CN111763677B - 一种角蛋白酶异源表达的启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种角蛋白酶异源表达的启动子，属于工业生物技术领域。本发明成功构建了携带16种不同启动子序列的角蛋白酶重组菌，其中7种能够提高角蛋白酶表达量，PaprE启动子改造重组菌的酶活水平最高，达到2605U/mL，相比对照菌提高20倍。在5L发酵罐上发酵液中角蛋白酶活力高达7176U/mL，是目前文献报道重组角蛋白酶表达的最高水平，能更好地服务于实际应用。本发明为角蛋白酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效策略。传统基因工程改造通常需构建高通量筛选方法，进行大量文库筛选，工作量大、周期长、成本高，该改造方法相比传统方法极大的减小了工作量，提高了高表达效率。

Description

一种角蛋白酶异源表达的启动子

本申请是申请号为：201810933416.7，申请日为：2018年8月16日，申请名称为：一种角蛋白酶异源表达的启动子及其应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种角蛋白酶异源表达的启动子，属于工业生物技术领域。

背景技术

角蛋白是一种不溶性的结构蛋白，因二硫键和氢键的高度交联而具有高稳定性。作为畜牧业、制革业和纺织业发展过程的副产品，每年均有大量的毛发弃置于自然界，对环境造成了巨大污染。目前，处理毛发主要通过高温、高压、酸、碱、氧化等物理化学方法进行降解，但这些方法会损耗角蛋白中有用的氨基酸，并且效率低、能耗高、污染大。角蛋白酶通过二硫键还原作用打开角蛋白中复杂的二硫键，进而通过蛋白水解作用实现角蛋白的降解。采用角蛋白酶降解角蛋白是一种绿色的降解过程，从经济和环保的角度，这种对环境友好的生物处理方式具有广阔的前景。

然而，总结已有研究来看，目前角蛋白酶的酶活及热稳定性普遍较差。虽然已有很多不同微生物来源的角蛋白酶基因成功实现异源表达的文献报道，但大部分基因工程菌的角蛋白酶表达水平一直未突破，使实现角蛋白酶的广泛应用及满足工业化大规模使用需求成为难点。近年来研究人员逐渐把研究重点转移到角蛋白酶的异源高效表达上，基因工程改造手段是提高重组角蛋白酶表达水平的关键方法。Radha利用诱导型启动子PxylA和PamyL实现了角蛋白酶在巨大芽孢杆菌中的高效表达，使重组酶的表达水平比对照菌高约3倍，酶活达到168.6U/mL(Radha S,et al.Bioresour Technol,2008,99:5528-5537)。Wang等人将多个拷贝数的角蛋白酶基因整合到地衣芽孢杆菌基因组上，构建了能稳定高产角蛋白酶的重组菌(Wang J J,et al.Biotechnol Bioeng,2004,87:459-464)。而通过启动子改造实现角蛋白酶的高效表达目前仍未见任何文献报道，这对于对实现角蛋白酶的深入和广泛应用也具有重大意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种角蛋白酶异源高效表达的启动子，提高角蛋白酶表达量和酶活。

本发明的第一个目的是提供一种启动子，所述启动子为角蛋白酶基因的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列为如SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.17～19具有95％以上同源性的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述的启动子的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为适于芽孢杆菌表达的载体。

本发明的第三个目的是提供一种表达角蛋白酶的重组菌，所述重组菌含有上述的启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主包括但不限于枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、脆弱杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。

本发明的第四个目的是提供一种上述重组菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增启动子序列，并进行突变，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.16所示的启动子序列；

(2)将步骤(1)的启动子片段回收后构建到携带角蛋白酶基因的质粒中得到重组质粒；

(3)将步骤(2)的重组质粒转化到宿主菌中，得到重组菌。

本发明的第五个目的是提供一种上述重组菌生产角蛋白酶的方法，将所述重组菌以1～10％接种量接种到发酵罐中，以发酵温度28～40℃、转速100～1000rpm、通气量为0.5～3vvm、pH为5.5～8.5的条件下发酵生产，得到角蛋白酶。

本发明的第六个目的是提供一种上述的启动子或重组菌在畜牧业、制革业或纺织业中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用所述启动子构建重组菌，发酵生产角蛋白酶降解角蛋白。

本发明的有益效果是：成功构建了携带16种不同启动子序列的角蛋白酶重组菌，其中PaprE启动子改造重组菌的酶活水平最高，达到2605U/mL，相比对照菌提高20倍。采用培养基营养组分优化的发酵研究策略，实现了突变改造重组菌角蛋白酶产量的提升，5L发酵罐上发酵液中角蛋白酶活力高达7176U/mL，是目前文献报道重组角蛋白酶表达的最高水平，能更好地服务于实际应用。本发明为角蛋白酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效策略。传统基因工程改造通常需构建高通量筛选方法，进行大量文库筛选，工作量大、周期长、成本高，该改造方法相比传统方法极大的减小了工作量，提高了高表达效率。

附图说明

图1为重组质粒的双酶切验证电泳图；M：DL 10000DNA Marker；CT：pMA5-kerBv初始对照质粒；1-16：各启动子改造重组质粒；

图2为启动子改造重组菌的角蛋白酶酶活；CT：含pMA5-kerBv质粒的初始对照菌株；1-16：含各启动子改造重组质粒的重组菌；

图3为启动子改造重组菌产酶的SDS-PAGE分析；M：蛋白分子量标准；CT1：含pMA5质粒的B.subtilis WB600；CT2：含pMA5-kerBv质粒的初始产酶菌株；1-16含各启动子改造重组质粒的重组菌；

图4为不同营养组分对发酵产酶的影响；

图5为5L发酵罐放大产酶结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

角蛋白酶酶活检测方法：

角蛋白酶酶活以市售可溶性角蛋白为底物进行检测。

1％角蛋白底物溶液的配制：首先配制0.1M Tris-HCl(pH 9.0)溶液，然后加入5％可溶性角蛋白母液，再加入去离子水使Tris-HCl溶液浓度稀释为0.05M，并且使角蛋白溶液浓度稀释为1％。

酶反应：取适度稀释酶液100μL，加入100μL底物溶液，置50℃水浴中准确反应15min，反应结束后立即加入200μL 5％(w/v)TCA终止反应。对照组中先加入200μL TCA，酶反应结束后再加入100μL底物溶液。上述反应结束后所有样品均以12000rpm离心5min，然后分别吸取200μL上清液到新离心管中，加入1mL 0.4M Na₂CO₃，再加入200μL福林酚溶液，置40℃水浴显色反应20min后在680nm处检测吸光值。

酶活定义：在上述反应条件下，酶液水解底物在680nm下产生0.01的吸光度的差别定义为一个酶活单位U。

酶活计算公式：U＝(A－B)×100×N

A：表示实验组在680nm处的吸光度值；B：表示对照组在680nm处的吸光度值；100：表示吸光度差为1需乘100；N：表示稀释倍数。

实施例1：启动子分子改造提升角蛋白酶酶活及表达量

启动子核苷酸序列从芽孢杆菌基因组中扩增获得并经突变改造。本研究中，选择并进行改造的启动子均为无需添加诱导剂的组成型启动子或者自诱导型启动子，它们分别是trnQ、sigX、yolA、wapA、gapB、cdd、veg、mpr、nprE、aprE、epr、bpr、nprB、pst、gsiB、srfA基因的启动子，碱基序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：16所示，根据这些基因的启动子序列，引物设计见表1。

表1.启动子引物设计

角蛋白酶高效表达启动子筛选研究中，在枯草芽孢杆菌表达宿主中构建了启动子筛选体系，启动子可以通过酶切、连接插入到目的基因编码序列如SEQ ID NO：17所示的角蛋白酶重组表达质粒中。以枯草芽孢杆菌基因组为模板，用带有酶切位点的特异性引物扩增出启动子序列片段，然后将启动子片段回收后构建重组质粒。图1所示为启动子改造重组质粒双酶切验证电泳图，经测序验证后将重组质粒转化到B.subtilisWB600中构建重组菌。由于选择的启动子都是无需添加诱导剂的组成型启动子或者自诱导型启动子，所以构建的重组菌均可直接在TB培养基中进行发酵产酶研究。

重组菌能够利用角蛋白酶自身信号肽将活性酶蛋白释放到培养基中，故可以直接取重组菌株发酵上清液检测角蛋白酶酶活。将构建好的各重组菌在TB培养基中发酵培养30h后，取发酵上清液进行角蛋白酶活性测定和SDS-PAGE分析。各重组菌酶活检测结果如图2所示，与对照菌株相比，7个重组菌株角蛋白酶表达水平显著提高，尤其是PaprE启动子改造重组菌，其发酵上清液中角蛋白酶酶活最高，为2605U/mL，是对照菌胞外角蛋白酶酶活(131U/mL)的20倍。此外，PsigX和PsrfA启动子改造重组菌的角蛋白酶表达水平也有较大提高，其发酵上清液中角蛋白酶活性分别达到了2119U/mL和1622U/mL，分别为对照菌的16倍和12倍。将各启动子改造重组菌的发酵上清液进行SDS-PAGE分析。结果如图3，可以观察到降解前导肽产生的活性蛋白目的条带，并且该条带的深浅差异与各重组菌发酵上清中角蛋白酶的活性大小保持一致，也进一步证实了角蛋白酶表达水平的差异。将本发明启动子应用于如SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：19所示的任一角蛋白酶序列，均能获得10％以上不同程度的酶活提升。

实施例2：PaprE启动子改造重组菌摇瓶发酵情况

选择甘油、麦芽糖、蔗糖、牛肉膏和玉米浆等营养组分以20g/L的添加量添加到TB培养基中，接种PaprE启动子改造重组菌后检测其在不同培养基中的产酶水平。由图4可知，当发酵至30h时，TB培养基中角蛋白酶产量最高，而在同期添加营养物质的实验组中角蛋白酶产量较低，可能是由于重组菌株生长周期延长所造成。当发酵到48h时，与对照TB培养基相比，所有添加营养组分的实验组均表现出相对更高的角蛋白酶产量，其中添加甘油的TBG培养基和添加麦芽糖的TBM培养基中角蛋白酶酶活达到4000U/mL以上。

实施例3：PaprE启动子改造重组菌5L发酵罐发酵情况

进一步考察了PaprE启动子改造重组菌在5L罐上发酵产酶情况。在发酵过程中，以5％接种量接种后，发酵液中pH值先逐渐下降，发酵到18h左右，pH值开始逐渐增加，并且伴随着大量重组角蛋白酶的生成。发酵液中细胞密度在前期增长较快，当发酵至30h，OD₆₀₀达到最大值为32.2，约为摇瓶培养的2.2倍。发酵液中角蛋白酶酶活在发酵至36h时达到最高值，为7176U/mL(图5)，约为摇瓶水平的1.6倍。本研究在5L发酵罐中获得的重组角蛋白酶产量为目前文献报道的最高水平。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种角蛋白酶异源表达的启动子

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 281

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

gagaataaat gtcatacgct ctttccccgc ggttcgtttg ttcaatgact gtgtattaaa 60

ttcataatgc tcctccttca ccttttaggt aagtatgtag ttacatgata catttttggt 120

caataaaggt caaacaaaaa gctggcctga tatgcaaagt cgtctctttt tcccattttc 180

cccaaaaata caggggttca aaccatcgta tgtcagattg ccaattaaga tgctttgtct 240

atttaaaaaa cggcctctcg aaatagaggg ttgttatttg a 281

<210> 2

<211> 418

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

caaagactcc gggtctggca taccggaaga agatctgcca tttatctttg agcggtttta 60

aggcagataa agcgcggaca aggggcagag caggaaccgg gttagggctg gctatcgtta 120

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caacattttc tttttatatt ccgacaaaac ggtaaaatcg agtctgaatt tgccgaagaa 240

tcttgttcca taagaaacac ccgctgactg agcgggtgtt tttttaatag ccaacattaa 300

taaaatttaa ggatatgtta atataaattc ccttccaaat tccagttact cgtaatatag 360

ttgtaatgta acttttcaag ctattcatac gacaaaaaag tgaacggagg ggtttcaa 418

<210> 3

<211> 406

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

ggcttgctcg ttgtcaaatc tgcgtaggcc taacccttca ggtgtccaaa ctcaagggaa 60

ggtctatttt ttcttttggc ttgacgttac aatcatcatt atattgaaga tcaacaagac 120

gttaatatca atccgccaaa attgatcatt atcattaatg attcgtaaac agtcattttc 180

ccaccccttt cataggggat gagcaagact cccttgagtg agcaaacttt atgtacagga 240

aatattatac tatacataaa tgtccttgtc gttaaaaatt cacaataaat tgacaatatg 300

aaaagaactt gcttaatgca ggttcttttt ttatttcaaa tattaaacaa ttcccttcaa 360

atgacgatat ttaacatgta aacttgtacc aaggaggatt taggaa 406

<210> 4

<211> 352

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

atttcaatca ttgtatttct cgaccccgct gtcgcgatcg tgctcgatac cgtcttcaca 60

ggctccgccc tgacctctat caaacgcttg gcatcgtaat gatctttgcg ggcatggcct 120

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aaatacaata aaaaatgtaa aaaggcctat gcggcctttt tttgttttag gtcaattgac 240

tctcgctaat ccttaaaata agataaattt tctagaaaaa tattgtaatg atatttcagt 300

ctagttaaga ttattgagta aatattactt ttattacaaa aggagagagg aa 352

<210> 5

<211> 323

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

agaagggatt ttagatatgc tgtgtgcttg gggagcgaat catattaaca gagtgtacga 60

tacattttct gtgctagaag aaagtgtgct caatgataag ttaaaacagg aatcataaag 120

catgagggca gtcagtgcgg agcgctggct gctttttggt tcttacgcct gatattctgt 180

gcaagaaaac ataagatgca tcataaatta gcgttataat cgttgatttt tatcaatatg 240

tactggcgaa tttgttttaa tgtgttatac taattttaga tagtaacaaa ttaggatggc 300

ataattgata aggggtgtcc aac 323

<210> 6

<211> 238

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

ataactgaca aacatcaccc tcttgctaaa gcggccaagg acgctgccgc cggggctgtt 60

tgcgtttttg ccgtgatttc gtgtatcatt ggtttactta tttttttgcc aaagctgtaa 120

tggctgaaaa ttcttacatt tattttacat ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc 180

gattatgtaa aatataaagt gatagcggta ccattatagg taagagagga atgtacac 238

<210> 7

<211> 320

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

acggattaat gtatgggaag tgctccgtaa tacgctgaca agagagaaag ggcttggagg 60

tattgaaaca agaggagttc tgagaattgg tatgccttat aagtaattaa cagttgaaaa 120

cctgcatagg agagctatgc gggtttttta ttttacataa tgatacataa tttaccgaaa 180

cttgcggaac ataattgagg aatcatagaa ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc 240

ttattaacgt tgatataatt taaattttat ttgacaaaaa tgggctcgtg ttgtacaata 300

aatgtagtga ggtggatgca 320

<210> 8

<211> 322

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

ttagcggatt acactgttga aggattggaa aacgcactgg cagtcccaaa gtgcgcgtct 60

ttggaaagcc gataacaaaa gccggacgtc gtatggcagt tgcgctttct gctgctgatt 120

cagttgaaac ggcaagagag aatgcaaaga aagcgttgga ccagctaatt ttaaaataga 180

gtttgaacag gtcttgtcat gggacaaggc ctgttttttt ctttctccgt aaaagtttta 240

tcataagaat cagaaacctg attataatgt aaaagtcttc catcgatacg ggtggttgac 300

actaaaggag ggagatgaca aa 322

<210> 9

<211> 373

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

attgaatcag cagggtgctt tgtctgctta atataaaata acgttcgaaa tgctacataa 60

tgactgaata actccaacac gaacaacaat cctttacttc ttattaaggc ctcattcggt 120

tagacagcgg acttttcaaa aagtttcaag atgaaacaaa aatatctcat cttccccttg 180

atatgtaaaa aacataactc ttgaatgaac caccacatga cacttgactc atcttgatat 240

tattcaacaa aaacaaacac aggacaatac tatcaatttt gtctagttat gttagttttt 300

gttgagtatt ccagaatgct agtttaatat aacaatataa agttttcagt attttcaaaa 360

agggggattt att 373

<210> 10

<211> 330

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

cgataatatc cattgttctc acggaagcac acgcaggtca tttgaacgaa ttcgacagga 60

atttgccggg actcaggagc atttaaccta aaaaagcatg acatttcagc ataatgaaca 120

tttactcatg tctattttcg ttcttttctg tatgaaaata gttatttcga gtctctacgg 180

aaatagcgag agatgatata cctaaataga gataaaatca tctcaaaaaa atgggtctac 240

taaaatatta ttccatctat tacaataaat tcacagaata gtcttttaag taagtctact 300

ctgaattttt ttaaaaggag agggtaaaga 330

<210> 11

<211> 324

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

aggataattc cgtcacgcaa agcgctgaga tgccgctgcc cggcaatttt cccggcggca 60

ttattttttc ctccatcacc cgagtgaatg tgctcatctt aaaaaccccc ttttctcatt 120

gctttgtgaa caacctccgc aatgttttct ttatcttatt ttgaaaacgc ttacaaattc 180

atttggaaaa tttcctcttc atgcggaaaa aatctgcatt ttgctaaaca accctgccca 240

tgaaaaattt tttccttctt actattaatc tctctttttt tctccgatat atatatcaaa 300

catcatagaa aaaggagatg aatc 324

<210> 12

<211> 281

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

tcgattttgt ccttttttgt ttttctcttc acactttcct tcttataaag tctttttccc 60

tatgcttcct tcgcttagta acaaaacaga taattagacc catttatttt tgtgacattt 120

ttatcatttt catatatatg gaaattgaat gacatgaaac gacaatatct gtaattcaga 180

ttgtctacag ttaatataca gcgatgttct gacaaaccat tcattattaa aaggagggac 240

gacacttttt ttaaaaagca tgttgaaaaa gggggatgaa a 281

<210> 13

<211> 184

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 13

catatggagc aggggttatt atttatgtca ataaaaaatt agtagagtag aaaaagaagg 60

gcagaggaaa tatctctgcc cttctttttt gggaaaataa gaacgaagca ccacatacaa 120

gtttttgtat ttttgatagg atgaagaaaa atggtagatt ccaaaatagg aaggatgtgg 180

tgtt 184

<210> 14

<211> 361

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 14

tgacaatcct gagattgcta tttctgtcgt agttccttgg acttacattg attacaatca 60

aagatactca attacaaacg aaatcggcag ggaagtaatg gataaatatt ttgagctgaa 120

atcgaagcag gacaaagaag gtactcagca aaagaataaa gacaaaattg aagaaaatgc 180

agaaaacaca acgtcttctg ataactaaaa aaaaacgctc acatgatgtg ggcgtttttt 240

ttatacaaaa aacgcactga tttacaaaac cttaacattc ggttcaaacc ctttttacat 300

agaaccttta ctctatacgt gtaggacaaa ttacacatta tacgcagggg gaattcagga 360

a 361

<210> 15

<211> 281

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 15

gaaaaaactt ttccagatag tgccggttgc cggaatggtt tggcgccgct gccaatcgct 60

caacattaaa cgacattacc gagacaggca tgatgctgta caaaaagagg cgcattcttg 120

aacgactgaa agaaacagaa cgagagatgg aatagcagaa agcagacgga cagcgatccg 180

cctgcttttt ttagtggaaa catacccaat gtgttttgtt tgtttaaaag aattgtgagc 240

gggaatacaa caaccaacac caattaaagg aggaattcaa a 281

<210> 16

<211> 424

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 16

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60

tcttcggcat cccgcatgaa acttttcacc catttttcgg tgataaaaac atttttttca 120

tttaaactga acggtagaaa gataaaaaat attgaaaaca atgaataaat agccaaaatt 180

ggtttcttat tagggtgggg tcttgcggtc tttatccgct tatgttaaac gcgcaatgct 240

gactgacggc agcctgcttt aatagcggcc atctgttttt tgattggaag cactgctttt 300

taagtgtagt actttgggct atttcggctg ttagttcata agaattaaaa gctgatatgg 360

ataagaaaga gaaaatgcgt tgcacatgtt cactgcttat aaagattagg ggaggtatga 420

caat 424

<210> 17

<211> 1149

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 17

gttcgtggca aaaaagtttg gatctctctt cttttcgctc ttgctcttat cttcacaatg 60

gctttcggct ctacaacatc tgctcaagct gctggcaaat ctaacggcga aaaaaaatac 120

atcgttggct tcaaacaaac aatgtctaca atgtctgctg ctaaaaaaaa agatgttatc 180

tctgaaaaag gcggcaaagt tgaaaaacaa ttcaaatacg ttgatgctgc ttctgctaca 240

cttaacgaaa aagctgttaa agaacttaaa aaagatcctt ctgttgctta cgttgaagaa 300

gatcatgttg ctcaagctta cgctcaatct gttccttacg gcgtttctca aatcaaagct 360

cctgctcttc attctcaagg cttcacaggc tctaacgtta aagttgctgt tatcgattct 420

ggcatcgatt cttctcatcc tgatcttaaa gttgctggcg gcgcttctat ggttccttct 480

gaaacaaacc ctttccaaga taacaactct catggcacac atgttgctgg cacagttgct 540

gctcttaaca actctgttgg cgttcttggc gttgctcctt ctgcttctct ttacgctgtt 600

aaagttcttg gcgctgatgg ctctggccaa tactcttgga tcatcaacgg catcgaatgg 660

gctatcgcta acaacatgga tgttatcaac atgtctcttg gcggcccttc tggctctgct 720

gctcttaaag ctgctgttga taaagctgtt gcttctggcg ttgttgttgt tgctgctgct 780

ggcaacgaag gcacatctgg cggctcttct acagttggct accctggcaa atacccttct 840

gttatcgctg ttggcgctgt taactcttct aaccaacgtg cttctttctc ttctgttggc 900

tctgaacttg atgttatggc tcctggcgtt tctatccaat ctacacttcc tggcaacaaa 960

tacggcgctt acaacggcac atctatggct tctcctcatg ttgctggcgc tgctgctctt 1020

atcctttcta aacatcctaa ctggacaaac acacaagttc gttcttctct tgaaaacaca 1080

acaacaaaac ttggcgatgc tttctactac ggcaaaggcc ttatcaacgt tcaagctgct 1140

gctcaataa 1149

<210> 18

<211> 1341

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 18

gaagaacgtg atatccctaa ccgtgataaa atcatctcta aaaaatgggt ttactaaaac 60

atcatccctt ctatcacaat caactctcaa aactctcttc tttctaaatc tacacttaac 120

ttccttaaag gcgaaggcaa agaataagaa gctaaaaact gcggctctgc ttgctgcctt 180

cgttaacgtt aatctcttcg ttggcgttct gctacatgcc ttcgtcgtct tcctgaaaaa 240

gctgttcaaa aacgtaacac actttctgat ctttctcgtc aataagttcc ttaagttcct 300

cctcgtaaac gtatgctttt ccttaaaaaa gctgaacgtt tcaaatctaa cctttctatg 360

cttacacgtc ctcaacaaca ttggatgaaa aaactttaaa aaaactaaaa aaaaatccgt 420

acacttcata tgtggaaaaa aatcatcctt catatgaaca tgcgtaacct tttccttatg 480

gctttcctta aacttaaacg tcgtcttttc acacttaaag ctacacaagc tcttacataa 540

aaataacttc tttctacagc tgaacttaca cttcttatcc ttacataaac atctgaagct 600

gaacaagctt ctttccttct taaacaaaca catacacgta cagctgttct tacagttcgt 660

atgtctcctg ttcgtcttcc tcttcttatc acacaatctg ttttctgggc ttaacgtcaa 720

gctcatcatt acatgcaata aaaatgcctt atccaacaag aagctgctaa catcgctggc 780

cttcttacag ctctttctgg ccctttccct acaatctgga tgctttctac ataagctctt 840

gctgatcttc ttgttcttca acgttaaaaa caataactta tcaaacgttt ccctgctgtt 900

tcttctcttc ttcctcaacc tgaaacaaaa gttcatcctg aagctcaagc tcaatctgct 960

acacttcaaa acatccttct tcttcttcaa taagttcgtt aaacagctgc tacaaaagaa 1020

cttcattctc ctgctcaagt tctttctctt atgtaatggc ttcttgcttg cccttctaaa 1080

gctcatttcc ttgaagctct tacagctctt atcacagaac gtccttggcg tcttcttaca 1140

cttcctgaac aacaacgtta attcttcctt tctacacgtc ttggccaaac acgtaaatct 1200

gttatcgttt aaaaagctct tcaacataca cttgaagctc tttctacaat ggaaaaaggc 1260

taatctacat acaaacaact tcataacaac atcaaaaaaa aacaagctcc tccttacctt 1320

cttttctact gccaacttgt t 1341

<210> 19

<211> 1152

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 19

atgtgcgtta aaaaaaaaaa cgttatgaca tctgttcttt gggctgttcc tcttcttttc 60

tctgctggct tcggcggctc tatggctaac gctgaaacag cttctaaatc tgaatctgaa 120

aaatcttaca tcgttggctt caaagcttct gctacaacaa actcttctaa aaaacaagct 180

gttacacaaa acggcggcaa acttgaaaaa caataccgtc ttatcaacgc tgctcaagtt 240

aaaatgtctg aacaagctgc taaaaaactt gaacatgatc cttctatcgc ttacgttgaa 300

gaagatcata aagctgaagc ttacgctcaa acagttcctt acggcatccc tcaaatcaaa 360

gctcctgctg ttcatgctca aggctacaaa ggcgctaacg ttaaagttgc tgttcttgat 420

acaggcatcc atgctgctca tcctgatctt aacgttgctg gcggcgcttc tttcgttcct 480

tctgaaccta acgctacaca agatttccaa tctcatggca cacatgttgc tggcacaatc 540

gctgctcttg ataacacaat cggcgttctt ggcgttgctc cttctgcttc tctttacgct 600

gttaaagttc ttgatcgtta cggcgatggc caatactctt ggatcatctc tggcatcgaa 660

tgggctgttg ctaacaacat ggatgttatc aacatgtctc ttggcggccc taacggctct 720

acagctctta aaaacgctgt tgatacagct aacaaccgtg gcgttgttgt tgttgctgct 780

gctggcaact ctggctctac aggctctaca tctacagttg gctaccctgc taaatacgat 840

tctacaatcg ctgttgctaa cgttaactct aacaacgttc gtaactcttc ttcttctgct 900

ggccctgaac ttgatgtttc tgctcctggc acatctatcc tttctacagt tccttcttct 960

ggctacacat cttacacagg cacatctatg gcttctcctc atgttgctgg cgctgctgct 1020

cttatccttt ctaaataccc taacctttct acatctcaag ttcgtcaacg tcttgaaaac 1080

acagctacac ctcttggcaa ctctttctac tacggcaaag gccttatcaa cgttcaagct 1140

gcttctaacg gc 1152

Claims (9)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子为角蛋白酶基因的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.17~19具有95%以上同源性的核苷酸序列。

3.一种含有权利要求1或2所述的启动子的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体为适于芽孢杆菌表达的载体。

5.一种表达角蛋白酶的重组菌，其特征在于，含有权利要求1所述的启动子。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、脆弱杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。

7.一种权利要求5或6所述的重组菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增启动子序列，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的启动子序列；

（2）将步骤（1）的启动子片段回收后构建到携带角蛋白酶基因的质粒中得到重组质粒；

（3）将步骤（2）的重组质粒转化到宿主菌中，得到重组菌。

8.一种权利要求5或6所述的重组菌生产角蛋白酶的方法，其特征在于，将所述重组菌以1~10%接种量接种到发酵罐中，以发酵温度28~40^oC、转速100~1000rpm、通气量为0.5~3vvm、pH为5.5~8.5的条件下发酵生产，得到角蛋白酶。

9.一种权利要求1或2所述的启动子在促进角蛋白酶表达中的应用。

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