KR102088764B1 - 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 커피 찌꺼기를 동시에 당화 및 발효함으로써 젖산을 생산하는 것에 관한 것으로, 커피 찌꺼기를 최적 조건으로 전처리하고 최적 조건으로 당화와 발효를 동시에 진행함으로써 젖산의 생산성을 향상시키고 당화발효 시간을 단축할 수 있으며, 가장 효율적으로 커피 찌꺼기를 바이오 에너지원 생산을 위한 대체 자원으로서 이용할 수 있다.

Description

커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법 {METHOD FOR PRODUSING LACTIC ACID USING SPENT COFFEE GROUNDS}

본 발명은 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법으로, 커피 찌꺼기를 동시에 당화 및 발효함으로써 젖산을 생산하는 것에 관한 것이다.

현재 전 세계적으로 가장 많이 선호되는 기호 음료 중 하나인 커피는 70개 이상의 국가에서 매년 8만톤 이상 생산되어 수출되고 있다 (Burniol-Figols, A., et al., Integration of chlorogenic acid recovery and bioethanol production from spent coffee grounds. Biochemical Engineering Journal, 2016. 116: p. 54-64.). 커피 찌꺼기는 커피 원두로부터 추출하고 남은 농가공 부산물로서 커피 원두의 질량당 50%이상을 차지하기 때문에 매년 상당한 양의 커피 찌꺼기가 생산될 것이라고 예상된다 (Campos-Vega, R., et al., Spent coffee grounds: A review on current research and future prospects. Trends in Food Science & Technology, 2015. 45(1): p. 24-36.). 우리나라의 커피 소비량은 국민 1인당 1년에 333잔을 소비하는 엄청난 소비량을 보이고 있으며, 이와 관련하여 커피 찌꺼기 또한 상당량이 배출되고 있다. 일부 커피 찌꺼기를 탈취제 등의 용도로 사용하고 있지만, 이는 개인적인 소비에 그치고 있으며, 그 비율은 미미한 수준이다. 우리나라에서 발생되는 커피 찌꺼기 폐기물의 처리는 지금까지 대부분 매립이나 소각에 의존해왔는데, 매립 처리법은 커피의 카페인, 탄닌(Tannin) 성분과 여타 다른 성분 등으로 인해 토양과 여타 생물에 어떤 영향을 끼칠지 알 수 없고, 소각처리법은 연소가스가 발생하여 대기오염을 일으킬 수 있다. 따라서, 계속적으로 생산이 증가되고 있는 커피 찌꺼기를 재활용하여 쓰레기 방출을 줄이고 산업적으로 유용하고 효과적으로 이용할 수 있는 방법에 대한 필요성이 절실하게 요구되고 있다.

커피 찌꺼기에는 커피 원두의 생산지나 수확시기 등에 따라 다르지만, 미생물이 발효할 수 없는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 그리고 리그닌으로 구성되어 있기 때문에 발효 가능한 당으로 전환하는 전처리 과정이 필수적이다. 미생물 배양에 있어서 원료물질로 탄소원, 질소원, 일반 무기염류 등의 배지분이 사용되고 있으며, 탄소원, 질소원, 무기염류가 혼합된 형태의 추출물, 소화물 등이 사용되고 있다. "추출물"로 가장 많이 사용되는 것으로 효모 발효 추출물(yeast extract), 소고기 추출물(beef extract), 맥아 추출물(malt extract) 등이 있다. "소화물"은 펩톤 등의 가수분해 산물로, 단백질을 원료로 하여 산, 효소 등의 처리를 통해 아미노산 등 미생물 필수 영양원으로 사용될 수 있도록 제조된 물질을 말한다. 예를 들어, 소화물은 우유, 콩, 육류, 미생물 등의 단백질 함유물질을 원료로 제조된다. 이러한 물질들은 생체물질을 원료로 하며, 생체 발육에 필요한 여러 가지 비타민, 무기물, 탄소원, 질소원 등을 균형있게 포함하고 있어 미생물 배양용 배지 성분의 주원료로 사용되고 있다. 예로서 LB 배지(Luria-Bertani medium)의 경우 효모 추출물(Yeast extract)과 트립신에 의해 소화된 단백질 가수분해물인 트립톤이 포함되어 있으며, 효모 배양 시 많이 사용되는 YM 배지도 효모 추출물과 맥아 추출물이 포함되어 있다. 이러한 추출물은 미생물 성장에 중요한 역할을 하며, 산업적 미생물 배양에 있어서 가장 중요한 성분이다.

한편, 젖산(Lactic acid)은 GRAS(Generally Recognized As Safe)로서 식품 첨가물, 화장품 산업, 작물, 화학산업 등의 다양한 분야에서 응용되고 있다 (Lee, J.W., et al., Co-expression of two heterologous lactate dehydrogenases genes in Kluyveromyces marxianus for l-lactic acid production. Journal of biotechnology, 2017. 241: p. 81-86., Upadhyaya, B.P., L.C. DeVeaux, and L.P. Christopher, Metabolic engineering as a tool for enhanced lactic acid production. Trends in biotechnology, 2014. 32(12): p. 637-44.). 현재 젖산은 화학적인 방법 또는 생물학적인 방법으로 합성이 될 수 있는데, 생물학적 합성을 통해서 보다 순도 높은 젖산을 생산할 수 있다고 알려져 있다 (Ishida, N., et al., Efficient production of L-Lactic acid by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae with a genome-integrated L-lactate dehydrogenase gene. Applied and environmental microbiology, 2005. 71(4): p. 1964-70.). 게다가, 젖산은 폴리-젖산(poly-lactic acid)의 전구체로서 생분해가 가능한 친환경 소재 플라스틱의 주 원료로 사용될 수 있기 때문에 미생물을 이용한 젖산의 생산에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 젖산은 일반적으로 Lactobacillus 속과 같은 유산균에 의해서 생산되지만, 유산균의 낮은 산내성과 젖산 생산 효율이 낮은 문제점이 있어왔다.

본 발명의 목적은 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법 및 이를 이용하여 생산된 커피 찌꺼기 유래 젖산을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 커피 찌꺼기 유래 미생물 배양용 배지의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 미생물 배양용 배지를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법 및 이를 이용하여 생산된 커피 찌꺼기 유래 젖산을 제공한다.

아울러, 본 발명은 커피 찌꺼기 유래 미생물 배양용 배지의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 미생물 배양용 배지를 제공한다.

본 발명에 따르면, 커피 찌꺼기를 최적 조건으로 전처리하고 최적 조건으로 당화와 발효를 동시에 진행함으로써 젖산의 생산성을 향상시키고 당화발효 시간을 단축할 수 있으며, 가장 효율적으로 커피 찌꺼기를 바이오 에너지원 생산을 위한 대체 자원으로서 이용할 수 있다.

도 1은 커피 찌꺼기 및 이의 당화물, 전처리된 커피 찌꺼기, 이의 고형분 및 이의 당화물의 정성/정량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 커피 찌꺼기의 전처리 조건에 따른 글루코스 생산 정도를 확인한 도이다:
a: 커피 찌꺼기 함량별 글루코스 생산량;
b: 전처리 시간별 글루코스 생산량; 및
c: 황산 농도에 따른 글루코스 생산량.
도 3은 전처리 최적조건 (커피 찌꺼기 함량 10%, 60분, 황산 1%, 121℃)에서 전처리한 커피 찌꺼기 또는 전처리하지 않은 커피 찌꺼기를 기질로한 FPU 별 당화율을 나타낸 도이다.
도 4는 20 g/L 글루코스 (a), 20 g/L 자일로스 (b), 및 10 g/L 글루코스 및 10 g/L 자일로스 (c)를 함유하는 YP 배지에서의 사카로마이세스 세레비지애 DY2LDH의 발효 특성을 확인한 도이다.
도 5는 동시 당화발효에서 단일/복합 효소 처리에 따른 젖산 생산성을 확인한 도이다:
a: 발효 가능한 당 함량;
b: 젖산 생산량; 및
c: 젖산 생산성.
도 6은 동시 당화발효에서 교반 속도에 따른 젖산 생산성을 확인한 도이다:
a: 발효 가능한 당 (자일로스, 만노스, 갈락토스) 함량;
b: 젖산 생산량; 및
c: 젖산 생산성.
도 7은 동시 당화발효에서 전처리된 커피 찌꺼기의 상 (액체/고체/슬러지)에 따른 젖산 생산성을 확인한 도이다:
Whole SCG: 전처리한 전체 커피 찌꺼기;
Liquid phase: 전처리한 커피 찌꺼기에서 분리한 액상 부분;
Washed solids: 전처리한 커피 찌꺼기에서 분리한 고체상 부분;
a: 발효 가능한 당 함량;
b: 젖산 생산량; 및
c: 젖산 생산성.
도 8은 전처리한 커피 찌꺼기에서 분리한 고체상 부분을 80rpm으로 동시 당화발효 (a), 전처리한 전체 커피 찌꺼기를 80rpm으로 동시 당화발효 (b) 및 전처리한 전체 커피 찌꺼기를 250rpm으로 동시 당화발효한 결과 (당화 가능한 당 함량, 젖산 생산량 및 에탄올 수율)을 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 1) 커피 찌꺼기를 전처리하는 단계; 및 2) 전처리한 커피 찌꺼기를 당화 및 발효하는 단계를 포함하는, 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 커피 찌꺼기의 전처리는 커피 찌꺼기 5 내지 30% (w/v)을 0.5 내지 5% H₂SO₄로 80 내지 130℃에서 20 내지 80분 동안 처리하는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 당화 및 발효에 이용하는 전처리한 커피 찌꺼기는 액상 또는 고상으로 분리하지 않은 전처리한 커피 찌꺼기 전체 슬러리일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 당화는 전처리한 커피 찌꺼기에 당화 효소를 처리하는 것일 수 있으며, 당화 효소는 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소일 수 있고, Cellic CTec2, Celluclast 1.5L, 또는 Cellic CTec2 및 Celluclast 1.5L일 수 있으며, Cellic CTec2 및/또는 Celluclast 1.5L일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 발효는 효모균을 처리하여 당화로 인해 생성된 당을 젖산으로 변환하는 것일 수 있으며, 상기 효모균은 내산성 효모균에 LDH 유전자가 도입된 효모균일 수 있고, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으며, 기탁번호 KCTC13633BP로 기탁된 사카로마이세스 세레비지애 DY2LDH인 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 상기 당화 및 발효는 당화 후 발효가 순차적으로 이루어지거나 동시에 이루어질 수 있으며, 당화 및 발효가 동시에 이루어지는 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 당화 최적 온도는 50℃이고, 발효 최적 온도는 30℃이며, 당화 및 발효를 동시에 수행하는 경우 최적 온도는 35 내지 38℃일 수 있다.

일 구현예에서, 당화 최적 pH는 4.8이고, 발효 최적 pH는 7이며, 당화 및 발효를 동시에 수행하는 경우 최적 pH는 5 내지 7일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 당화는 CTec2 및 Celluclast 1.5L를 4:1 (w/w)으로 배합하여 처리하여 수행될 수 있으며, 상기 당화 및 발효는 80RPM의 교반 속도에서 이루어질 수 있다.

일 구현예에서, 상기 방법으로 젖산과 함께 에탄올을 생산할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "커피 부산물"은 커피펄프(pulp), 커피겉껍질(husk), 커피외피(silver skin), 커피박(spent coffee grounds; SCG)을 포함하며, "커피 찌꺼기" 또는 "커피박"은, 커피 원두를 분쇄한 분말로 커피를 추출한 뒤 또는 인스턴트 커피 생산 후 남은 모든 잔류 물질을 말한다,

일반적으로, 젖산을 생산하는 젖산균의 경우, 발효 이후에 생산된 젖산균에 의해 산성 조건의 환경이 조성되므로 균주의 대사가 정지되거나, 다른 방향으로 진행이 되나, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 DY2LDH는 LDH 유전자가 도입되어 젖산을 생산할 수 있으면서 높은 산내성을 가지므로, 이와 같은 젖산 생산의 한계가 없는 장점이 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된, 커피 찌꺼기 유래 젖산에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 방법으로 생산된, 커피 찌꺼기 유래 젖산은 식품 첨가물, 화장품 첨가물, 비료, 사료 등에 이용될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된, 커피 찌꺼기 유래 에탄올에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 1) 커피 찌꺼기를 전처리하는 단계; 및 2) 전처리한 커피 찌꺼기를 당화하는 단계를 포함하는 커피 찌꺼기 유래 미생물 배양용 배지의 제조 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 단계 2) 이후에 원심분리하여 액상을 수득한 후 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 미생물 배양용 배지에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 미생물 배양용 배지는 커피 찌꺼기 유래 가용당을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "가용당"은 글루코오스 또는 자일로오스 등의 단당류로서 탄수화물의 단위체인 다당류를 분해함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명에서는 커피 찌꺼기에 존재하는 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 자일란을 분해하여 가용당을 얻을 수 있으며, 얻어지는 가용당은 미생물이 생장을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "미생물"은 대장균, 바실러스(Bacillus)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 스트랩토마이세스(Streptomyces)속 및 효모(yeast)속 미생물로 구성된 군 중 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 대장균, 바실러스속, 락토바실러스속, 슈도모나스 속, 스트랩토마이세스 속 및 효모 속 미생물이라면 제한없이 포함할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. LDH 유전자를 도입한 내산성 효모 균주 제작

1-1. LaLDH 플라스미드 제작

pRS42K PGK1p-CYC1t 플라스미드를 제한효소 SacⅠ/ KpnⅠ로 절단하여 PGK1p-CYC1t 단편을 얻었다. 그 후, 이를 SacⅠ/KpnⅠ를 처리한 pRS42K 벡터에 도입하였다. 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus) ATCC4356로부터 젖산 탈수소효소를 암호화하는 LDH 유전자 (LaLDH)를 락토바실러스 애시도필러스 NCFM 균주 유전자 (NCBI Reference SequenceL NC_006814.3)를 참고하여 제작한 프라이머 세트 (5'-GGCGGATCCAAAAATGGCAAGAGTTGAAAAACCTC-3' 및 5'-GGCCTCGAGTTATTATTGACGAACCTTAACGCCA-3')를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭한 LaLDH 유전자 단편과 pRS42K PGK1p-CYC1t 플라스미드에 BamHⅠ/XhoⅠ를 처리하여 pRS42K PGK1p-LaLDH-CYC1t 플라스미드를 제작하였다.

1-1. 균주 제작

Cas9 유전자를 발현시키기 위해, pRS41N-Cas9 플라스미드를 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) SR8 균주에 도입한 뒤 100μg/mL CloNATYPD를 함유하는 YPD 아가 플레이트에서 선별하였다. 그 후, 가이드 RNA와 프라이머 세트 (5'CCGGGTAGATTTTTCCGTAACCTTGGTGTCGGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3 및 5'-AGAAGTTTTTTTACCCCTCTCCACAGATCGTGAGTAAGGAAAGAGTGAGG-3')로 증폭한 PGK1p-LaLDH-CYC1t 도너 DNA 단편을 사카로마이세스 세레비지애 pRS41N-Cas9 균주에 도입하여 그 결과 생성된 균주를 100μg/mL ClonNAT 및 300μg/mL 하이그로마이신 B를 함유하는 YPD 아가 배지에서 선별하였다. 최종 돌연변이 균주로의 LDH 유전자의 도입은 콜로니 PCR로 확인하였다. 30℃에서 80rpm으로 배양시 도 1의 발효 특성을 가지는, 탄당과 육탄당을 대사하여 젖산(lactic acid)를 생산하도록 LDH(lactate dehydrogenase) 유전자를 도입한 내산성 사카로마이세스 세레비지애 SR8 LDH 균주 (기탁번호 KCTC13633BP)는 YPD 배지 (10g/L yeast extract, 20 g/L peptone 및 20 g/L glucose)에 버퍼 프탈산수소칼륨(potassium hydrogen phthalate) (50 mM)을 혼합한 배지에 분주한 뒤 30℃에서 250rpm로 24시간 동안 1차 배양하였다.

실시예 2. 커피 부산물 효소 전처리 및 최적 조건 수립

2-1. 커피 부산물 전처리

커피를 제조하고 남은 커피 찌꺼기(Spent Coffee Grounds, SCG)를 지퍼백에 밀봉한 후 4±2℃ 냉장고에 보관하였다. 커피 찌꺼기를 1% (w/w) 황산 용액의 부피 대비 10% (w/v) 첨가하여 60분 동안 121℃로 전처리한 커피 찌꺼기를 45℃에서 건조한 뒤, 0.3g을 3mL의 72% H₂SO₄(w/w)와 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 증류수 84mL로 씻어내 혈청 보틀로 옮겨 121℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 흡입기(aspirator)를 연결하여 글라스 필터(glass filter)로 여과시키고, 여과된 액체는 칼슘 카보네이트로 중화한 뒤, 고체 잔여물은 뜨거운 증류수로 씻어내며 중화하였다. 상기 중화된 액체를 0.2㎛ 시린지 필터로 여과한 후 HPLC(High performance liquid chromatography) (Agilent Technoliges 1260 series, USA) 및 RID(refractive index detector) (Agilent Technologies)를 이용하여 정량분석하였다. 이 중 리그닌의 함량은 상기에서 중화된 고체 잔여물을 드라잉 오븐(drying oven) (BF-135C, BioFree, KOREA)에서 105℃에서 4시간 동안 건조한 후 고형분을 회화로 (Electric muffle furnace, JSMF-45T, JS Research Inc., KOREA)에서 575℃에서 4시간 동안 태워 데시케이터(desiccator)에 넣고 식혀 무게를 측정했다.

그 결과, 전처리된 커피 찌꺼기의 고체 부분에는 글루코스가 대부분이었고, 액체 부분에는 글루코스를 제외한 당이 상대적으로 많이 존재한 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

2-2. 전처리 커피 부산물의 당화

상기의 다양한 조건으로 전처리된 커피 찌꺼기를 당화하기 위해, 효소 CTec2 (10 FPU/g) 및 Celluclast 1.5L (10 FPU/g)를 각각 처리하여 글루코스 생성 정도를 확인하였다. 구체적으로, 상기에서 전처리 된 커피 찌꺼기의 불용성 고형분 (insoluble solid)을 1.0M의 pH5.0 구연산나트륨 버퍼(sodium citrate buffer) 0.5 mL 및 5% 소듐 아자이드(sodium azide) 0.1 mL와 혼합한 뒤, Cellic CTec2 (10 FPU/g) (NoboZymes) 및 Celluclast 1.5L (10 FPU/g) (NoboZymes)를 각각 처리하여 진탕배양기 (Shaking incubator, BF-50SIR, BioFree, Korea)를 이용하여 50℃에서 300 RPM으로 72시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 상등액만 취해서 0.2㎛ 시린지 필터로 여과한 뒤 HPLC를 이용하여 정량분석하였다. 한편, 전처리 전의 커피 찌꺼기와 전처리가 된 커피 찌꺼기의 성분분석을 위해, 전처리하지 않은 커피 찌꺼기로부터 생성된 글루코스의 양은 불용성 고형분 회수량 (insoluble solids recovery), 불용성 글루칸 회수량 (insoluble glucan recovery) 및 당화율 (enzymatic digestibility)의 값을 구하여, 세 값을 곱해 구하였다.

그 결과, 효소 당화 결과, 두 효소 모두 생성된 글루코스의 양 (g glucan/g raw SCG)이 가장 많은 것으로 나타난 전처리에 이용된 커피 찌꺼기의 함량은 황산 용액의 부피 대비 10% (w/v) (도 3a)로, 전처리 효소 당화 시간은 60분 (도 3b), 황산 농도는 1% (w/v) (도 3c) 및 황산 처리 온도 121℃로 나타났다. 또한, 상기 전처리 최적조건 (황산 용액의 부피 대비 커피 찌꺼기 함량 10%, 60분, 황산 1%, 121℃)에서 전처리한 커피 찌꺼기 또는 전처리하지 않은 커피 찌꺼기를 기질로한 FPU 별 당화율은 전처리한 경우 현저히 높은 것으로 나타났다 (도 4).

실시예 3. 전처리 커피 부산물의 동시 당화발효

3-1. 효소에 따른 젖산 생산 효과 비교

상기 실시예 2에서 전처리 최적 조건으로 수립한 황산 용액의 부피 대비 커피 찌꺼기 함량 10% (w/v)을 1% H₂SO₄로 121℃에서 60분 동안 전처리하는 조건으로 커피 찌꺼기를 전처리한 후, 칼슘 카보네이트를 이용하여 pH6으로 중화한 뒤 10g/L 이스트익스트랙트 및 20g/L 펩톤과 혼합하여 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 멸균된 샘플은 프탈산수소칼륨 (50 mM)에 단일 효소 CTec2 (40 FPU/g), 또는 CTec2 (40 FPU/g)+Celluclast 1.5L (10 FPU/g)을 처리하고, 상기 실시예 1에서 제작한 균주를 초기세포농도 OD₆₀₀=0.5로 맞춰 접종하였다. 그 후, 진탕배양기로 30℃에서 80 rpm로 호기적으로 발효하면서, 시간별로 당화된 발효 가능한 당의 함량 및 젖산 생산 정도를 HPLC 및 RID를 이용하여 확인하였으며, 분석에 사용된 컬럼은 Rezex ROA-Organic Acid H⁺ (8%) 컬럼 (Phenomenex Inc.)이고, 이동상 0.005N H₂SO₄, 온도 50℃, 유속 0.6mL/min로 각 시료를 15분간 분석하였다.

그 결과, 발효 0시간 내지 4시간에는, 단일 효소만을 사용하였을 때가 배합한 효소를 사용했을 때 보다 당화된 발효 가능한 당 (glucose, xylose, mannose 및 galactose)이 훨씬 많은 것으로 나타났고 (도 5a), 발효 6시간째부터는 소비되는 발효 가능한 당의 양이 두 조건이 유사하게 나타났으며, 발효 24시간째에는 당이 거의 소비되어 두 조건 모두 발효가 완료되었다. 또한, 젖산 생산량은 발효 12시간까지는 단일 효소 또는 배합 효소에서 모두 비슷한 양으로 나타났으나, 발효가 완료된 24시간째에는 배합한 효소에서 생성된 젖산의 양이 더 많은 것으로 나타났다 (도 5b). 아울러, 발효 가능한 당으로부터 생산되는 젖산의 24시간 동안의 생산성(productivity)을 확인해 본 결과, 단일 효소의 사용한 경우보다 배합한 효소를 사용한 경우에서 동시당화발효에서의 생산성이 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 5c). 단일 효소로 발효 4시간까지의 당화된 발효 가능한 당이 많았음에도 불구하고 적은 양의 젖산을 생산한 점과 상기 결과를 통해, 두 효소를 배합한 동시 당화발효가 적합하다고 판단하였다.

3-2. 산소 공급량에 따른 젖산 생산 효과 비교

상기 실시예 3-1의 두 효소를 배합하여 적용한 동시 당화발효에서, 교반 속도를 80RPM 또는 250RPM으로 다르게하여 산소 공급량이 다른 두 조건으로 동시당화발효를 진행하였다.

그 결과, 발효 0시간 내지 12시간에서 교반 속도 250RPM로 동시 당화발효한 경우가 80RPM로 동시 당화발효하는 경우보다 소비되는 발효 가능한 당의 이용 속도가 더 빠른 것으로 나타났으며, 발효 24시간째에는 발효 가능한 당이 거의 소비되어 두 조건에서 모두 발효가 완료되었다 (도 6a). 또한, 생성되는 젖산 역시 발효 12시간까지 80RPM보다 250RPM에서 조금 더 많은 것으로 나타났다 (도 6b). 그러나, 발효가 완료된 24시간째에는 80RPM에서 11.15g/L 및 250RPM에서 5.97g/L의 젖산이 생성되어 결과적으로는 80RPM에서 250RPM보다 1.86배 더 많이 생성된 것을 알 수 있었다 (도 6c). 즉, 호기적인 조건에서 산소 공급량이 많아질수록 발효 속도가 빨라지며 생산성 역시 높을 것이라고 예상된 것과 달리, 24시간 동안의 발효 가능한 당으로부터 생성된 젖산의 생산성(productivity)은 80RPM에서 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 따라서, 젖산을 생산하는 동시 당화발효 최적 RPM은 80RPM인 것으로 판단되었다.

3-3. 커피 찌꺼기 상에 따른 젖산 생산 효과 비교

상기 실시예 2의 최적 조건으로 전처리된 커피 찌꺼기의 고체 부분, 액체 부분 및 액체/고체로 분리하지 않은 슬러리의 발효 가능한 당의 종류 및 농도를 확인하고, 각각 상기 실시예 3-1의 두 효소를 배합하여 적용하여 80RPM으로 24시간 동안 동시 당화발효한 뒤 당화된 당의 양, 발효 결과 (젖산 생산)을 비교하였다.

¹⁾Not Detected.

²⁾자일로스, 갈락토스 및 만노스를 포함하는 헤미셀룰로스 모노머(hemicellulosic monomers)

그 결과, 커피 찌꺼기의 고체 부분을 이용한 경우 효소로 당화된 당의 양이 가장 적었으며, 발효 8시간만에 발효 가능한 당이 모두 소비된 것을 확인할 수 있었다 (도 7a). 반면에, 커피 찌꺼기의 액체 부분과 분리하지 않은 슬러리를 이용한 경우 발효 4시간 및 6시간까지 당화가 이루어지며 각각 최대 24.49 g/L 및 24.24 g/L까지 당화된 것을 확인할 수 있고 발효 24시간째에 발효가 완료되었다 (도 7a). 커피 찌꺼기의 액체 부분을 이용한 경우 발효 12시간째에 약간의 당이 남아 있어 24시간째에 발효가 완료되었다 (도 7a). 또한, 발효 결과, 커피 찌꺼기의 고체부분을 이용한 경우에는 발효 가능한 당의 양이 적었기 때문에, 2.70 g/L의 적은 양의 젖산을 생산하였으나 (도 7b), 커피 찌꺼기의 액체 부분과 분리하지 않은 슬러리를 이용한 경우에는 각각 11.04 g/L 및 11.15 g/L의 젖산을 생산한 것으로 나타났다 (도 7b). 이를 통해, 24시간 동안 전처리된 커피 찌꺼기의 발효 가능한 당으로부터 생성된 젖산 생산성(productivity)은 전처리된 커피 찌꺼기의 고체상 (고체 부분)이 액체상 (액체 부분) 및 슬러리에 비해 유의적으로 매우 낮은 것으로 나타났고 도 7c), 액체상 및 슬러리는 유의적인 차이를 나타내지 않고 거의 비슷한 생산성을 나타냈다.

추가로, 전처리한 커피 찌꺼기에서 분리한 고체상 부분 및 전처리한 커피 찌꺼기 전체 부분을 80rpm 또는 250rpm으로 동시 당화발효 (CTec2 40 FPU 및 Celluclast 1.5L 10 FPU, 및 사카로마이세스 세레비지애 DY2LDH로 30℃에서)한 뒤, 당화 가능한 당 함량, 젖산 생산량 및 에탄올 수율을 확인한 결과, 전처리한 전체 커피 찌꺼기를 80rpm으로 동시 당화발효한 경우가 가장 동시 당화발효 효과가 좋은 것으로 나타났다 (도 8).

본 발명에서 발효에 사용된 균주 DY2LDH는 자일로스(xylose)를 기질로 사용하면 대부분이 젖산으로만 대사가 되지만, 글루코스를 기질로 사용하면 젖산뿐만 아니라 에탄올로도 대사가 된다. 따라서, 전처리 커피 찌꺼기의 액체 부분 및 슬러리를 이용하여 동시 당화발효시, 발효 24시간째에 생성된 에탄올의 양을 확인한 결과, 각각 7.10g/L 및 10.24g/L로 나타나, 슬러리를 이용한 경우 유의적으로 더 많은 양이 생성한 것을 알 수 있었다 (자료 미제시). 이를 통해, 액체상과 슬러리를 이용하여 생성된 젖산의 양이 유사한 정도로 나타난 것은 슬러리에 글루코스가 액체상에서보다 더 많이 함유되어 있어, 젖산뿐만이 아니라 에탄올도 생성이 되었기 때문인 것으로 유추된다. 이에, 액체상과 슬러리를 이용하였을 때, 생성된 젖산의 양이 비슷하였으므로, 고체와 액체로 분리하는 비용을 절감할 수 있는 전처리 된 커피 찌꺼기 슬러리를 발효에 이용하는 것이 적합하다고 판단된다.

상기 실시예에서와 같이, 커피 찌꺼기 10% (w/v)를 1% H₂SO₄를 이용하여 60분 동안 121℃의 조건으로 전처리 수행 시, 당화효소 (CTec2) (40 FPU/g)에 의해 53.00(g glucose/100g raw SCG)의 가장 많은 양의 글루코스를 생산할 수 있었으며, 상기의 최적화된 전처리 조건에서 전처리된 커피 찌꺼기를 액체/고체 상을 분리하지 않은 전체 슬러리를 CTec2 (40 FPU/g) 및 Celluclast 1.5L (10 FPU/g)을 배합한 복합효소를 이용하여 80 RPM의 조건에서 동시 당화발효하였을 때 가장 젖산 생산성이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 커피 찌꺼기는 상기의 전처리 및 발효를 이용하면 바이오 기반의 젖산을 생산할 수 있는 원료로 적합한 것을 알 수 있었다.

한국생명공학연구원 KCTC13633BP 20180903

Claims (13)

1) 커피 찌꺼기를 0.5 내지 5% 농도의 H₂SO₄ 용액의 부피 대비 10%(w/v)로 첨가하여 80 내지 130℃에서 20 내지 80분 동안 전처리하는 단계; 및
2) 액상 또는 고상으로 분리하지 않은 전처리한 커피 찌꺼기 슬러리에 당화 효소 및 효모균을 처리하여 35-38℃, pH5-7 및 80RPM의 교반 속도의 조건으로 당화 및 발효를 동시에 수행하는 단계를 포함하는, 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법.

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제 1항에 있어서, 상기 당화 효소는 셀룰라아제, β-글루코시다제, β-아가라제, β-갈락토시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제, α아밀라아제, β-아밀라아제, 아밀로글루코시다아제, 라미나린나아제, α-D-글루코시다아제, β-D-글루코시다아제, 수크라아제, 말타아제, 이소말타아제, 락타아제, 드리할라제, 울바나아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 분해효소인, 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법.

◈청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.◈

제 1항에 있어서, 상기 당화 효소는 셀룰라아제 및 β-글루코시다제인, 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법.

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제 1항에 있어서, 상기 효모균은 기탁번호 KCTC13633BP의 사카로마이세스 세레비지애인, 커피 찌꺼기를 이용한 젖산 생산 방법.

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