CN111424026B - 一种生产角蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产角蛋白酶的方法，属于微生物和发酵技术领域。本发明通过从发酵培养基成分(碳源、氮源、金属离子、磷酸盐)和发酵条件(温度、pH、接种量)两个方面入手，对利用枯草芽孢杆菌发酵生产角蛋白酶的工艺进行了优化。利用本发明的方法发酵生产角蛋白酶，可使得角蛋白酶的产量较对照提高3.3倍，在3L发酵罐产酶，酶活达到704400U/mL。因而本发明的方法在饲料、制革等方面角蛋白酶的制备中有着广阔的应用前景。

Description

一种生产角蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及一种生产角蛋白酶的方法，属于微生物和发酵技术领域。
背景技术
角蛋白酶是一种可以特异性降解角蛋白类底物的蛋白酶。产角蛋白酶的微生物主要为细菌、真菌、放线菌。目前，针对角蛋白酶发酵优化的研究，主要集中在野生菌的筛选、发酵培养基成分优化和发酵条件优化，在产角蛋白酶菌株资源的挖掘中，最常见的是细菌，具有发酵周期短、酶活高、生产安全性好等特点，角蛋白酶在饲料、肥料、洗涤剂、皮革、纺织、化妆品行业和医疗等领域具有很好的应用前景。随着人们对角蛋白酶的催化性质在工业应用潜力认识的不断加深，野生菌所产角蛋白酶的性能和产量远远不能满足市场需求。目前筛选得到的产角蛋白酶野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。近年来越来越多的角蛋白酶基因得到克隆和异源表达，采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高角蛋白酶的生产强度。基因工程菌和重组角蛋白酶经过性能改造，胞外分泌酶单一，简化了发酵下游的纯化工作。然而，高生产成本和低产量限制了角蛋白酶的工业化生产，因此通过发酵优化技术手段来提高产量降低成本。
发明内容
为了解决角蛋白酶生产菌株发酵酶活低，发酵成本过高的问题。本发明的方法从发酵培养基成分(碳源、氮源、金属离子、磷酸盐)和发酵条件(温度、pH、接种量)两个方面入手，对利用枯草芽孢杆菌发酵生产角蛋白酶的工艺进行了进一步优化；利用本发明的方法发酵生产角蛋白酶，可使得角蛋白酶的产量得到提升，在饲料、制革等方面有着广阔的应用前景。
本发明对发酵培养基进行优化。首先利用单因素试验对培养基成分和培养条件进行了优化；然后设计Plackett-Burman试验筛选得到三个显著因素：酵母浸膏、pH、温度；最后设计Box-Behnken中心组合试验并进行响应面分析。获得最佳工艺进行验证以及高密度发酵。
本发明提供了一种培养基，所述培养基的组分为蔗糖、豆粕、酵母浸膏、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O。
在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖的含量为20～40g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述豆粕的含量为35～45g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述酵母浸膏的含量为5～10g/L或25～30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述Na2HPO4·12H2O的含量为2～20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述KH2PO4的含量为1～10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述MgSO4·7H2O的含量为0.1～1.0g/L。
本发明提供了一种提高角蛋白酶产量的方法，所述方法是将角蛋白酶发酵菌株接种至所述培养基中产酶。
在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶发酵菌株的接种量为发酵培养基的4～7％(v/v)，接种时菌液的OD600为0.6～1.0。
在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶发酵菌株为枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为WB600-pP43NMK-ker，所述WB600-pP43NMK-ker记载于文献Zheng Peng等《Biotransformation of keratin waste toamino acids and active peptides based on cell-free catalysis》。
在本发明的一种实施方式中，所述产酶是在36～40℃下进行。
在本发明的一种实施方式中，所述产酶是在pH 6～8下进行。
本发明还保护所述培养基，或所述提高角蛋白酶产量的方法在饲料、制革畜牧、医药领域制备角蛋白酶或降解角蛋白中的应用。
本发明的有益效果如下：
1、优化后培养基实现角蛋白酶产量显著提升
本发明中优化得到的发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，3g/LNa2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，0.3g/L MgSO4·7H2O)；在温度37℃，种子液菌浓度OD600为0.8，接种量5％，pH 7.68，转速220rpm，装液量20％条件下培养24h角蛋白酶活性达到了260480U/mL，而对照仅为61210U/mL，较对照3.3倍。
2、优化后培养基实现角蛋白酶发酵成本显著降低
本发明中优化培养基原料均价格低廉，发酵重复性较好，成本低廉，较优化前降低了96％。
3、优化后培养基实现了高密度发酵，角蛋白酶产量进一步提升
利用优化后培养基进行3L发酵罐放大生产，酶活达到704400U/mL，工业生产潜力巨大。
附图说明
图1为在不同种类碳源种中发酵产角蛋白酶的酶活。
图2为在不同浓度蔗糖中发酵产角蛋白酶的酶活。
图3为在不同种类第一氮源中发酵产角蛋白酶的酶活。
图4为在不同添加量的豆粕中发酵产角蛋白酶的酶活。
图5为在不同种类的第二氮源中发酵产角蛋白酶的酶活。
图6为在不同添加量的酵母浸膏中发酵产角蛋白酶的酶活。
图7为在不同种类的金属离子中发酵产角蛋白酶的酶活。
图8为在不同添加量的七水硫酸镁中发酵产角蛋白酶的酶活。
图9为在不同浓度磷酸盐中发酵产角蛋白酶的酶活。
图10为在不同初始pH中发酵产角蛋白酶的酶活。
图11为不同接种量下发酵产角蛋白酶的酶活。
图12为不同温度下发酵产角蛋白酶的酶活。
图13为菌株发酵产角蛋白酶曲线。
具体实施方式
1、角蛋白酶酶活测定方法
粗酶液制备：将发酵获得的菌液于4℃、7000rpm离心5min。
酶反应：向1.5mL离心管中加入Gly-NaOH溶液(pH 10)150μL，2.5％可溶性角蛋白100μL，角蛋白酶溶液50μL，混合均匀，于60℃中反应20min，加入0.5M三氯乙酸溶液200μL终止反应，12000rpm离心2min。对照为加入酶液前加入200μL三氯乙酸溶液。
显色反应：取200μL上清液加入到1mL 5％碳酸钠溶液中，加入200μL福林酚试剂，混合均匀，50℃显色10min，使用分光光度计测定660nm下的吸光度值。
酶活力定义：1U为吸光度值在660nm下升高0.001单位。
2、LB培养基：在1L去离子水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。
实施例1：菌株培养及发酵
1、菌株培养方法
菌株活化：从-80℃冰箱中取出产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB600-pP43NMK-ker(所述菌株记载于文献Zheng Peng等《Biotransformation of keratin waste to aminoacids and active peptides based on cell-free catalysis》)甘油管，于固体LB培养基划线后，37℃下培养14-16h。
一级种子液培养：从平板上挑取单菌落接种于3mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜。
二级种子液培养：按2％接种量转接一级种子液至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、220rpm培养4-6h。
摇瓶发酵培养：将OD600为0.8的二级种子液以5％(v/v)的接种量转接至含50mL发酵培养基的250mL三角瓶，37℃、220rpm培养24h，测定发酵液酶活。
实施例2：应用含不同碳源的培养基制备角蛋白酶
(1)最优碳源的选择
初始发酵培养基成分(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，Na2HPO4·12H2O 6，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 0.3。
保持发酵培养基其他成分不变，将葡萄糖替换为半乳糖、甘油、蔗糖、麦芽糖、糊精和淀粉为碳源，添加量为20g/L；按照实施例1，进行摇瓶发酵培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳碳源种类为蔗糖(图1)。
(2)碳源浓度的选择
具体实施方式同上述步骤(1)，区别在于，将发酵培养基中的碳源替换为不同浓度的蔗糖(10、15、20、25、30、35、40g/L)；摇瓶发酵后测定发酵液酶活，蔗糖浓度在25～35g/L时，角蛋白酶酶活可达125650U/mL及以上(图2)。
实施例3：应用含不同氮源的培养基制备角蛋白酶
(1)第一氮源的选择
在确定最优碳源后，用单一氮源替换发酵培养基中的酵母粉和胰蛋白胨，单一氮源为蛋白胨、酵母浸膏、麸皮、豆粕、玉米浆粉、硫酸铵和氯化铵中的任意一种，添加量为30g/L；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳氮源为豆粕(图3)。
(2)第一氮源浓度的选择
具体实施方式同上述步骤(1)，区别在于，将培养基中的酵母粉和胰蛋白胨替换为不同浓度豆粕(20、25、30、35、40、45、50g/L)；摇瓶发酵后测定发酵液酶活，豆粕浓度在40～50g/L时，角蛋白酶酶活可达181660U/mL及以上(图4)。
(3)第二氮源的选择
在已经确定一种氮源(40g/L的豆粕)的基础上，向含单一碳源40g/L的豆粕的发酵培养基中，分别添加硫酸铵、氯化铵、玉米浆粉、蛋白胨、酵母浸膏，添加量为10g/L；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定第二氮源为酵母浸膏(图5)。
(4)第二氮源浓度的选择
向含单一碳源40g/L的豆粕的发酵培养基中，分别添加不同浓度酵母浸膏(1、5、10、15、20、25、30g/L)；按照实施例1，进行测定发酵液酶活，酵母浸膏浓度在5g/L、25～30g/L时，角蛋白酶酶活可达240180U/mL及以上(图6)。
实施例4：应用含不同金属离子的培养基制备角蛋白酶
在发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏)的基础上，将培养基中的Mg2+替换为金属离子K+、Na+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+，添加浓度为0.3g/L；按照实施例1，进行摇瓶发酵培养24h，测定发酵液酶活，确定金属离子种类为Mg2+(图7)。
在发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏)的基础上，分别添加不同浓度MgSO4·7H2O(0.1、0.3、0.5、1、1.5g/L)；按照实施例1，进行摇瓶发酵培养24h，测定发酵液酶活，硫酸镁浓度在0.3～0.5g/L时，角蛋白酶酶活可达209400U/mL及以上(图8)。
实施例5：应用含不同磷酸盐的培养基制备角蛋白酶
在发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/L MgSO4·7H2O)的基础上，对发酵培养基中磷酸根离子浓度优化，将Na2HPO4·12H2O和KH2PO4浓度比例确定在2：1，添加不同浓度的磷酸盐(0、2.25、4.5、9、13.5、18、22.5g/L)；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液浓度确定最佳磷酸盐添加量。如图9所示，磷酸盐浓度在4.5～22.5g/L时，角蛋白酶酶活可达215690U/mL及以上；在磷酸盐浓度为4.5g/L时，磷酸盐为3g/LNa2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4。
实施例6：应用不同初始pH的培养基制备角蛋白酶
在发酵培养基(碳源和氮源为30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/LMgSO4·7H2O，3g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4)的基础上，将发酵培养基初始pH调整为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳初始pH。如图10所示，在pH为7～8时，角蛋白酶酶活可达230850U/mL及以上。
实施例7：应用含不同培养基接种量制备角蛋白酶
在发酵培养基(碳源和氮源为30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/LMgSO4·7H2O，3g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4)、初始pH为7.5的基础上，将OD600为0.8的二级种子液以不同接种量(1％、3％、5％、7％、9％)接入发酵培养基中；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活，确定最佳接种量。如图11所示，在接种量为5％～7％时，角蛋白酶酶活可达227940U/mL及以上。
实施例8：应用含不同发酵温度制备角蛋白酶
在发酵培养基(碳源和氮源为30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，0.3g/LMgSO4·7H2O，3g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4)、初始pH为7.5、以5％的接种量接种OD600为0.8的二级种子液的基础上，调整发酵温度分别为30℃、32℃、35℃、37℃、40℃；按照实施例1，进行摇瓶培养24h，测定发酵液酶活确定最佳培养温度。如图12所示，在发酵温度为35℃～37℃时，角蛋白酶酶活可达213680U/mL及以上。
实施例9：发酵条件的综合优化
响应面试验
1)Plackett-Burman实验设计：将实施例2～8中的八个因素(蔗糖、豆粕、酵母浸膏、硫酸镁、磷酸盐、pH、接种量、温度)作为试验的因素，以角蛋白酶酶活(Y)为响应值，利用Minitab 19软件进行n＝12的Plackett-Burman(PB)试验设计。PB试验设计的各因素与水平如表1所示。试验结果表明酵母浸膏、pH和温度为显著因素。
表1 Plackett-Burman设计因素与水平
Figure BDA0002461925270000061
2)Box-Behnken中心组合试验：利用PB设计试验筛选出三个显著性因素，即酵母浸膏(A)、pH(B)、温度(C)。利用Design-Expert 8.0软件，采用Box-Behnken中心组合试验进行实验条件优化，以酵母浸膏(A)、pH(B)、温度(C)为变量，以角蛋白酶酶活(Y)为响应值设计3因素3水平试验，试验方案中的各因素和水平如表2所示。响应面及等高线图如图13，最终优化结果为酵母浸膏5.72g/L，pH 7.68，温度37.69℃。理论最高酶活达到261711U/mL。
为验证模型的准确性及重复性，利用上述最佳工艺参数进行三次平行验证，将初始温度分别设置为37℃和37.69℃，其余条件分别为：发酵培养基组分：30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，3g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，0.3g/L MgSO4·7H2O；种子液菌浓度OD600为0.8，接种量5％，pH 7.68。
测定角蛋白酶的平均酶活为260480±1430U/mL。
表2响应面试验因素与水平
Figure BDA0002461925270000062
实施例10：在3L发酵罐中生产角蛋白酶
使用优化后的发酵培养基(30g/L蔗糖，40g/L豆粕，5.72g/L酵母浸膏，3g/LNa2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，0.3g/L MgSO4·7H2O)及发酵条件对菌株进行3L发酵罐试验。
3L发酵罐的装液量为1.5L，按5％接种量转接二级种子(OD600为0.8)至发酵罐中，发酵初始条件为温度37℃，pH 7.68，通气量1.5L/min。控制发酵过程中pH 7、温度37℃、溶氧25-30％、发酵时间9-16h以30mL/h、26-30h以25mL/h恒速补料浓度为720g/L葡萄糖，发酵10h后以0.5mL/h速度补料消泡剂，发酵过程中定时取样测定菌浓和角蛋白酶酶活。如图13和表3所示，发酵26h，发酵酶活达到704400U/mL。
表3菌株发酵产角蛋白酶结果
Figure BDA0002461925270000071
对比例1
具体实施方式同实施例2～8，区别在于，使用培养基组分为：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，Na2HPO4·12H2O 6，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O 0.3，初始pH 7，接种量为5％，培养温度为37℃，在220rpm培养24h，测定发酵液酶活为61210U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种生产角蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法是将角蛋白酶发酵菌株在具有如下成分的培养基中产酶：蔗糖、豆粕、酵母浸膏、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O；所述蔗糖的含量为30 g/L；所述豆粕的含量为40 g/L；所述酵母浸膏的含量为5.72 g/L；所述Na2HPO4·12H2O的含量为3 g/L，所述KH2PO4的含量为1.5 g/L；所述MgSO4·7H2O的含量为0.3 g/L；所述角蛋白酶发酵菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述角蛋白酶发酵菌株按3~8%的接种量接种初始OD600为0.6~1.2的菌株。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产酶是在36~40℃下进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产酶是在pH 6~8下进行。
5.一种培养基，其特征在于，所述培养基的组分为蔗糖、豆粕、酵母浸膏、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O；所述蔗糖的含量为30 g/L；所述豆粕的含量为40 g/L；所述酵母浸膏的含量为5.72 g/L；所述Na2HPO4·12H2O的含量为3 g/L；所述KH2PO4的含量为1.5 g/L；所述MgSO4·7H2O的含量为0.3 g/L。
6.权利要求1~4任一所述方法，或权利要求5所述培养基在饲料、制革畜牧、医药领域制备角蛋白酶或降解角蛋白中的应用。
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