CN106244613B - 一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。本发明的表达宿主是一种进入稳定期后菌体就自降解的枯草芽孢杆菌。该枯草芽孢杆菌在培养至进入稳定期以后，能够促进细胞裂解的蛋白分子就会在稳定期启动子的促进下过量表达，从而使宿主快速裂解，达到释放胞内物质的目的。利用本发明表达宿主表达了绿色荧光蛋白基因(gfp)，通过发酵培养，与利用传统的枯草芽孢杆菌标的宿主相比，最终的菌体浓度降低至少63.2％，而胞外荧光蛋白含量提高至少78.8％～141.5％。

Description

一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由于具有生长速度快、发酵周期短、胞外分泌蛋白能力强等特点，正在为应用生物学发挥着重要的作用。同时作为研究透彻模式菌株又是被普遍认为是安全的(GRAS)，已广泛应用于食品和药品的研究和生产中。
但是，利用枯草芽孢杆菌过量表达某些酶分子和合成一些胞内代谢产物时，往往会出现这些产物本身性质的原因不能够大量的分泌到细胞外，而枯草芽孢杆菌由于其革兰氏阳性菌的特质，胞外具有很厚的肽聚糖层，破碎过程费时费力，且容易造成目标产物变性。因此，一种能够自降解的表达宿主对于生产胞内蛋白或分泌能力较差的产物具有很大的应用价值。
发明内容
为了满足目前利用枯草芽孢杆菌在生产代谢产物和酶制剂等过程中需要在稳定期自发裂解并释放胞内目的物质的需求，本发明提供了一种稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主，并将其应用至蛋白分子的表达。
本发明的第一个目的是提供一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌载体，所述载体携带稳定期启动的启动子和由该启动子启动表达的自裂解蛋白的基因；所述编码自裂解蛋白的基因是由所述稳定期启动的启动子启动表达。
在本发明的一种实施方式中，所述稳定期启动子包括PmmgA、PsigW和PyqfD，其序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述菌体裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分别如SEQ ID NO.4～8所示。
在本发明的一种实施方式中，所述载体的出发载体为pAX01。
本发明的第二个目的是提供一种稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌携带所述载体，在细胞进入稳定期后会发生自降解，从而释放胞内目的产物。
本发明的第三个目的是提供所述稳定期自裂解的枯草芽孢杆菌的制备方法，是构建携带稳定期启动的启动子和裂解蛋白基因的整合载体，再重组到枯草芽孢杆菌基因组上；所述稳定期启动的启动子包括PmmgA、PsigW和PyqfD；编码所述菌体裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG。在一般培养条件下，菌体生长进入稳定期以前，该宿主中具有裂解细胞活性的蛋白不会表达。但进入稳定期后，在稳定期启动子的作用下开始表达，从而使细胞裂解。利用稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主对外源基因进行质粒表达，验证了该表达系统的有效性。
在本发明的一种实施方式中，所述稳定期启动子包括PmmgA、PsigW和PyqfD，其序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述菌体裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分别如SEQ ID NO.4～8所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括：Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis131.1，Bacillus subtilis AG1839，Bacillus subtilis PY79，Bacillus subtilis BAB-1，Bacillus subtilisXF-1。
在本发明的一种实施方式中，所述整合载体的出发载体为pAX01。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：
1.构建携带稳定期启动子和自裂解蛋白基因的整合质粒：以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR获得稳定期启动子和自裂解蛋白的编码基因的DNA片段，通过酶切连接的方式插入到整合载体上，通过转化入相应的宿主，获得携带稳定期启动子和编码自裂解蛋白的基因的整合质粒。
2.稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主的获得：将携带有稳定期启动子和编码自裂解蛋白基因的整合质粒转化至不含有整合质粒所携带抗性基因的宿主枯草芽孢杆菌中，在相应的抗性条件下筛选，获得稳定期自裂解枯草芽孢杆菌。
该表达宿主的有效性的验证是以改造前的枯草芽孢杆菌作为表达宿主为对照的，通过与对照比较基因表达情况来验证有效性。
步骤1中携带有稳定期启动子和裂解基因的整合质粒的具体构建方法如下：
(1)稳定期启动子和自裂解蛋白的编码基因的DNA片段的获得：以Bacillussubtilis 168(Bacillus subtilis 168，获取自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心)基因组模板，PCR扩增Bacillus subtilis 168基因组上PmmgA、PsigW和PyqfD三个稳定期启动子DNA片段，以及skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG五个自裂解蛋白编码基因的DNA片段。
(2)整合质粒的构建：将PmmgA、PsigW和PyqfD启动子DNA片段和skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG五个基因的DNA片段通过双酶切后，分别与相同酶切处理过的pAX01质粒进行连接，再转入Escherichia coli JM109中，通过氨苄青霉素平板筛选和质粒测序验证，分别得到携带有稳定期启动子和裂解基因的整合质粒；具体为携带PmmgA的质粒pPMMGA-skfA、pPMMGA-sdpC、pPMMGA-xpf、pPMMGA-lytC和pPMMG-bsrG，携带PsigW的质粒pPSIGW-skfA、pPSIGW-sdpC、pPSIGW-xpf、pPSIGW-lytC和pPSIGW-bsrG，和携带PyqfD的质粒pPYQFD-skfA、pPYQFD-sdpC、pPYQFD-xpf、pPYQFD-lytC和pPYQFD-bsrG。
步骤2中稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主的获得的具体方法如下：
将上述15个整合质粒分别通过化学转化法转化进入枯草芽孢杆菌中，通过在红霉素平板上筛选，然后通过PCR的方法进行验证，得到15株稳定期自裂解枯草芽孢杆菌表达宿主，分别命名为B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC、B.subtilis YBG。
该表达宿主有效性的验证，可以选用各种外源基因进行表达验证，以荧光蛋白为例，验证方法如下：
(1)表达质粒的构建：PCR扩增gfp基因片段，连接到pP43质粒上，构成新的质粒pP43-gfp并转入到Bacillus subtilis 168、B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC和B.subtilis YBG中。
(2)筛选含有Bacillus subtilis 168(pP43-gfp)，B.subtilis MSA(pP43-gfp)、B.subtilis MSC(pP43-gfp)、B.subtilis MXF(pP43-gfp)、B.subtilis MLC(pP43-gfp)、B.subtilis MBG(pP43-gfp)、B.subtilis SSA(pP43-gfp)、B.subtilis SSC(pP43-gfp)、B.subtilis SXF(pP43-gfp)、B.subtilis SLC(pP43-gfp)、B.subtilis SBG(pP43-gfp)、B.subtilisYSA(pP43-gfp)、B.subtilisYSC(pP43-gfp)、B.subtilisYXF(pP43-gfp)、B.subtilis YLC(pP43-gfp)和B.subtilis YBG(pP43-gfp)。
(3)酶活比较：将16株菌在发酵培养基中发酵培养，测定菌体浓度和荧光蛋白含量，比较菌体量和酶活荧光大小。B.subtilis MSA(pP43-gfp)、B.subtilis MSC(pP43-gfp)、B.subtilis MXF(pP43-gfp)、B.subtilis MLC(pP43-gfp)、B.subtilis MBG(pP43-gfp)、B.subtilis SSA(pP43-gfp)、B.subtilis SSC(pP43-gfp)、B.subtilis SXF(pP43-gfp)、B.subtilis SLC(pP43-gfp)、B.subtilis SBG(pP43-gfp)、B.subtilisYSA(pP43-gfp)、B.subtilisYSC(pP43-gfp)、B.subtilisYXF(pP43-gfp)、B.subtilis YLC(pP43-gfp)和B.subtilis YBG(pP43-gfp)中菌体在进入稳定期后裂解加快，且胞外荧光蛋白含量显著增加，说明该表达宿主有效。
本发明的第四个目的是提供一种枯草芽孢杆菌稳定期自裂解的方法，是将所述的枯草芽孢杆菌培养至稳定期，使其自裂解。
本发明的第五个目的是提供所述枯草芽孢杆菌在蛋白合成和代谢产物生产方面的应用。所述应用包括：生产不易分泌至胞外的酶类和代谢产物，生产不宜使用机械破碎或温度敏感的胞内蛋白。
有益效果：本发明首次筛选获得了枯草芽孢杆菌稳定期启动的启动子PmmgA、PsigW和PyqfD，并将其用于构建枯草芽孢杆菌稳定期自裂解表达宿主，可以使枯草芽孢杆菌在进入稳定期以后，菌体发生自裂解，从而达到释放胞内蛋白和代谢产物的目的。实验表明，本发明的B.subtilisMSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilisMBG、B.subtilis SSA、B.subtilisSSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilisSBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC和B.subtilis YBG枯草芽孢杆菌宿主表达荧光蛋白基因(gfp)的效果与传统表达宿主B.subtilis 168相比，胞外荧光蛋白含量分别提高了89.3％、85.6％、102.3％、120.3％、139.5％、125.7％、132.4％、78.8％、104.6％、98.4％、99.8％、103.6％、123.5％、128.7％、141.5％。
具体实施方式
具体实施方式中涉及的引物序列如表1所示。
表1引物列表
菌株的培养条件：
种子培养基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。
发酵培养基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠，。
培养条件：种子培养12h，37℃，220rpm，发酵培养24h，接种量5％，37℃，220rpm。菌株培养过程中添加相应浓度的抗生素以维持其质粒稳定性。
荧光强度测定方法：
将发酵液离心10min(10000×g，4℃)，吸取上清液200μL用NUNC96孔黑色酶标板进行荧光检测，检测时做4个复孔，所用仪器为BioTek Synergy4多功能酶标仪，操作软件为Gen5。荧光强度参数设置为，激发：488/9nm发射：509/9nm，顶端发光，氚气灯，增益为自动调整增益。
实施例1整合载体构建
以Bacillus subtilis 168基因组模板，#1和#2为引物，通过PCR扩增PmmgA启动子(如SEQID NO.1所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因组模板，#3和#4为引物，通过PCR扩增PsigW启动子(如SEQ ID NO.2所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因组模板，#5和#6为引物，通过PCR扩增PyqfD启动子(如SEQ ID NO.3所示)DNA片段；以Bacillussubtilis 168基因组模板，#7和#8为引物，通过PCR扩增Bacillus subtilis168skfA基因(如SEQ ID NO.4所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因组模板，#9和#10为引物，通过PCR扩增sdpC基因(如SEQ ID NO.5所示)DNA片段；以Bacillus subtilis168基因组模板，#11和#12为引物，通过PCR扩增xpf基因(如SEQ ID NO.6所示)DNA片段；以Bacillussubtilis 168基因组模板，#13和#14为引物，通过PCR扩增lytC基因(如SEQ IDNO.7所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因组模板，#15和#16为引物，通过PCR扩增bsrG基因(如SEQ ID NO.8所示)DNA片段反应条件：预变性98℃3min；变性98℃10s；延伸68℃30s；共34cycles；后延伸5min。将上述PCR获得三个启动子的DNA片段分别通过BamHI和kpnI双酶切处理，5个基因的DNA片段分别用kpnI和XhoI处理，回收后通过DNA连接酶与BamHI和XhoI酶切处理的pAX01(如SEQ ID NO.25所示)相连。转化至EscherichiacoliJM109后，提取质粒，经测序验证正确，分别命名为pPMMGA-skfA、pPMMGA-sdpC、pPMMGA-xpf、pPMMGA-lytC、pPMMG-bsrG、pPSIGW-skfA、pPSIGW-sdpC、pPSIGW-xpf、pPSIGW-lytC、pPSIGW-bsrG、pPYQFD-skfA、pPYQFD-sdpC、pPYQFD-xpf、pPYQFD-lytC和pPYQFD-bsrG。
实施例2利用枯草芽孢杆菌对数期表达系统表达荧光蛋白
以质粒pMD-19T simple-gfp为模板，#17和#18为引物，克隆gfp荧光蛋白基因(如SEQID NO.29所示)，前端添XhoI酶切位点和RBS，后端添加PstI酶切位点。利用XhoI和PstI酶切获得的PCR产物，连接到相同酶处理过的pP43(序列如SEQ ID NO.28所示)上，构成新的质粒pP43-gfp。
将10μL的浓度为100μg/mL的pP43-gfp质粒分别加入到500μL的Bacillussubtilis 168、B.subtilis MSA(pP43-gfp)、B.subtilis MSC(pP43-gfp)、B.subtilis MXF(pP43-gfp)、B.subtilisMLC(pP43-gfp)、B.subtilis MBG(pP43-gfp)、B.subtilis SSA(pP43-gfp)、B.subtilis SSC(pP43-gfp)、B.subtilis SXF(pP43-gfp)、B.subtilis SLC(pP43-gfp)、B.subtilis SBG(pP43-gfp)、B.subtilisYSA(pP43-gfp)、B.subtilisYSC(pP43-gfp)、B.subtilisYXF(pP43-gfp)、B.subtilis YLC(pP43-gfp)和B.subtilis YBG(pP43-gfp)的感受态细胞中，45℃热激3min，37℃摇床220rpm后培养1h，涂布于含有卡纳抗生素的LB平板上，37℃培养10h，将长出的菌落进行菌落PCR验证。
将上一步得到的16种菌进行培养，通过每2h取样测定荧光强度和菌体浓度，结果现示，B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilisMBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilisSBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC和B.subtilis YBG的发酵上清的荧光强度在进入稳定期后明显增强，且菌体裂解迅速。与对照B.subtilis168(pP43-gfp)相比，最终的菌体浓度分别降低了65.2％、63.2％、73.5％、83.2％、76.3％、80.9％、57.8％、73.5％、67.4％、71.9％、68.5％、69.4％、72.6％、75.8％和85.2％，而胞外荧光蛋白含量分别提高了89.3％、85.6％、102.3％、120.3％、139.5％、125.7％、132.4％、78.8％、104.6％、98.4％、99.8％、103.6％、123.5％、128.7％、141.5％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种枯草芽孢杆菌载体，其特征在于，携带稳定期启动的启动子和编码自裂解蛋白的基因；所述编码自裂解蛋白的基因是由所述稳定期启动的启动子启动表达；所述稳定期启动子分别是PmmgA、PsigW和PyqfD，其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，和SEQ ID NO.3所示；所述编码自裂解蛋白的基因分别是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分别如SEQID NO.4～8所示；所述载体的出发载体为pAX01。
2.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，携带稳定期自裂解的载体，所述稳定期自裂解的载体如权利要求1所述。
3.权利要求2所述枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，构建携带稳定期启动的启动子和裂解蛋白基因的整合载体，再重组到枯草芽孢杆菌基因组上；所述稳定期启动的启动子分别是PmmgA、PsigW和PyqfD；所述编码自裂解蛋白的基因分别是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG；所述整合载体的出发载体为pAX01。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括：Bacillussubtilis 168，Bacillus subtilis 131.1，Bacillus subtilis AG1839，Bacillussubtilis PY79，Bacillus subtilis BAB-1，Bacillus subtilis XF-1。
5.一种枯草芽孢杆菌稳定期自裂解的方法，其特征在于，向枯草芽孢杆菌中导入携带编码稳定期表达的自裂解蛋白的基因的载体，培养至稳定期，使其自裂解；所述稳定期启动子分别是PmmgA、PsigW和PyqfD，其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，和SEQ ID NO.3所示；所述编码自裂解蛋白的基因分别是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分别如SEQ IDNO.4～8所示；所述载体的出发载体为pAX01。
6.权利要求2所述枯草芽孢杆菌在蛋白合成和代谢产物生产方面的应用。
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