CN103088048A - 一种改造的克隆载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改造的克隆载体及其应用。本发明的改造的克隆载体，为环状克隆载体，为将pUC57载体的多克隆位点采用EcoRV、SmaI和StuI三个平端克隆位点替代，并去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点获得，所述改造的克隆载体仅有EcoRV、SmaI和StuI三个克隆位点。本发明的载体完全可以取代任何一种克隆载体而存在，使用方便，用途广。

Description

一种改造的克隆载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种克隆载体，尤其是一种方便基因克隆工作的载体。

背景技术

目前分子生物学领域常用的克隆载体分为两种；一种是有大量多克隆位点的环状克隆载体，一种是没有多克隆位点的线性T载体。但是他们均有一定的使用限制。

有多克隆位点的环状克隆载体，以pUC57为例，它的多克隆位点中包含有EcoRI,HindIII等常用酶切位点,但毕竟不能包含所有的酶切位点，比如常用的NotI,XhoI等，而往往插入的目的基因要使用这些没有的酶切位点，因此双酶切克隆就受到了一定的限制，除非在目的基因两端额外增加酶切位点。倘若使用平端克隆的话，有时候目的基因上又有载体上本身的酶切位点，这就造成了最终构建的重组质粒中有多个酶切位点，酶切位点的唯一性受到影响，会对后续的实验造成一定的影响。

线性T载体克隆，以pMD18-T simple为例，T载体只能克隆有A尾巴的PCR产物，而现今高保真酶（如PFU）的使用越来越普及，而用PFU扩增的产物均是平末端的，这给TA克隆带来了一定的麻烦。同时线性载体无法大量复制，因此技术和费用上往往受限于生产厂家，不能做到自给自足。另外，这个载体并不是去掉了全部常用的酶切位点，比如lacZ基因内部的NdeI就没有去掉，而往往这个位点对表达载体的构建是重要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的缺陷，提供一种改造的克隆载体及其应用。

本发明改造的克隆载体为没有任何常用克隆位点的环状克隆载体，本发明的克隆载体提供了一种全新的克隆方式。

本发明一方面提供了一种改造的克隆载体，为环状克隆载体，为将pUC57载体的多克隆位点采用EcoRV、SmaI和StuI三个平端克隆位点替代，并去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点获得，所述改造的克隆载体仅有EcoRV、SmaI和StuI三个克隆位点。

进一步的，所述改造的克隆载体中，将pUC57载体中序列为SEQ ID NO.2的LacZ序列及其互补序列替换为序列为SEQ ID NO.3的LacZ序列及其互补序列。

进一步的，所述去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点的方法为对NdeI位点做同义突变。

最佳的，所述改造的克隆载体的全长序列为SEQ ID NO.1。

本发明第二方面提供了所述改造的克隆载体在基因工程领域的应用。

本发明第三方面提供了一种克隆载体的构建方法，包括下列步骤：

1）酶切：采用EcoRV、SmaI或StuI酶切前述改造的克隆载体；

2）连接：在连接酶的作用下，酶切后的克隆载体与平端线性目的基因连接成环。

进一步的，所述酶切与连接在同一个体系中完成。本发明的克隆方法酶切后不需要酶切产物回收步骤。

本发明克隆方法的原理是：同一个体系中，内切酶将载体切成线性，在连接酶的作用下，目的基因与载体连接成环，而成环的分子已经没有该内切酶的识别位点了，可以稳定存在。而载体自身成环的则继续被内切酶消化成线性，直到所有载体都连上目的基因为止。目的基因上同时含有EcoRV SmaI StuI位点的可能性很小，因此总有一个平端酶适合于平端克隆。

本发明的克隆载体相比现有载体的优点在于：

a)该载体完全可以取代任何一种克隆载体而存在，使用方便，用途广。这对任何一个生物学实验室都是很有利的。

b)大大降低了工作成本：本发明的克隆载体作为一个环状质粒，可以像其他质粒一样，转化到大肠杆菌中长期保存、大量复制，这对于一个实验室来说很重要，因为这样一个克隆载体可以取之不尽，用之不竭。每一个生物学实验室都是有条件保存和抽提质粒的，只要简单的抽提一次质粒完全可以使用半个月甚至一年。一支530元的pMD18-Tsimple，仅仅只够完成10个TA克隆，而一个实验室有时候一天就要克隆不下于10个克隆。由此可见，使用pUCK载体降低的成本不可小觑，当然这还没有把PCR产物加A的费用计算在内。

c)克隆操作更为简单：本发明的克隆载体上没有任何常用的粘性末端酶切克隆位点，但有3个常用的平端克隆位点，再在本专利的平端克隆技术的帮助下，基本可以满足所有PCR产物的平端克隆，只需要用平端酶酶切本发明的克隆载体，之后与平端DNA产物混合连接即可，酶切和连接可以在同一个体系中完成，减少了酶切回收的步骤；克隆操作更为简单，克隆时，无需在目的基因两端额外增加酶切位点。

d)大大降低了后续工作的难度：接下来从克隆载体中切下目的基因时，可以避免载体上与目的基因两端相同的酶切位点因为酶切不完全而影响到后续亚克隆操作。且由于载体中只有三个平端克隆位点，而目的基因上同时含有EcoRV SmaI StuI位点的可能性很小，因此最终构建的重组质粒中酶切位点的唯一性容易保证，便于后续操作。

附图说明

图1空克隆载体的转化验证结果

图2插入目的片段验证筛选效果结果

图3载体pUCK全图

具体实施方式

以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1载体构建

以pUC57载体作为修改母本，将LacZ序列中的所有酶切位点做调整。去掉多克隆位点中的所有位点，更换为EcoRV SmaI StuI三个平端克隆位点，去掉LacZ下游的NdeI酶切位点，最终得到一个只有EcoRV SmaI StuI可用的重组质粒（以下简称载体pUCK）。

克隆载体pUCK的设计思路和技术路线如下：

1、LacZ序列设计。载体pUC57中的LacZ序列为SEQ ID NO.2，修改后的LacZ序列为SEQ ID NO.3，本发明是将pUC57中的LacZ上游的多克隆位点去掉，更换成了三个平端克隆位点EcoRV SmaI StuI，同时对NdeI做了同义突变。确保LacZ基因能够顺利表达，并行使正常功能。

SEQ ID NO.2pUC57中的LacZ 348bp

Atgaccatgattacgccaagcttgcatgcaggcctctgcagtcgacgggcccgggatccgatatctagatgcattcgcgaggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag

SEQ ID NO.3修改后的LacZ 306bp

atgaccatgattacgccaagctCTGAGgatatCCCGGGTCaggcctGTGTCaattCactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccggatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatag

2、克隆载体的构建。根据基因的具体情况,用primer5.0软件设计引物并PCR获得SEQ ID NO.3，之后重组构建载体pUCK，对应的全长序列为SEQ ID NO.1(SEQID NO.3的序列与SEQ ID NO.1中的对应LacZ序列的反向互补序列一致，均对应为LacZ基因。),载体全图如图3.

SEQ ID NO:1：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATCCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGACACAGGCCTGACCCGGGATATCCTCAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

此序列中，对应lacZ基因的序列为第146-451位；同义突变NdeI位点为第183-188位；第406-424位为引入的StuI、SmaI、EcoRV位点。

设计如下四条引物：

P1    ACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCAT（SEQ ID NO.6）

P2    atttcacaccggatatggtgcactctcagt（SEQ ID NO.7）

P3    gtgcaccatatccggtgtgaaataccgcac（SEQ ID NO.8）

P4    ATATCCCGGGTCAGGCCTGTGTCAATTCACTGGCCGTCG（SEQ ID NO.9）

P5    gacgaagacaAAGCTCTGAGGATATCCCGGGTCAGGCCTGT（SEQ ID NO.10）

以pUC57模板，用上游引物P1和下游引物P2引物扩增273bp片段，用上游引物P3和下游引物P4引物扩增247bp片段，用上游引物P1和下游引物P5重叠PCR获得516bp全长片段。

PCR反应体系：

反应程序：

1.95℃（预变性）3min;

2.94℃（变性）20s

3.57℃（退火）20s

4.72℃（延伸）35s  ;

2-4进行22个循环

5.72℃（延伸）5min

酶切连接

将PCR获得的全长片段用AatII/HindIII酶切消化2小时，同时空载体pUC57用AatII/BpiI酶切消化2小时，回收。按照以下连接方案完成载体构建。

连接体系：20ul

各成分实际使用量：

样本（消化的全长片段    300ng

载体（消化的PUC57）     100ng

T4DNA Ligase 5u

10X T4DNA Ligase 2ul

ddH2O补充至20ul

轻轻混匀，低速离心，16℃过夜反应。

取连接液10ul热转化至E.coli DH5α，涂布平板过夜培养菌体，筛选，测序获得完全符合设计要求的重组质粒。重组质粒命名为pUCK。

3、空克隆载体的转化验证。将测序完全正确的重组质粒pUCK转化入DH5a，过夜培养。整个平板均长蓝斑，详见图1。证明构建的克隆载体pUCK是符合要求的。

4 插入目的片段验证筛选效果。以人基因组为模板，PCR得到一长为301bp的NCOR2基因片段，电泳回收，测序为SEQ ID NO.5。

SEQ ID NO.5    Human NCOR2部分序列301bp

ccgttggtcgttggtgtttcacaaatgtgctcagctccctgcctctgcccttgacggttgaggttttccattagtctttaatcacttagtgtctgtcaggcacttggagtgcttggaggtcatgggcagcccggagagtgggcgaaggctgtggggaggacggggtgggggaggccccctgggggagggctgagcttcccctctgctcctggtctctgaaaaaaggagcagggtttgaatcgtgcttccatttgttaagaacttgagtgaagcctctgaccttctggccttggtttcttga

设计如下两条引物：

P6    CCGTTGGTCGTTGGTGTTTCAC（SEQ ID NO.11）

P7    TCAAGAAACCAAGGCCAGAAG（SEQ ID NO.12）

以人基因组为模板，用上游引物P6和下游引物P7引物扩增301bp片段。

PCR反应体系：

反应程序：

1.95℃（预变性）3min;

2.94℃（变性）20s

3.57℃（退火）20s

4.72℃（延伸）40s

2-4进行35个循环

5.72℃（延伸）10min

将以上获得的目的基因按照以下体系克隆到pUCK中：

(所有试剂均为生工生物产品)

22℃连接1小时，转化，LB平板上37℃过夜培养。

将平板拍照，查看，明显可以看到有绝大部分菌落呈白色，证明目的基因已经插入到了载体中。而少部分菌落是蓝色，详情请见图2。

实施例2应用比较1

以猪cDNA为模板，PCR目的基因Sus EGF部分片段255bp,得到片段的序列为SEQ ID NO.4.用于蛋白表达。

SEQ ID NO.4           Sus EGF部分序列255bp

TCTGTGAGAAATAGTTACTCTGAATGCCCGCCGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGGTGGTGTGTGTATGTATATTGAAGCCGTCGACAGCTATGCCTGCAACTGTGTTTTTGGCTACGTTGGCGAGCGATGTCAGCACAGAGACTTGAAATGGTGGGAGCTGCGCCACGCTGGCCTCGGGCGACAGTGGAACGTCACGGTGGTGGCCGTCTGCGTGGTGGTGCTGGTCCTGCTGCTGCTCCTGGGGCTGTGG

设计如下两条引物：

P8TCTGTGAGAAATAGTTACTCTGA（SEQ ID NO.13）

P9CCACAGCCCCAGGAGCAGCAGC（SEQ ID NO.14）

以猪cDNA为模板，用上游引物P8和下游引物P9引物扩增255bp片段。

PCR反应体系：

反应程序：

1.95℃（预变性）3min;

2.94℃（变性）20s

3.57℃（退火）20s

4.72℃（延伸）40s  ;

2-4进行35个循环

5.72℃（延伸）10min

比较例1：EGF大肠杆菌表达，选择pET28a+为载体，用NdeI和XhoI进行克隆。因此目的基因上下游要分别加上NdeI和XhoI.

作为中间克隆，倘若基因克隆到pUC57中，因为载体上没有XhoI，无法双酶切克隆，只能够用SmaI平端克隆。但是因为pUC57载体第183位有NdeI位点，将来正确的克隆要双酶切目的基因装到载体pET28a+中，就会出现把载体上的片段也酶切下来了，并且这个片段与目的片段大小一致，电泳无法分开，对后续的双酶切克隆带来严重影响。

倘若基因克隆到pMD18-T simple中。首先要对高保真酶扩增的PCR产物加A,增加了工作量和工作成本。并且实验的成功率直接取决于载体的质量。同样，该载体上仍然有NdeI位点，结果同上。

倘若使用实施例1构建的pUCK，因为这个载体上不存在任何常用的克隆位点，只需要SmaI平端克隆到该载体中。就保证了整个重组质粒中目的基因上设计的酶切位点的唯一性，绝不会出现酶切下来部分载体的片段而影响表达载体构建的后果。

实施例3应用比较2

以实施例2获得的Sus EGF部分片段255bp作为目的基因。

EGF酵母表达，选择pPIC9K为载体，用EcoRI和NotI进行克隆。因此目的基因上下游要分别加上EcoRI和NotI.

作为中间克隆，倘若基因克隆到pUC57中，因为载体上没有NotI，无法双酶切克隆，有两种方法解决，一种方法是平端克隆，因为载体上有EcoRI位点，会造成整个重组质粒中有两个EcoRI（载体上一个，目的基因上一个），影响后续酶切克隆的准确性。同时也可以在NotI外围增加一个载体pUC57上存在的位点，但是这有一定的风险，因为可能增加的位点刚好基因内部存在。比如克隆EGF时就不能增加SalI位点，因为EGF的第85位有SalI。

倘若基因克隆到pMD18-T simple中。首先要对高保真酶扩增的PCR产物加A,增加了工作量和工作成本。并且实验的成功率直接取决于载体的质量。

倘若使用载体pUCK，因为这个载体上不存在任何常用的克隆位点，只需要SmaI平端克隆到该载体中。就保证了整个重组质粒中目的基因上设计的酶切位点的唯一性，绝不会出现酶切不完全而带来的一切后果。

Claims (7)

1.一种改造的克隆载体，为环状克隆载体，为将pUC57载体的多克隆位点采用EcoRV、SmaI和StuI三个平端克隆位点替代，并去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点获得，所述改造的克隆载体仅有EcoRV、SmaI和StuI三个克隆位点。

2.如权利要求1所述改造的克隆载体，其特征在于，所述改造的克隆载体中，将pUC57载体中序列为SEQ ID NO.2的LacZ序列及其互补序列替换为序列为SEQ ID NO.3的LacZ序列及其互补序列。

3.如权利要求1所述改造的克隆载体，其特征在于，所述去掉pUC57载体中LacZ下游的NdeI酶切位点的方法为对NdeI酶切位点做同义突变。

4.如权利要求1所述改造的克隆载体，其特征在于，所述改造的克隆载体的全长序列为SEQ ID NO.1。

5.如权利要求1-4任一权利要求所述改造的克隆载体在基因工程领域的应用。

6.一种克隆载体的构建方法，包括下列步骤：

1）酶切：采用EcoRV、SmaI或StuI酶切权利要求1-4任一权利要求所述改造的克隆载体；

2）连接：在连接酶的作用下，酶切后的克隆载体与平端线性目的基因连接成环。

7.如权利要求6所述克隆载体的构建方法，其特征在于，所述酶切与连接在同一个体系中完成。

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