CN114231524A - 一种体外制备环状dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外制备环状DNA的方法。所述方法先根据目的线性DNA片段，设计Gibson组装连接片段，同时引入限制性内切酶Bsa Ⅰ的识别位点序列，然后将目的线性DNA片段和Gibson组装连接片段混合，进行Gibson组装，再以Gibson组装产物为模板，进行滚环扩增，纯化得到RCA产物，之后对纯化的RCA产物进行Bsa Ⅰ酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收与目的线性DNA片段大小一致的酶切条带，最后将酶切产物利用T4 DNA连接酶进行环化并纯化得到目的线性DNA片段的环化产物。本发明方法能够替代传统质粒，除必需元件外，仅额外引入长度为11个碱基的内切酶识别序列，将环状DNA分子量降到最低的同时降低生物安全风险，实现体外环化线性DNA片段。
Description
技术领域
本发明属于DNA合成技术领域，涉及一种体外制备环状DNA的方法。
背景技术
质粒作为一种分子生物学工具，广泛用于基因表达、RNA转录、基因调控等领域。在质粒的应用过程中，涉及质粒构建、大肠杆菌感受态细胞转化实验、酵母细胞转化实验、动物细胞转染实验等。在真核细胞转染实验中，效率尤为关键。质粒进入真核细胞的效率直接决定了实验效果是否满足需求。真核细胞转染效率与多个因素有关，其中质粒的大小是关键因素之一，同等条件下较小的质粒更容易转染进入细胞。因此，在保留必需功能元件前提下，减小质粒的大小可以提高转染效率。
近年来，生物安全越发受到社会关注，在生命科学研究领域，生物安全问题需要着重考量。由于质粒构建过程需要借助原核生物大肠杆菌，这就导致质粒本身除了目的元件外，尚存在大量原核生物相关元件，这些原核生物相关元件对于真核细胞而言，一方面是冗余序列，增加了质粒大小，降低转染效率；另一方面是外源序列，是威胁生物安全的外源因素。
现有两种较成熟的技术可一定程度上解决上述问题。第一种是利用重组技术实现环状DNA(mcDNA)的制备，此技术在大肠杆菌体内，借助重组酶实现线性DNA片段的环化，同时冗余DNA序列被降解。第二种是利用聚合酶链式反应(PCR)技术对线性DNA片段大量扩增，扩增产物进行体外环化，得到线性DNA片段的环化产物。然而上述方法仍存在一定的缺陷，利用重组技术制备环状DNA，依然是在大肠杆菌细胞内进行的，且冗余序列的降解过程是有一定效率的，有不完全降解的可能，造成污染；利用PCR技术制备环状DNA，实现了体外制备，却需要进行96组PCR，过程复杂，成本较高。
参考文献：
1.Vítor Gaspar,Melo-Diogo D D,Costa E,et al.Minicircle DNA vectorsfor gene therapy:advances and applications[J].Expert Opinion on BiologicalTherapy,2015.
2.Cheng C,Tang N,Li J,et al.Bacteria-free minicircle DNA system togenerate integration-free CAR-T cells[J].Journal of Medical Genetics,2018.
发明内容
针对体外制备环状DNA方法中存在的残留污染和过程复杂、高成本的问题，本发明提供一种体外制备环状DNA的方法。
本发明的技术方案如下：
一种体外制备环状DNA的方法，包括以下步骤：
步骤1，根据目的线性DNA片段，设计Gibson组装(Gibson Assembly)连接片段，同时引入限制性内切酶BsaⅠ的识别位点序列，所述的Gibson组装连接片段按照“目的DNA上游25bp+BsaⅠ的识别位点序列+目的DNA下游25bp”设计，反向互补序列一并设计，所述的BsaⅠ识别位点为：
5’GGTCTCNNNNN 3’，
5’CCAGAGNNNNN3’，其中N代表碱基A、T、C、G中任意一个，且N不必相同；
步骤2，合成Gibson组装连接片段；
步骤3，按照目的线性DNA片段和Gibson组装连接片段的摩尔比为1：3进行混合，进行Gibson组装，回收产物；
步骤4，以Gibson组装产物为模板，进行滚环扩增(RCA)，纯化得到RCA产物；
步骤5，对纯化的RCA产物进行BsaⅠ酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收与目的线性DNA片段大小一致的酶切条带；
步骤6，将上述酶切产物利用T4 DNA连接酶进行环化，纯化，去除未环化的线性DNA片段，得到目的线性DNA片段的环化产物。
在本发明具体实施方式中，步骤1中，选取20个组合作为NNNNN：
CACAT，CTGAG，TACAC，CGCCT，ACCCG，ACACA，CAGAA，ACCGT，ACCCA，TGCCG，TTTTA，CCAGA，CACCC，GTGGG，AGGTG，CCAAA，ATTGG，CTGAG，GACGG，GAATA。
在本发明具体实施方式中，步骤4中，采用滚环复制酶phi29进行滚环扩增。
在本发明具体实施方式中，步骤4中，所述的RCA产物采用乙醇沉淀的方法纯化，具体为：在RCA反应液中加入3倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L、pH5.2的乙酸钠溶液，-20℃静止30min，剧烈震荡，然后在4℃、12000r/min下离心10min，去除上清液，风干，加入无菌水溶解。
在本发明具体实施方式中，步骤6中，利用T5外切酶(Exonuclease)进行纯化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)避开体内过程，实现体外环化线性DNA片段；(2)体外制备环状DNA的过程简单，可操作性强；(3)替代传统质粒，除必需元件外，仅额外引入长度为11个碱基的内切酶识别序列，将环状DNA分子量降到最低，同时降低生物安全风险。
附图说明
图1为CMV-GFP RCA产物琼脂糖凝胶电泳结果图。
图2为CMV-GFP RCA产物经BsaⅠ酶切后产物琼脂糖凝胶电泳结果图。
图3为CMV-GFP RCA产物经BsaⅠ酶切后的线性片段，环化后与环化前琼脂糖凝胶电泳结果图。
图4为minicircle CMV-GFP细胞转染实验结果图，NC，阴性对照；细胞，HEK293A；标尺，50μm。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
1、选取绿色荧光蛋白(GFP)基因及其启动子(CMV)作为目的线性DNA片段。
2、根据CMV-GFP序列信息，按照“目的DNA上游25bp+BsaⅠ的识别位点序列+目的DNA下游25bp”设计Gibson组装连接片段，BsaⅠ的识别位点序列采用20个随机组合序列，20个组合分别为：cacat，ctgag，tacac，cgcct，acccg，acaca，cagaa，accgt，accca，tgccg，tttta，ccaga，caccc，gtggg，aggtg，ccaaa，attgg，ctgag，gacgg，gaata。设计的Gibson组装连接片段如下：
3、Gibson组装连接片段合成，用无菌水稀释至10μmol/L，正向F和反向R片段各取10μL混合均匀，于PCR仪器上按照以下程序退火形成双链片段：95℃，10min；85℃，1min；75℃，1min；65℃，1min；55℃，1min；45℃，1min；35℃，1min；25℃，1min。退火结束后，20组片段混合均匀。
4、根据CMV-GFP线性片段、Gibson组装连接片段的质量与摩尔数的关系，计算得到CMV-GFP线性片段、Gibson组装连接片段的摩尔数，并按照目的线性DNA片段:Gibson组装连接片段＝1:3的摩尔数比例将两者混合。
5、按照Gibson组装试剂(NEB Gibson Assembly Cloning Kit)说明书，配置Gibson组装体系，CMV-GFP线性片段、Gibson组装片段、Gibson试剂混合均匀，50℃水浴60min。试剂盒(Zymoclean Gel DNA Recovery Kits)回收组装产物。
6、根据滚环复制酶phi29(Thermo Scientific phi29 DNA Polymerase)的使用说明书，取上述Gibson组装产物1ng为模板，使用随机引物，配置滚环扩增(RCA)反应体系，每个反应体系20μL，共计16组。RCA扩增条件为：30℃，4h；65℃，10min。RCA扩增产物取1μL进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增是否成功。
7、RCA产物用乙醇沉淀的方法纯化：RCA反应液中加入3倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)，-20℃静止30min，剧烈震荡后可见DNA絮状产物。4℃，12000r/min离心10min，去除上清，开口风干数分钟，20μL无菌水溶解。
8、纯化的RCA产物进行BsaⅠ酶切。酶量按照每1μg DNA加入1U BsaⅠ，酶切条件为37℃、5h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，此时出现与CMV-GFP线性片段大小一致的酶切条带，将此条带切胶回收。
9、上述酶切产物利用T4 DNA连接酶(NEB T4 DNA Ligase)进行环化。环化条件为16℃、3h，产物使用试剂盒进行纯化。
10、将上述环化产物利用T5外切酶(NEB T5 Exonuclease)进行纯化，反应条件为37℃、30min，目的是去除未环化的线性DNA片段。试剂盒纯化产物，即得到CMV-GFP的环化产物(minicircle CMV-GFP)。琼脂糖凝胶电泳结果显示，环化产物出现了三条带，指示出现超螺旋高级结构，这与传统环状质粒的超螺旋结构特征相符。
11、为确认minicircle CMV-GFP是否有正常的功能，需进行细胞验证实验。培养HEK293A细胞(源自本实验室储存)于24孔细胞培养板(CORNING)中，培养基采用含10％胎牛血清(gibco)的高糖培养基(DMEM gibco)，待细胞长至布满底面50％-60％时，进行转染实验。
12、使用脂质体(Invitrogen Lipofectamin 3000Transfection Reagent)转染方法进行转染实验。实验组：minicircle CMV-GFP 500ng；对照组：上述RCA经BsaⅠ酶切产物500ng；空白对照组。
13、转染48h后，观察GFP表达情况。GFP表达情况显示，与BsaⅠ酶切线性DNA相比，minicircle CMV-GFP表达显著增强，具有传统质粒的功能，环化过程成功。
图1为CMV-GFP RCA产物琼脂糖凝胶电泳结果，显示15000bp处有明亮主带，结果阳性。图2为CMV-GFP RCA产物经BsaⅠ酶切后产物琼脂糖凝胶电泳结果，显示单一主带，与设计相符。图3为CMV-GFP RCA产物经BsaⅠ酶切后的线性片段，环化后与环化前琼脂糖凝胶电泳结果，显示环化后出现该机结构，证明环化成功。图4为minicircle CMV-GFP细胞转染实验结果，NC，阴性对照；细胞，HEK293A；标尺，50μm。环化DNA转染细胞后绿色荧光表达正常，与线性DNA以及NC作比较，证明环化DNA实验成功。
序列表
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ggccgcctcc ccgcctggaa ttctaacggt gagaccatcg ataagcttgg gagttccgcg 60
t 61
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acgcggaact cccaagctta tcgatggtct cacccataga attccaggcg gggaggcggc 60
c 61
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acgcggaact cccaagctta tcgatggtct ctgccgtaga attccaggcg gggaggcggc 60
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ggccgcctcc ccgcctggaa ttctatctgg gagaccatcg ataagcttgg gagttccgcg 60
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ggccgcctcc ccgcctggaa ttctagggtg gagaccatcg ataagcttgg gagttccgcg 60
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ggccgcctcc ccgcctggaa ttctacccac gagaccatcg ataagcttgg gagttccgcg 60
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ggccgcctcc ccgcctggaa ttctacacct gagaccatcg ataagcttgg gagttccgcg 60
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t 61
Claims (5)
1.一种体外制备环状DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，根据目的线性DNA片段，设计Gibson组装连接片段，同时引入限制性内切酶BsaⅠ的识别位点序列，所述的Gibson组装连接片段按照“目的DNA上游25bp+BsaⅠ的识别位点序列+目的DNA下游25bp”设计，反向互补序列一并设计，所述的BsaⅠ识别位点为：
5’GGTCTCNNNNN3’，
5’CCAGAGNNNNN3’，其中N代表碱基A、T、C、G中任意一个，且N不必相同；
步骤2，合成Gibson组装连接片段；
步骤3，按照目的线性DNA片段和Gibson组装连接片段的摩尔比为1：3进行混合，进行Gibson组装，回收产物；
步骤4，以Gibson组装产物为模板，进行滚环扩增，纯化得到RCA产物；
步骤5，对纯化的RCA产物进行BsaⅠ酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收与目的线性DNA片段大小一致的酶切条带；
步骤6，将上述酶切产物利用T4 DNA连接酶进行环化，纯化，去除未环化的线性DNA片段，得到目的线性DNA片段的环化产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，选取20个组合作为NNNNN：
CACAT，CTGAG，TACAC，CGCCT，ACCCG，ACACA，CAGAA，ACCGT，ACCCA，TGCCG，TTTTA，CCAGA，CACCC，GTGGG，AGGTG，CCAAA，ATTGG，CTGAG，GACGG，GAATA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，采用滚环复制酶phi29进行滚环扩增。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述的RCA产物采用乙醇沉淀的方法纯化，具体为：在RCA反应液中加入3倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L、pH5.2的乙酸钠溶液，-20℃静止30min，剧烈震荡，然后在4℃、12000r/min下离心10min，去除上清液，风干，加入无菌水溶解。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6中，利用T5外切酶进行纯化。
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