース−１−リン酸 ４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド ４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド Ｄ（−）−サリシン フェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド オクチル−Ｄ−グルコピラノシド ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシド デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド 供与体特異性 アカルボース アカルボース微量成分２ アカルボース微量成分４Ａ アカルボース微量成分４Ｂ アカルボース微量成分４Ｃ アカルボース微量成分Ｂ プソイドアカルボース IV．タンパク質シークエンシング Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７３Ａ気−
液 固相タンパク質シークエンサー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ
ｉｔｙ、ＣＡ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、アカルビオシ
ルトランスフェラーゼのフラグメントのＮ末端配列を分
析した。この装置のための標準的なシークエンシングプ
ログラムを用いた。装置、用いたプログラム、及びＰＴ
Ｈ分離系は、使用者マニュアル（ｕｓｅｒ’ｓ ｍａｎ
ｕａｌｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓ
ｔｅｍ ｍｏｄｅｌ ４７３Ａ（１９８９）、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ、ＣＡ ９４４０４、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に詳細に記述さ
れている。

【００３６】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
ＲＰ−１８カラム（２２０ｍｍ ｘ２ｍｍ、５μ基材）
を用いて、ＰＴＨアミノ酸をオンラインで検出した。全
てのＰＴＨアミノ酸の５０ｐＭ標準を用いて、ＰＴＨア
ミノ酸の同定及び定量を行った。データを評価するため
に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ ６１０Ａを用い
た。タンパク質シークエンサーに用いた化学薬品は、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｓｙｓｔｅｍｓから入手した。

【００３７】トリプシン消化したペプチドを分離するた
めに、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）Ｓｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。

【００３８】トリプシン消化したペプチドを分離するた
めのＨＰＬＣカラム（２．１ｍｍｘ １００ｍｍ；５μ
基材）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）から入手し、一方、トリプシン（シーク
エンス等級）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉ
ｍから入手し、全ての残りの化学薬品は、Ｍｅｒｃｋ
（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｉｇ
ｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から
入手した。

【００３９】V．ａｃｂＤ遺伝子（ＡｃｂＤタンパク質
＝ＡＴ）の単離及びシークエンシング別に示さないかぎ
り、全ての遺伝子操作法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；第２版、１９８９；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に記述された
ように行った。

【００４０】スクリーニングのために用いた遺伝子プロ
ーブを、プラスミドｐＡＳ２（ＤＥ１９５ ０７ ２１
４）から単離した。プラスミドｐＡＳ２を、熱処理法ま
たはアルカリ溶解により大腸菌ＤＨ５αから調製し、制
限酵素ＢａｍＨＩで加水分解した。得られた２．２ｋｂ
のＢａｍＨＩフラグメントを単離し、ニックトランスレ
ーションにより³²Ｐ−標識されたデオキシヌクレオチド
で放射性標識した。この標識したフラグメントを、アカ
ルボース生合成遺伝子（ＤＥ１９５ ０７ ２１４）を
単離するための遺伝子プローブとして用い、以下におい
てａｃｂプローブIIと命名する。

【００４１】アカルボース生合成遺伝子を、以下のよう
に単離した。アクチノプラーネス種ＳＥ５０／１１０か
らの染色体ＤＮＡを、制限酵素ＳｓｔＩで加水分解し、
ゲルクロマトグラフィーにより分離し、ａｃｂプローブ
IIを用いて、サザンハイブリダイゼーションにより相同
なＤＮＡ配列の存在を調べた。この遺伝子プローブがハ
イブリダイズしたＳｓｔフラグメントは、１１ｋｂの大
きさを有した。この１１ｋｂのＳｓｔＩフラグメントを
ゲルから溶出し、ベクターｐＵＣ１８に連結し、この組
換え体ベクターを、次に、大腸菌ＤＨ５αにクローン化
した。得られたプラスミドをｐＡＳ５と命名した。プラ
スミドｐＡＳ５を、制限酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄIII
で加水分解した。得られたフラグメントは、以下の大き
さ、１．４ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント ５．４ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント ０．０５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント ２．６ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメント ３．８ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント（ｐＵＣ１８ベクタ
ーに連結した１．１ｋｂＰｓｔＩ／ＳｓｔＩフラグメン
ト） を有した。

【００４２】２．６ｋｂのＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラ
グメントをゲルから溶出し、ｐＵＣ１８ベクターに連結
し、この組換え体ベクターを、次に、大腸菌ＤＨ５αに
クローン化した。得られたプラスミド（ｐＡＳ５／１
５．１）を様々な制限酵素で加水分解し、ｐＵＣ１８中
の得られたＤＮＡフラグメントを大腸菌ＤＨ５αにサブ
クローン化し、シークエンスした。ｐＡＳ５／１５．１
由来のこれらのフラグメントのＤＮＡ配列を確かめるた
めに、ＰＣＲ法によりアクチノプラーネス種の染色体Ｄ
ＮＡからＤＮＡフラグメントも増幅し、これらをｐＣＵ
１８に連結し、大腸菌ＤＨ５αにクローン化し、次いで
シークエンスした。これらのＰＣＲプライマーのＤＮＡ
配列は、ｐＡＳ５／１５．１からサブクローン化したフ
ラグメントのＤＮＡ配列から推定した（以下参照）。

【００４３】アクチノプラーネス種からの２．６ｋｂの
ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメントのＤＮＡ配列を決
定するために、以下のプラスミドを構築し、各場合にお
いてそのインサートＤＮＡの配列を決定した。

【００４４】ｐＡＳ５／１５．１ ＝ｐＡＳ５からの
２．６ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメント ｐＡＳ５／１５．２ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
０．７５ｋｂ ＳａｌＩフラグメント ｐＡＳ５／１５．３ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
０．５ｋｂ ＳａｌＩフラグメント ｐＡＳ５／１５．４ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
０．４ｋｂ ＳａｌＩフラグメント ｐＡＳ５／１５．５ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
０．３５ｋｂ ＳａｌＩフラグメント ｐＡＳ５／１５．６ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
１．２５ｋｂ ＰｖｕIIフラグメント ｐＡＳ５／１５．７ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
０．７ｋｂ ＰｖｕII／ＨｉｎｄIIIフラグメント ｐＡＳ５／１５．９ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
０．１ｋｂ ＰｖｕIIフラグメント ｐＡＳ５／１５．１２ ＝ｐＡＳ５／１５．１からの
０．９ｋｂ ＫｐｎＩ／ＮｃｏＩフラグメント ｐＡＳ５／１８ ＝０．３ｋｂ ＰＣＲフラグメ
ント（プライマー：表３参照） ｐＡＳ５／１９ ＝０．３ｋｂ ＰＣＲフラグメ
ント（プライマー：表３参照） Ｓａｎｇｅｒ等（１９７７）の方法、またはこれから由
来した方法をＤＮＡシークエンシングのために用いた。
Ａｕｔｏｒｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）
をＡｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｃｅ（Ａ．Ｌ．Ｆ．）ＤＮＡシークエンシング装置
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）と組み合わせて用いて、この仕事を行った。適当
なフルオレセイン標識したｐＵＣリバース-シークエン
シング及びシークエンシングプライマーを購入した（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）。

【００４５】表３ ＰＣＲ及びシークエンシング反応用プライマーの配列 ＰＣＲ用プライマー： プラスミドｐＡＳ５／１８： プライマーの名称 配列 ａｃｂＤ３ 5'ＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ3' ａｃｂＤ４ 5'ＡＧＣＧＧＣＡＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＧＧＣＧ3' プラスミドｐＡＳ５／１９： プライマーの名称 配列 ａｃｂＤ５ 5'ＡＣＣＧＧＣＴＣＧＡＡＣＧＧＧＣＴＧＧＣＡＣＣ3' ａｃｂＤ６ 5'ＣＣＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧ3' シークエンシング反応用プライマー： プライマーの名称 配列 ユニバーサルプライマー 5'ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ3' リバースプライマー 5'ＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ3'

【００４６】

【実施例】

例１．アカルビオシルトランスフェラーゼの調製、精
製、及び特性化 ダイズ粉／グリセロール培地での種培養後、野生株のア
クチノプラーネス種５０／１１０またはそれ由来の突然
変異体を、２６０ｒｐｍの振とう数を有しているオービ
タルシェーカーで、３０℃で、ダイズ粉／デンプン培地
の生産培養で発酵させた。約１２０時間続いたインキュ
ベーション後、細胞集団を分離した。硫酸アンモニウム
（２０−４０％飽和）を用いて、培養上清から酵素を沈
殿させた。遠心分離後、沈殿をバッファー（グリセロー
ル及びＣａＣｌ₂を含んでいる、２５ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．５）に溶解し、この溶液をもう一度遠心分
離した。得られた上清をＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに
通した。その素通りは、アカルビオシルトランスフェラ
ーゼを含んでいた。この溶液から、ＡＴを、透析により
部分的に濃縮した調製物として得るか、または、ＤＥＡ
Ｅ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ^Rのクロマトグラフィー、デン
プンでの２回の沈殿、及びアカルボースまたはマルトー
スでの脱離により精製した（表１参照）。２４％の収率
で１７．８倍の精製度が得られた。

【００４７】アカルボース（供与体）のアカルビオシル
残基をマルトース（受容体）に転移することにより、ア
カルビオシルトランスフェラーゼの活性を測定した。
６．２−６．９の至適ｐＨ、並びに２０及び４０℃の間
の至適温度を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、酵素の大
きさを７６，０００Ｄａであると決定した。

【００４８】例２．アカルビオシルトランスフェラーゼ
のシークエンシング 内部アミノ酸配列を決定するために、アカルビオシルト
ランスフェラーゼをトリプシンで消化した。トリプシン
は、アミノ酸のリジン及びアルギニンの後ろでタンパク
質を切断する。

【００４９】ＡＴのトリプシン切断：約１ｍｇのＡＴ
を、１０００μｌの６Ｍ塩化グアニジニウム／０．５Ｍ
トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ｐＨ
８．６に溶解した。３０μｌの１Ｍジチオトレイトール
（ＤＴＴ）を加えた後、サンプルを一晩５４℃で還元し
た。６０μｌの２Ｍヨード酢酸ナトリウム溶液を加えた
後、サンプルを暗所で３０分間インキュベートした。そ
の後、０．５Ｍ尿素／０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムに
対して透析した（３時間及び一晩後に完全なバッファー
交換；２５ｋＤ排除の透析袋）。このようにして前処理
したサンプルを、２０μｇのトリプシン（シークエンス
等級）の存在下で３７℃で１８時間消化した。遠心機中
で乾燥することにより、このサンプルを約１００μｌま
で濃縮した。

【００５０】トリプシン消化したペプチドのＨＰＬＣ分
離：サンプルの１／３をＲＰ−１８カラム（２．１ｍｍ
ｘ １００ｍｍ；５μ基材）に添加し、Ｓｍａｒｔ Ｓ
ｙｓｔｅｍ（溶液Ａ：０．１％ ＴＦＡ、溶液Ｂ：０．
１％ ＴＦＡ／６０％ ＡＣＮ、検出：２１５ｎｍ、流
速：０．１５ｍｌ／分、室温；濃度勾配：７分 ０％
Ｂ、５２分 ７０％、５４分 １００％Ｂ）を用いて分離
した。ＡＴは高分子量であるので、トリプシン消化中に
非常に複雑な混合物が形成される。従って、次のシーク
エンシングのためのきれいなペプチドを得るために、個
々のフラクションのリクロマトグラフィーが必要であ
る。

【００５１】分離フラクションのリクロマトグラフィ
ー：ペプチドを含んでいるフラクションをまとめ、遠心
機中で乾燥することにより濃縮した。これらの濃縮物
を、ＲＰ−１８カラム（２．１ｍｍ ｘ １００ｍｍ；５
μ基材）でリクラマトグラフィー（溶液Ａ：０．０２５
Ｍ ＮＨ₄Ａｃ、溶液Ｂ：０．０２５Ｍ ＮＨ₄Ａｃ／６０
％ＡＣＮ、ｐＨ６；検出：２１５ｎｍ、流速：０．１５
ｍｌ／分、室温；濃度勾配：０分 ０％Ｂ、３３分 ６０
％、３８分 １００％Ｂ）を行った。最初の分離からの
フラクション２８＋２９（Ｓｍａｒ４００３）及びフラ
クション３０（Ｓｍａｒ４００２）を異なるクロマトグ
ラフィー条件を用いてリクロマトグラフィーした後、得
られたこれらのペプチドの純度は、Ｎ末端配列をシーク
エンシングするのに適当であった。

【００５２】Ｎ末端配列のシークエンシング：例えば、
リクロマトグラフィー（Ｓｍａｒ４００２）のフラクシ
ョン３２を、遠心機中で乾燥することにより蒸発させ
た。ペプチドをＴＦＡに溶解し、シークエンシングのた
めにＢｉｏＢｒｅｎｅ（商標）で前処理したガラスファ
イバーフィルターに添加した。「迅速−標準（ｆａｓｔ
−ｎｏｒｍａｌ）」シークエンサーサイクルを用いて、
ペプチドをシークエンスした。５０ｐｍｏｌのＰＴＨ標
準を用いて、ＰＴＨアミノ酸を同定、定量した。Ｎ末端
配列分析の結果を表４に記す。ＡＴ由来の８個のトリプ
シン消化ペプチドから、合計１３３アミノ酸を分析し
た。

【００５３】表４ アカルビオシルトランスフェラーゼ由来のトリプシン消化ペプチドのＮ末 端配列 １．１． フラクション２８＋２９（Ｓｍａｒ４００３）のリクロマトグラフ ィー １．２． リクロマトグラフィーのフラクション３５ １ Asn-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Ile-Trp-Ile-Ser-Pro-His-Val-Asp-Asn-Ile-Asn-Val- ２２ ２３ Pro-Ala-Ala-Gly-(Gly)‥ ２．１ フラクション３０（Ｓｍａｒ４００２）のリクロマトグラフィー ２．２ リクロマトグラフィーのフラクション３２ １ Thr-Gly-Lys-Pro-Val-Pro-Val-Gln-Phe-Thr-Val-Gln-Asn-Pro-Pro-Ala-Thr-Ala- ２１ Pro-Gly-Glu‥ ２．３ フラクション２５（Ｓｍａｒ４００４）のリクロマトグラフィー ２．３．１ リクロマトグラフィーのフラクション３１ １ Ser-Thr-Val-Ala-Pro-Val-Leu-Gly-Ala-Gly-Gln-Val-Ala-Val-Trp-Ser-Tyr-Arg １８ ２．３．２．リクロマトグラフィーのフラクション２５＋２６ １ Tyr-Gln-Asp-Gln-Tyr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Asp-Ile-Ala-Asp-Leu-Asp-Gln-Gln-Asn- ２０ Pro-(Arg) ２．４ フラクション２１（Ｓｍａｒ４００５）のリクロマトグラフィー ２．４．１．リクロマトグラフィーのフラクション２３ １ １２ Trp-Ile-Asn-Asp-Asp-Val-Tyr-Val-Tyr-Glu-Arg-Leu‥ ２．５ フラクション３１＋３２（Ｓｍａｒ４００１）のリクロマトグラフ ィー ２．５．１ リクロマトグラフィーのフラクション３０ １ Asp-Tyr-Leu-Tyr-Glu-Gln-Asp-Leu-Ile-Thr-Phe-Leu-Asp-Asn-Gln-Asp-Thr-Arg １８ ２．６ フラクション１６＋１７（Ｓｍａｒ４００７）のリクロマトグラフ ィー ２．６．１ リクロマトグラフィーのフラクション１７ １ ９ Asp-Asp-Ala-Asn-Tyr-Trp-Met-Asp-Arg ２．７ フラクション２０（Ｓｍａｒ４００７）のリクロマトグラフィー ２．７．１ リクロマトグラフィーのフラクション１１ １ １２ Ala-Val-Leu-Thr-Gly-Asn-Thr-Val-Tyr-Asp-Trp-Lys 例３．アカルボース同族体のアカルボースへの転化 ＡＴの供与体特異性の試験において、アカルボース微量
成分２、４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、成分Ｂ、及びプソイドアカ
ルボースのようなアカルボース

【００５４】

【化２】

【００５５】同族体を、アカルビオシルトランスフェラ
ーゼの存在下で、マルトースと共に実験混合物中で処理
した。３０℃で２４時間の反応時間の後、これらの実験
混合物を、ＵＶ検出を用いたアミノ相のＨＰＬＣにより
分析した。この評価（表５）は、アカルボースの量が増
加するのに対して、微量成分の量は減少する、すなわ
ち、アカルボース微量成分２、４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃか
らマルトースへのアカルビオシル単位の転移があること
を示す。

【００５６】表５ アカルボース微量成分２、４Ａ、４
Ｂ、及び４Ｃをアカルボースに転化するためのＡＴの使
用

【００５７】

【表２】

【００５８】成分Ｂ及びプソイドアカルボースで微量の
転化が見られる。

【００５９】例４．アカルボースからのより高級なアカ
ルボース同族体の単離 ＡＴの受容体特異性の試験において、適度に高濃度のマ
ルトオリゴ糖及び他の糖の存在下で、アカルボースをア
カルビオシルトランスフェラーゼと共に実験混合物中で
反応させた。３０℃で１８時間の反応時間の後、これら
の実験混合物を，ＵＶ検出を用いたアミノ相のＨＰＬＣ
により分析した。この評価（表６）は、新たに合成され
た糖を検出し、一方、マルトースがこれに付随して遊離
されることを示す。

【００６０】

【表３】

【００６１】放射性試験においてＡＴ活性を測定した
時、デキストリンでも交換が見られた。

【００６２】オリゴ糖 相対活性（％） マルトース １００ マルトトリオース ２７ マルトテトラオース ４０ マルトヘプタオース ４９ セロビオース １５ デキストリン ４５ 例５．ＡＴを用いてアカルボースを調整するための改変
した工程 原則として、以下の原理に従って、同時にアカルボース
同族体をアカルボースに転化しながら、培養溶液からア
カルボースを濃縮するために、ＡＴにより触媒される反
応を用いることもできる。

【００６３】１）アカルビオシルトランスフェラーゼの
存在下で、アカルボースまたはアカルボース同族体［ア
カルビオシル−（Ｇ）_n］を高分子量のデキストリンま
たはデンプン［（Ｇ）_m］と反応させ、 アカルビオシル−（Ｇ）_n ＋ （Ｇ）_m→ アカルビオシ
ル−（Ｇ）_m ＋ （Ｇ）_n 透析または多糖類を沈殿させることにより低分子量の夾
雑物を除き、次に、 ２）マルトースと反応させ、アカルボースを遊離させ
る。

【００６４】アカルビオシル−（Ｇ）_m ＋ マルトース
→ アカルボース ＋ （Ｇ）_m デンプン及び固定化したＡＴを用いた反応器（例えば、
カラム）でも、同じ結果を得ることができる。

【００６５】-未精製のアカルボース溶液をデンプン／
ＡＴカラムに通し、 -夾雑物を除くために洗浄し、 -マルトースでアカルボースを溶出する。

【００６６】上の反応方法において、Ｇはグルコースを
表し、各場合におけるｍ及びｎは、異なるｍ及びｎで、
１及び２０の間の整数を表す。

【００６７】例６．大腸菌株の培養、プラスミドＤＮＡ
の調製、及びＤＮＡフラグメントの単離 大腸菌ＤＨ５αを、ＬＢ培地中３７℃でインキュベート
した。プラスミドを保有しているバクテリアを、選択圧
下（アンピシリン、１００μｇ／ｍｌ）で維持した。培
養を、２７０ｒｐｍでオービタルシェーカーで行った。
少なくとも１６時間培養した混合物を、一晩培養菌（Ｏ
Ｃ）と命名した。

【００６８】選択圧下でインキュベートしたＯＣの１．
５ｍｌからの細胞を、プラスミドＤＮＡを調製するため
に用いた。アルカリＳＤＳ溶解法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及
びＤｏｌｙ、１９７９）を用いてプラスミドを単離し
た。

【００６９】ベクターＤＮＡの特異的な加水分解のため
に、製造業者の説明書（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｅｇｇｅｎ
ｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、専ら、制限酵
素を用いた。１０μｇのプラスミドＤＮＡを消化するた
めに５Ｕの適切な制限酵素を用い、３７℃で２時間イン
キュベーションを行った。完全な加水分解を保証するた
めに、同量の制限酵素をもう一度加え、この混合物をも
う一度少なくとも１時間インキュベートした。

【００７０】ＤＮＡフラグメントの大きさにより、切断
したＤＮＡを０．５−１．２％の水平アガロースゲル上
で電気泳動的に分離した。ＤＮＡを溶出するために、Ｄ
ＮＡフラグメントを含むゲル片を滅菌したメスで切り出
し、重さを量った。このＤＮＡフラグメントを、次に、
製造業者の説明書（Ｇｅｎｏｍｅｄ、Ｂａｄ Ｏｅｙｎ
ｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、ＪＥＴｓｏ
ｒｂキットを用いてアガロースから溶出した。

【００７１】例７．アクチノプラーネス種ＳＥ５０／１
１０の生育、調製、染色体ＤＮＡの切断、及びゲル電気
泳動分離 アクチノプラーネス種ＳＥ５０／１１０を、オービタル
シェーカーでＴＳＢ培地中、３日間、３０℃でインキュ
ベートした。種培養（５ｍｌ）を小培養管中で２４０ｒ
ｐｍで行う一方で、本培養（５０ｍｌ）を５００ｍｌの
バッフル付きフラスコ中で１００ｒｐｍで行った。培養
後、遠心分離により細胞を沈殿させ、ＴＥバッファーで
２回洗浄した。

【００７２】１．５−２ｍｇの細胞（新鮮重量）を用い
て、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｈｏｐｗｏｏｄ
等、１９８５）により、全ＤＮＡを調製した。２０μｇ
の染色体ＤＮＡを、適当なバッファー中、１０Ｕの適切
な制限酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉ
ｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃で２時間加水分解した。
完全な加水分解を保証するために、同量の制限酵素をも
う一度加え、この混合物をもう一度少なくとも１時間イ
ンキュベートした。

【００７３】切断したＤＮＡを、０．６％の水平アガロ
ースゲル上で電気泳動的に分離した。

【００７４】これらのＤＮＡフラグメントを、ＪＥＴｓ
ｏｒｂキットを用いてもう一度溶出した（実施例６参
照）。

【００７５】例８．ａｃｂ遺伝子プローブIIの調製 実施例６において記述したように調製したｐＡＳ２から
のフラグメントを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｅｇｇｅｎｓ
ｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙにより供給されたニックトラ
ンスレーションシステムで、その説明書に従って放射性
標識した。０．５−１．０μｇのＤＮＡフラグメントを
このために用いた。［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ
／ｍＭ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。次に、この混合物を１
０分間煮沸し（変性）、すぐにハイブリダイゼーション
溶液（実施例９参照）に加えた。

【００７６】例９．ＤＮＡの膜への移行、ＤＮＡのハイ
ブリダイゼーション（サザンハイブリダイゼーショ
ン）、及びオートラジオグラフィー サザントランスファー法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７
５）により、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから
膜へ移した。実施例７において記述したようにして得た
アガロースゲルを、０．２５Ｍ ＨＣｌ中で２０分間洗
った。このゲルを、３層の３ＭＭ Ｗｈａｔｍａｎ濾紙
（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｅｎｇｌａｎ
ｄ）の上に置き、このゲルの上にＨｙｂｏｎｄ−Ｎ⁺膜
（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を気泡が形成されないように置い
た。次に、数枚の吸い取り紙をこの膜の上に置いた。次
に、このフィルターの積み重ねたものに、約１ｋｇの荷
重をかけた。０．４Ｍ ＮａＯＨで吸い上げることによ
り、ＤＮＡを移行させた。少なくとも１２時間の移行時
間の後、ナイロンフィルターを２ ｘ ＳＳＣで５分間洗
い、空気乾燥した。

【００７７】次に、これらのナイロンフィルターを、水
浴中、５０−１００ｍｌのプレハイブリダイゼーション
溶液中で少なくとも２時間６８℃で振とうした。この
間、少なくとも２回溶液を変えた。ハイブリダイゼーシ
ョンオーブン中で、少なくとも１２時間ハイブリダイゼ
ーションを行った。ａｃｂプローブII（実施例８）を含
んでいる１５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液を用い
た。

【００７８】続いて、これらのナイロンフィルターを、
６ｘ Ｐｏｓｔｗａｓｈ及び１ｘ Ｐｏｓｔｗａｓｈで各
１５分間洗浄した。次に、ナイロンフィルターを、気密
性フィルムでなお湿っているように覆った。増感紙を用
いて、耐光性カセット中、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）で少なくとも１６時間−８０℃でオートラ
ジオグラフィーを行った。

【００７９】例１０．アクチノプラーネス種ＳＥ５０／
１１０の全ＤＮＡからのＳｓｔＩフラグメントの単離及
びクローニング アクチノプラーネス種の染色体ＤＮＡをＳｓｔＩで完全
に加水分解し、アガロースゲル電気泳動により分離し、
９．０ないし１２ｋｂの長さのＤＮＡフラグメントをア
ガロースから溶出した（実施例６参照）。ベクタープラ
スミドｐＵＣ１８を大腸菌ＤＨ５αから調製し、Ｓｓｔ
Ｉで加水分解し、製造業者の説明書に従って、アルカリ
ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理した。混合液中に存在す
るＤＮＡが０．０１−０．１μｇで、ベクターに対する
フラグメントの割合が３：１で、２０μｌの容量中、ラ
イゲーションを行った。適当なバッファー（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ、Ｅｇｇｅｎsｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共
に、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いた。形質転換コン
ピテントである大腸菌ＤＨ５α細胞を、完全なライゲー
ション混合液で、（Ｈａｎａｈａｎ、１９８３に従っ
て）形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体を、
ＬＢ−Ａｍｐ選択プレート（アンピシリン、１００μｇ
／ｍｌ）に移した。

【００８０】例１１．アカルボース生合成群からの１１
ｋｂ ＳｓｔＩフラグメントを含むプラスミドの同定 アンピシリン耐性の形質転換体を、ａｃｂプローブIIと
ハイブリダイズする１１ｋｂのＳｓｔＩフラグメントの
存在に関して調べた。各場合において、これらのクロー
ンの１０個を選択プレート上にひろげ、一晩インキュベ
ートし、３ｍｌのＬＢ培地でプレートから洗い取った。
次に、そのような１０クローンのプール２０から、（Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ、１９７９の方法を用い
て）プラスミドＤＮＡを単離した。ポリリンカーからク
ローン化したＳｓｔＩフラグメントを除くために、２０
の異なるプラスミド調製物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
ＨｉｎｄIIIで加水分解した。これらの制限混合物を、
次に、０．６％アガロースゲル上で電気泳動的に分画
し、サザントランスファーにより、ＤＮＡをアガロース
ゲルからナイロンフィルターへ移した（実施例９参
照）。ａｃｂプローブIIを用いて、もう一度ハイブリダ
イゼーションを行った（実施例９参照）。これらのプー
ルの一つがａｃｂプローブIIと陽性に反応し、これを１
０の個々のクローンに分けた。これらのクローンのプラ
スミドを同様に単離し、上記の方法に供した。ハイブリ
ダイズしたプラスミドをｐＡＳ５と命名した。このプラ
スミドは、１０．６５ｋｂのＳｓｔＩフラグメントを含
む。

【００８１】例１２．２．６ｋｂ ＨｉｎｄIII／Ｐｓｔ
Ｉフラグメントのクローニングさらなる読み枠を同定で
きるように、プラスミドｐＡＳ５からいくつかのＨｉｎ
ｄIII／ＰｓｔＩサブクローンを調製した。このため
に、プラスミドｐＡＳ５を制限酵素ＨｉｎｄIII及びＰ
ｓｔＩで加水分解した。以下のフラグメント、 １．４ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント ５．４ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント ０．０５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント ２．６ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメント ３．８ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント（ｐＵＣ１８ベクタ
ーに連結した１．１ｋｂＰｓｔＩ／ＳｓｔＩフラグメン
ト） を得た。

【００８２】得られたＤＮＡフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動により分離し、ゲルから溶出した（実施例
６参照）。ｐＵＣ１８ベクタープラスミドを大腸菌ＤＨ
５αから調製し、ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩで加水分解
し、製造業者の説明書に従ってアルカリホスファターゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）で処理した。２．６ｋｂのＨｉｎｄIII／Ｐｓ
ｔＩフラグメントをクローン化した。実施例１０におい
て記述したように、ライゲーション及び形質転換を行っ
た。２．６ｋｂのＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメント
を保有しているプラスミドを、ｐＡＳ５／１５．１と命
名した。

【００８３】例１３．アクチノプラーネス種の染色体Ｄ
ＮＡからの２つの０．３ｋｂＤＮＡフラグメントの増幅
及びクローニング プラスミドｐＡＳ５／１５．５及びｐＡＳ５／１５．６
にクローン化したＤＮＡ断片間で重複しているＤＮＡ領
域をシークエンスするために、これらのプラスミドの既
知のＤＮＡ配列から２個のプライマー（ａｃｂＤ３及び
ａｃｂＤ４）を合成した（実施例１４参照）。これらの
プライマーを用いて、アクチノプラーネス種の染色体Ｄ
ＮＡから０．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅した。
変性温度は９５℃（１分）で、アニーリング温度は６８
℃（２０秒）で、プライマーの伸長は７２℃（２０秒）
で行った。２５の増幅サイクルを行った。製造業者の説
明書（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）に従って、Ｔａｑポリメラーゼを用い
た。ＰＣＲ混合液は、５％ホルムアミドを含んでいた。
ＢＩＯＭＥＴＲＡ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｙｃｌｅｒ
（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＰＣＲ反
応に用いた。ＰＣＲ反応液をエタノールで沈殿させ、次
に、そのＤＮＡを（ＨｉｎｄIIIで加水分解した）ｐＵ
Ｃ１８に連結し、この組換え体プラスミドを大腸菌ＤＨ
５αにクローン化した。プラスミドｐＡＳ５／１５．４
及びｐＡＳ５／１５．２間で重複しているＤＮＡ領域を
シークエンスするために、同じ実験混合液を用いて、プ
ライマーａｃｂＤ５及びａｃｂＤ６により別の０．３ｋ
ｂのＤＮＡフラグメントを増幅し、次いでクローン化し
た。

【００８４】ｐＡＳ５／１５．１８及びｐＡＳ５／１
５．１９． クローニング後、プライマーａｃｂＤ３及
びａｃｂＤ４で増幅されたＰＣＲフラグメントは、サブ
クローンｐＡＳ５／１５．１８を生じ、一方、プライマ
ーａｃｂＤ５及びａｃｂＤ６で増幅されたＰＣＲフラグ
メントは、サブクローンｐＡＳ５／１５．１９を生じ
た。

【００８５】例１４．プラスミドｐＡＳ５からのフラグ
メントのサブクローニング 二本鎖ＤＮＡの配列を解明するために、いくつかのフラ
グメントをプラスミドｐＡＳ５からサブクローン化した
（図１）。

【００８６】ｐＡＳ５／１５．１． プラスミドｐＡＳ
５を、制限酵素ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩで加水分解し
た。５個のフラグメントが生じ（実施例１２参照）、そ
れらのうちの２．６ｋｂのＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラ
グメントをクローン化した。このために、制限混合物を
０．７％アガロースゲル上で分離し、２．６ｋｂのＨｉ
ｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメントをゲルから溶出し（実
施例６参照）、（ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩで加水分解し
た）ｐＵＣ１８に連結し、この組換え体プラスミドを大
腸菌ＤＨ５αにクローン化した。

【００８７】ｐＡＳ５／１５．２；ｐＡＳ５／１５．
３；ｐＡＳ５／１５．４；ｐＡＳ５／１５．５． プラ
スミドｐＡＳ５／１５．１を、制限酵素ＳａｌＩで加水
分解した。得られた６個のフラグメントを１％アガロー
スゲル上で分離した。これらのフラグメントは、以下の
大きさ、すなわち、０．７５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．４
ｋｂ、０．３５ｋｂ、０．０５ｋｂ、及び３．２ｋｂ
（ｐＵＣ１８に連結した０．５ｋｂフラグメント）を有
した。サブクローニングのために取っておいたこれらの
フラグメントをゲルから溶出した（実施例６参照）。実
施例６において記述したように、制限酵素ＳａｌＩを用
いて、サブクローニングのためにｐＵＣ１８ベクターを
調製した。実施例１０において記述したように、ライゲ
ーションを行った。０．７５ｋｂのフラグメントを調製
したｐＵＣ１８に連結し、プラスミドｐＡＳ５／１５．
２を生じた。０．５ｋｂのフラグメントを調製したｐＵ
Ｃ１８に連結した後、プラスミドｐＡＳ５／１５．３を
得た。プラスミドｐＡＳ５／１５．４は、０．４ｋｂの
フラグメントを含み、０．３５ｋｂのフラグメントは、
プラスミドｐＡＳ５／１５．５の構成要素である。

【００８８】ｐＡＳ５／１５．６；ｐＡＳ５／１５．
７；ｐＡＳ５／１５．９． プラスミドｐＡＳ５／１
５．１を、制限酵素ＰｖｕIIで加水分解した。生じた５
個のフラグメントを１．２％アガロースゲル上で分離し
た。これらのフラグメントは、以下の大きさ、 １．２５ｋｂ ＰｖｕIIフラグメント ０．１５ｋｂ ＰｖｕIIフラグメント ０．８ｋｂ ＰｖｕIIフラグメント（ｐＵＣ１８からの
０．１ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＰｖｕIIフラグメントに連結
した０．７ｋｂ ＰｖｕII／ＨｉｎｄIIIフラグメント） ０．６６ｋｂ ＰｖｕIIフラグメント（ｐＵＣ１８から
の０．１６ｋｂ ＰｓｔＩ／ＰｖｕIIフラグメントに連
結した０．５ｋｂ ＰｖｕII／ＰｓｔＩフラグメント） ２．４ｋｂ ＰｖｕIIフラグメント（ｐＵＣ１８ベクタ
ーの残り） を有した。

【００８９】１．２５ｋｂのフラグメントを（Ｈｉｎｃ
IIで加水分解した）ｐＵＣ１８に連結し、この組換え体
プラスミドを大腸菌ＤＨ５αにクローン化し、プラスミ
ドｐＡＳ５／１５．６を生じた。ＨｉｎｃIIで加水分解
したｐＵＣ１８ベクタープラスミドに０．８ｋｂのフラ
グメントをクローニングした後、プラスミドｐＡＳ５／
１５．７を得た。プラスミドｐＡＳ５／１５．９は、
０．１５ｋｂのフラグメントを含む。

【００９０】ｐＡＳ５／１５．１２． プラスミドｐＡ
Ｓ５／１５．１を、制限酵素ＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで加
水分解した。得られた０．９ｋｂのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ
フラグメントを１．２％アガロースゲルから溶出し（実
施例６参照）、（ＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで加水分解した）
ベクターｐＵＣＢＭ２１に連結し、この組換え体ベクタ
ーを大腸菌ＤＨ５αにクローン化し、これは、プラスミ
ドｐＡＳ５／１５．１２を生じた。

【００９１】例１５．アクチノプラーネス種の２．６ｋ
ｂ ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメントのＤＮＡシーク
エンシング 実施例１３及び１４において記述したプラスミドをシー
クエンスした。一つの調製物からの６−８μｇのプラス
ミドＤＮＡ（実施例６参照）をシークエンシング反応に
用いた。Ａｕｔｏ−ｒｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキ
ット（Ｐｈｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）を用いて、シークエンシング反応を行った。二
本鎖ＤＮＡをシークエンシングするための標準的なプロ
トコルを用いた。Ａ．Ｌ．Ｆ．を用いてヌクレオチド配
列を解明できるように、シークエンシング反応のための
開始分子として、フルオレセイン標識したユニバーサル
及びリバースシークエンシングプライマーを用いた（表
３参照）。ゲルを調製するために、８ｍｌのＨｙｄｒｏ
Ｌｉｎｋ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（Ｓｅｒｖａ、Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、３３．６ｇの
尿素、８ｍｌの１０ｘ ＴＢＥバッファー、及び８０ｍ
ｌまでのＨ₂Ｏを混合し、この混合物を濾過滅菌し、１
分間脱気した。３５０μｌの１０％（Ｗ／Ｖ）過硫酸ア
ンモニウム及び４０μｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチレンジアミンを加えることにより、重合を開始し
た。この溶液を、ゲル型（５０ ｘ ５０ ｘ ０．０５ｃ
ｍ）に流し込んだ。電気泳動を、４５℃の定温で、３８
Ｗで行った。１ｘ ＴＢＥバッファーを泳動バッファー
として用いた。電気泳動装置を制御するためにも用いた
（Ａ．Ｌ．Ｆ．Ｍａｎａｇｅｒ ２．５プログラム；Ｐ
ｈｒｍａｃｉａ）連結したコンピューター（Ｃｏｍｐａ
ｑ ３８６／２０ｅ）を用いて、測定した蛍光をＤＮＡ
配列に処理した。

【００９２】例１６．ストレプトミセス・リビダンス内
でのアカルビオシルトランスフェラーゼの過剰発現 アクチノプラーネス種のアカルンビオシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子（ａｃｂＤ）を、ストレプトミセス・リビ
ダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）ＴＫ２１内で、シャトルベクターｐＵＷＬ２０１
（Ｕ．Ｗｅｈｍｅｉｅｒ、未公表、図２）から発現させ
た。このプラスミド（６．４ｋｂ）は、ｅｒｍＥ＊ｐプ
ロモーター（Ｂｉｐｐ等、１９９４）及びｐＢＬＵＥＳ
ＣＲＩＰＴマルチリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の
ＨｉｎｃII／ＣｌａＩ部分からなるＫｐｎＩ／ＸｂａＩ
フラグメントで、２．０ｋｂのＫｐｎＩ／ＸｂａＩフラ
グメントが置き換えられたベクターｐＵＷＬ１９９（Ｗ
ｅｈｍｅｉｅｒ、１９９５）から構成される。ａｃｂＤ
遺伝子を大腸菌ＤＨ５α及びストレプトミセス・リビダ
ンスＴＫ２１にクローニングするために、プラスミドｐ
ＡＳ５／１５．１（実施例１２参照）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII及びＰｓｔＩで加水分解した。得られた２．６ｋ
ｂのＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩフラグメントを、（Ｈｉｎ
ｄIII及びＰｓｔＩで加水分解した）ベクターｐＵＷＬ
２０１に連結し、得られた組換え体プラスミドを大腸菌
ＤＨ５αにクローン化した。得られたプラスミドをｐＡ
Ｓ９と命名した。プラスミドｐＡＳ９をアルカリ溶解に
より大腸菌ＤＨ５αから調製し、プロトプラスト形質転
換法（Ｈｏｐｗｏｏｄ等、１９８５）を用いて、ストレ
プトミセス・リビダンスＴＫ２１にクローン化した。こ
のクローンにおいて、ａｃｂＤ遺伝子は、構成性のｅｒ
ｍＥ＊ｐプロモーターの制御下にある（Ｍ．Ｂｉｂｂ、
Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ；私信）。ＴＳＢ培地
（２５μｇ／ｍｌチオストレプトン）中でストレプトミ
セス・リビダンスＴＫ２１／ｐＡＳ９を培養した後、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル上で（Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒ
ｇ等、１９７５）７５ｋＤａの顕著なバンドとして、上
清中に加わったタンパク質を検出することができた。

【００９３】例１７．遺伝子破壊によるアカルビオシル
トランスフェラーゼの不活性化 アクチノプラーネス種
のアカルビオシルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｃｂ
Ｄ）を遺伝子破壊の方法により不活性化した。このため
に、アクチノプラーネス種の染色体ａｃｂＤ遺伝子を、
部分的に抗生物質耐性遺伝子で置き換えた。これらの抗
生物質耐性遺伝子を、相同組換えにより挿入した。予備
実験において、アクチノプラーネス種が、抗生物質のエ
リスロマイシン、ストレプトマイシン、アプラマイシ
ン、ネオマイシン、及びカナマイシンに対して感受性で
あることが示された。従って、抗生物質耐性遺伝子、ｅ
ｒｍＥ、ａｐｈＤ１、ａａＣ４、及びａｐｈを、突然変
異誘発のために用いた。最初の実施例において、ベクタ
ーｐＵＧＴ１（Ｉｎｇｈａｍ等、１９９５）からのエリ
スロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を、ａｃｂＤを不
活性化するために用いた。このために、ｐＵＧＴ１をＫ
ｐｎＩで加水分解した後、１．５ｋｂの大きさのＫｐｎ
Ｉフラグメント上の耐性遺伝子をアガロースゲル上で分
離し、次いでゲルから単離した。プラスミドｐＡＳ５／
１５．１（実施例１２参照）を、制限酵素ＮｃｏＩで直
鎖状にした。このＮｃｏＩ認識配列は、２．６ｋｂのク
ローン化した染色体フラグメント上の１０５０ｂｐのと
ころにある。製造業者の説明書（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、
Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで、プ
ラスミドｐＡＳ５／１５．１及び調製した１．５ｋｂの
ＫｐｎＩフラグメントの加水分解末端を平滑ＤＮＡ二本
鎖末端に変えた。これに続くライゲーションにより、
１．５ｋｂのＫｐｎＩフラグメント上に存在するエリス
ロマイシン耐性遺伝子を、大腸菌ＤＨ５αにおいてプラ
スミドＡＳ５／１５．１上のａｃｂＤ遺伝子中にクロー
ン化した。このプラスミドを直鎖状にし、常法（プロト
プラスト形質転換）を用いて導入した。大腸菌Ｓ１７−
１及びアクチノプラーネス種との接合によっても、この
組換え体プラスミドを移入することができる。エレクト
ロポレーション法は、プラスミド移入のさらなる選択肢
である。相同組換えの結果として、構築したプラスミド
のエリスロマイシン耐性遺伝子で分断されたａｃｂＤ遺
伝子で、染色体のａｃｂＤ遺伝子が置き換えられた。二
重乗換えが起こるために、アクチノプラーネス種ＳＥ５
０／１１０のエリスロマイシン耐性のａｃｂＤ突然変異
体が生じる。以下の方法、すなわち、（１）エレクトロ
ポレーション、（２）プロトプラスト形質転換（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄ等、１９８５）、（３）菌糸体形質転換（Ｍａ
ｄｏｎ及びＨｕｔｔｅｒ、１９９１）、及び（４）接合
（Ｍａｚｏｄｉｅｒ等、１９８９）もまた、アクチノプ
ラーネス種に別の耐性遺伝子を組換えるために用いるこ
とができる。

【００９４】バッファー及び溶液： バクテリアを生育するための培地 ＬＢ培地： トリプトン １０ｇ ＮａＣｌ １０ｇ 酵母エキス ５ｇ Ｈ₂Ｏ １０００ｍｌまで ４Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整した。

【００９５】 ＴＳＢ培地： トリプトン−ダイズ培地（オキソイド） ３０ｇ Ｈ₂Ｏ １０００ｍｌまで ＴＥバッファー（ｐＨ８．０） トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ Ｎａ₂−ＥＤＴＡ １ｍＭ （Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ、１９７９から改変し
た） プラスミドＤＮＡの標準的な調製 混合物Ｉ ５０ｍＭ グルコース ５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ５ｍｇ リゾチーム／ｍｌ 混合物II ２００ｍｌ ＮａＯＨ １％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム） 混合物III ３Ｍ 酢酸カリウム １．８Ｍ ギ酸塩 ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション ２０ｘ ＳＳＣ ３Ｍ Ｎａｃｌ ０．３Ｍ クエン酸Ｎａ プレハイブリダイゼーション溶液： ６ｘ ＳＳＣ ０．０１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８ １ｍＭ ＥＤＴＡ ０．５％ ＳＤＳ ０．１％ スキムミルク粉末 ハイブリダイゼーション溶液： １５ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液に、標識反
応後、ａｃｂプローブを加える。

【００９６】６ｘ Ｐｏｓｔｗａｓｈ ６ｘ ＳＳＣ ０．５％ ＳＤＳ ＤＮＡシークエンシング ＴＢＥバッファー（ｐＨ８．０） １Ｍ トリス塩基 ０．８３Ｍ ホウ酸 １０ｍＭ ＥＤＴＡ 本発明の主要な態様を以下に示す。

【００９７】１．アカルビオシルトランスフェラーゼ。

【００９８】２．アクチノプラーネス種ＳＥ５０または
ＳＥ５０／１３またはＳＥ５０／１１０、及び突然変異
体からのアカルビオシルトランスフェラーゼ。

【００９９】３．本質的に純粋なアカルビオシルトラン
スフェラーゼ。

【０１００】４．図３のアミノ酸配列を有しているアカ
ルビオシルトランスフェラーゼ、及びその機能的誘導
体。

【０１０１】５．アカルビオシルトランスフェラーゼを
コードしている図４のＤＮＡ配列、及びその機能的誘導
体。

【０１０２】６．アカルビオシル−Ｇ_n ＋ マルトース
→ アカルボース ＋ Ｇ_n 式中、Ｇ_nは、グルコース、二糖類、及びマルトオリゴ
糖を表し、この反応をアカルビオシルトランスフェラー
ゼが触媒することを特徴とする、アカルボース微量成分
をアカルボースに転化するための工程。

【０１０３】７．トレスタチンまたはアミロスタチンの
ような他のプソイドオリゴ糖のアカルボースへの転化に
おけるアカルビオシルトランスフェラーゼ、または他の
グルコシダーゼインヒビターの使用。

【０１０４】８．アカルビオシルトランスフェラーゼの
存在下で、高分子量のデキストリンまたはデンプンと反
応させ、 アカルビオシル−(Ｇ)_n ＋ (Ｇ)_m → アカルビオシル
−(Ｇ)_m ＋ (Ｇ)_n、 式中、Ｇはグルコースを表し、ｍ及びｎは、各場合にお
いて異なったｍ及びｎで１及び２０の間の整数を示す、
透析、逆浸透、または多糖類を沈殿させることにより低
分子量の夾雑物を除き、続いて、アカルビオシルトラン
スフェラーゼを用いて、適度に高濃度のマルトースの存
在下でマルトースと反応させることにより、アカルボー
スを遊離する、 アカルビオシル−（Ｇ）_m ＋ マルトース → アカルボ
ース ＋（Ｇ）_m、 同時にアカルボース同族体をアカルボースに転化しなが
ら、培養上清からアカルボースを濃縮するためのアカル
ビオシルトランスフェラーゼの使用。

【０１０５】９．異種宿主生物におけるアカルビオシル
トランスフェラーゼの組換え体調製物。

【０１０６】１０．請求項５のＤＮＡを含んでいるベク
ター。

【０１０７】文献： １） Ｂｉｂｂ、Ｍ．Ｊ．等（１９９４） Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ２３Ｓ ｒＲＮＡ
ｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｅｒｍＥ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌ
ｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ ｉｓ ｔｒａｎｓ
ｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ
ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｂｉ
ｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１
４、５３３−５４５． ２） Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ．Ｃ．、Ｊ．Ｄｏｌｙ（１
９７９） Ａ ｒａｐｉｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎ
ｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７、１５１３−
１５２３ ３） Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ．（１９８３） Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ
ｐｌａｓｍｉｄｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６、５５７−５８０ ４） Ｈｏｐｗｏｏｄ、Ｄ．Ａ．等（１９８５） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ；Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｅｎｇｌａｎｄ ５） Ｉｎｇｈａｍ、Ｃ．Ｊ．等（１９９５） Ｒｈｏ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ３’ｐｏｌｙ−Ｕ ｔａｉｌｓ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅａｒｌｙｒｅｇｉｏｎ ｏｆ
ａｃｔｉｎｏｐｈａｇｅｐｈｉ Ｃ３１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３、３７０−
３７３． ６） Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ、Ｂ．等（１９７５） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｔｈｅｍａｊｏｒ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒ
ａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｂａｎｄｓＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．５８、２５４−２５８． ７） Ｍａｄｏｎ、Ｊ．Ｒ．Ｈｕｅｔｔｅｒ（１９９
１） Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ（Ｎｏｃａｒｄｉａ）
ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ；ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｗｉｔ
ｈ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３、６３２５−６３３１ ８） Ｍａｚｏｄｉｅｒ、Ｐ．等（１９８９） Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂｅ
ｔｗｅｅｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎ
ｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１、３５８３−３５８５ ９） Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．等（１９７７） ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
４、５４６３−５４６７ １０）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．（１９７５） Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３−５２１ １１）Ｗｅｈｍｅｉｅｒ、Ｕ．Ｆ．（１９９５） Ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔ
ｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｂｌｕｅ−
ｗｈｉｔｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ Ｘｇａｌｐｌ
ａｔｅｓ Ｇｅｎｅ １６５、１４９−１５０

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＮＡ配列決定のためにサブクローニングした
プラスミドｐＡＳ５由来のＤＮＡフラグメントを示す。

【図２】発現ペクターｐＵＷＬ２０１の構造（制限部位
により）を表す図である。

【図３】アカルビオシルトランスフェラーゼのアミノ酸
配列。

【図４】アカルビオシルトランスフェラーゼをコードす
るＤＮＡ配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:045） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ユルゲン・ゲオルク・レンツ ドイツ51373レーフエルクーゼン・アムノ イエンホフ11 (72)発明者 ベルナー・シユレダー ドイツ42113ブツペルタール・アムローム 91 (72)発明者 ヘルマン・パペ ドイツ48158ミユンスター・メーリングベ ーク36 (72)発明者 クラウス・ゲーケ ドイツ58708メンデン・ハリンガードルフ シユトラーセ99 (72)発明者 ベアテ・シヤパー ドイツ48151ミユンスター・アルトフシユ トラーセ９ (72)発明者 ミヒヤエル・ヘムカー ドイツ48151ミユンスター・ユリウス−レ バー−シユトラーセ（番地なし) (72)発明者 ボルフガング・ピーパースベルク ドイツ42349ブツペルタール・キユーレン ハーナーシユトラーセ218ツエー (72)発明者 ユルゲン・デイストラー ドイツ42107ブツペルタール・デユツペラ ーシユトラーセ44 (72)発明者 アンスガー・シユトラトマン ドイツ45527ハテインゲン・ユバーデムホ ルスト42

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アカルビオシルトランスフェラーゼ。
2. 【請求項２】 アカルビオシルトランスフェラーゼをコ
   ードしている図４のＤＮＡ配列、及びその機能的誘導
   体。
3. 【請求項３】 次式 アカルビオシル−Ｇ_n ＋ マルトース→ アカルボース
   ＋ Ｇ_n （式中、Ｇ_nは、グルコース、二糖類、及びマルトオリ
   ゴ糖を表す）で示されるアカルボース微量成分のアカル
   ボースへの転化方法であって、反応をアカルビオシルト
   ランスフェラーゼによって触媒することを特徴とする方
   法。
4. 【請求項４】 異種宿主生物におけるアカルビオシルト
   ランスフェラーゼの組換え体調製物。
5. 【請求項５】 請求項２記載のＤＮＡを含んでなるベク
   ター。