JP2013539969A

JP2013539969A - カリシウイルスのｒｎａポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動されるｒｎａ重合

Info

Publication number: JP2013539969A
Application number: JP2013528721A
Authority: JP
Inventors: ジャック・ロハイエム
Original assignee: リボックス・ゲーエムベーハー
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2013-10-31
Also published as: CN103119177A; US20130189742A1; EP2619318B1; EP2619318A1; WO2012038450A1

Abstract

本発明は、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型上に、相補的ＲＮＡ鎖を重合するための方法に関し、前記方法は、前記鋳型にハイブリダイズするプライマーの存在下または非存在下において、ＲＮＡ重合条件下で、カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼと前記鋳型とを含有する組成物を、有効量のマイクロ波エネルギーで照射する工程を含む。本発明のさらなる主題は、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の３’末端に、１個または複数個のリボヌクレオチドを転移するための方法に関し、前記方法は、ｒＡＴＰ、もしくはｒＧＴＰ、もしくはｒＵＴＰ、もしくはｒＣＴＰ、またはそれらの修飾もしくは標識された類似体の存在下において、カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼを含有する組成物を、有効量のマイクロ波エネルギーで照射する工程を含む。

Description

カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（以下では「ＲＮＡポリメラーゼ」と記載する）は、プライマーの存在下または非存在下において、ＲＮＡ鋳型上に、相補的ＲＮＡ鎖を重合することが知られている（特許文献１を参照されたい）。そのようなＲＮＡポリメラーゼを使用した際、通常の温度条件でのＲＮＡの典型的な増幅には、約２時間かかる。

特許文献２は、酵素によって触媒される高分子の修飾の、マイクロ波による加速を、包括的に特許請求しているが、実際には、制限酵素の場合における、マイクロ波によって支援される成功した反応しか示していない。

特許文献３は、マイクロ波によって支援されるＤＮＡのＰＣＲによる増幅を記載している。しかしながら、マイクロ波照射下における、ＤＮＡポリメラーゼによる成功したＤＮＡの重合を実際に示すデータは、全く提示されていない。

特に、ＰＣＲを使用するＤＮＡの増幅に関しては、増幅サイクル内の加熱（すなわち、変性）工程のみ（重合工程ではない）が、マイクロ波の適用に好適な工程であると報告されている。非特許文献１を参照されたい。

国際公開第２００７／１２３２９号公報米国特許第５，３５０，６８６号公報米国特許第７，５３７，９１７号公報

Fermer et al. (2003) European J. Pharm. Sci. 18, 129-132

本発明の基礎をなす技術的課題は、ポリヌクレオチド鋳型上におけるＲＮＡ重合の、改善された方法を提供することである。

上記の技術的課題に対する解決策は、本明細書に記載され、特許請求の範囲において特徴付けられるような、本発明の実施形態によって提供される。

特に、カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼを使用した際、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型（ＲＮＡ、ＤＮＡ、混合されたＲＮＡ／ＤＮＡ、またはそれらの混合物）上に相補的ＲＮＡ鎖を重合する複雑な反応が実行可能であり、マイクロ波照射によって著しく増強されるが、本発明につながる実験において研究された他のＲＮＡポリメラーゼを使用した際、前記反応は実行可能ではないことが、驚くべきことに見出された。

したがって、本発明は、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型上に、相補的ＲＮＡ鎖を重合するための方法に関し、前記方法は、前記鋳型にハイブリダイズするプライマーの存在下または非存在下において、ＲＮＡ重合条件下で、カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼと前記鋳型とを含有する組成物を、有効量のマイクロ波エネルギーで照射することを含む。

カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、共通して、以下の構造上の特質を有する（他のウイルス性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えばポリオウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＲＮＡポリメラーゼが、同様にそのような特質を有する。しかしながら、それらは、本発明の方法に適用可能でない。以下で記載される実施例を参照されたい）：カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、「右手立体構造（right hand conformation）」を有し、前記ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、以下の配列モチーフ：
ａ．ＸＸＤＹＳ（配列番号１）
ｂ．ＧＸＰＳＧ（配列番号２）
ｃ．ＹＧＤＤ（配列番号３）
ｄ．ＸＸＹＧＬ（配列番号４）
ｅ．ＸＸＸＸＦＬＸＲＸＸ（配列番号５）
の保存された配置を含む。ここで、各々の記号は以下の意味を有する：
Ｄ：アスパラギン酸
Ｙ：チロシン
Ｓ：セリン
Ｇ：グリシン
Ｐ：プロリン
Ｌ：ロイシン
Ｆ：フェニルアラニン
Ｒ：アルギニン
Ｘ：任意のアミノ酸。

本明細書で使用されるところのいわゆる「右手立体構造」は、前記ＲＮＡポリメラーゼの三次構造（立体構造）が、大抵の鋳型依存性ポリメラーゼにおいて観察されるのと同様に、指、掌および親指を有する右手のように折り畳まれることを意味する。

前記配列モチーフ「ＸＸＤＹＳ」（配列番号１）は、いわゆるＡ−モチーフである。前記Ａ−モチーフは、通常、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの間の区別に関与する。前記モチーフ「ＧＸＰＳＧ」（配列番号２）は、いわゆるＢ−モチーフである。前記Ｂ−モチーフは、カリシウイルス科のＲＮＡポリメラーゼの全ての代表物内において保存されている。前記モチーフ「ＹＧＤＤ」（Ｃ−モチーフ、配列番号３）は、前記酵素の活性部位を表す。このモチーフ、特に第一のアスパラギン酸残基（右記配列の下線部；ＹＧＤＤ）は、Ｍｇ^２＋／Ｍｎ^２＋依存性の触媒作用の際に、金属イオンの配位に重要な役割を果たす。前記モチーフ「ＸＸＹＧＬ」（配列番号４）は、いわゆるＤ−モチーフである。前記Ｄ−モチーフは、鋳型依存性ポリメラーゼの特質である。最後に、前記「ＸＸＸＸＦＬＸＲＸＸ」モチーフ（Ｅ−モチーフ、配列番号５）は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの特質であり、この特質が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、（専ら）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと区別する。

好ましくは、前記ＲＮＡポリメラーゼは、ヒトおよび／または非ヒトの病原性カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼである。特に好ましいものは、ノロウイルス、サポウイルス、ベシウイルスまたはラゴウイルスのＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ノロウイルス株ＨｕＣＶ／ＮＬ／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ７４１８１１）のＲＮＡポリメラーゼ、またはサポウイルス株ｐＪＧ−Ｓａｐ０１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ６９４１８４）のＲＮＡポリメラーゼ、またはベシウイルス株ＦＣＶ／Ｄｒｅｓｄｅｎ／２００６／ＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４２４８９２）のＲＮＡポリメラーゼ、またはラゴウイルス株ｐＪＧ−ＲＨＤＶ−ＤＤ０６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＦ３６３０３５．１）のＲＮＡポリメラーゼである。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、前記ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６（ノロウイルスのＲＮＡポリメラーゼ）、配列番号７（サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ）、配列番号８（ベシウイルスのＲＮＡポリメラーゼ）、または配列番号９（ラゴウイルスのＲＮＡポリメラーゼ）によるアミノ酸配列を含む（または、これを有する）タンパク質である。当業者は、容易に、例えば好適な発現ベクターおよび宿主生物を使用する組換え発現によって、そのようなＲＮＡポリメラーゼを調製することができる（特許文献１を参照されたい）。組換え発現後にＲＮＡポリメラーゼの精製を容易化するために、前記ＲＮＡポリメラーゼは、対応する配列のＮ末端またはＣ末端において好適なタグ（例えば、ＧＳＴタグまたは（Ｈｉｓ）_６タグ）と共に発現されることが好ましい。例えば、ヒスチジンタグは、既知の様式のニッケルカラムまたはコバルトカラムに対するアフィニティクロマトグラフィによる、前記タンパク質の精製を可能とする。ヒスチジンタグと融合させたＲＮＡポリメラーゼの実施形態の例は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４によるアミノ酸配列を含む（または、これを有する）タンパク質である。配列番号１０は、ヒスチジンタグを有する、ノロウイルスのＲＮＡポリメラーゼに対応する。配列番号１１および配列番号１２は、ヒスチジンタグを有する、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対応する。配列番号１３は、ヒスチジンタグを有する、ベシウイルスのＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対応する。配列番号１４は、ヒスチジンタグを有する、ラゴウイルスのＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対応する。

上で規定されるカリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、リボヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖（すなわち、前記ポリヌクレオチド鋳型が、ＲＮＡからなる、またはＲＮＡを含む）、またはデオキシリボヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖（すなわち、前記ポリヌクレオチド鋳型が、ＤＮＡからなる、またはＤＮＡを含む）上に、相補的ＲＮＡ鎖を合成することが可能である。したがって、前記ポリヌクレオチド鋳型は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖の混合されたＤＮＡ／ＲＮＡ、またはそのような種の混合物であり得る。前記ポリヌクレオチド鋳型が、ＤＮＡを含む、またはＤＮＡからなる場合、マイクロ波による照射は、修飾されたＧＴＰ、好ましくは２’修飾されたＧＴＰ、例えば２’−フルオロ−ＧＴＰ、またはα−チオ−ＧＴＰの存在下において、実施しなければならない。前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡの部分的な配列に相補的な配列を有するプライマーの伸長と、プライマーの非存在下における相補鎖の新規合成との両方によって、一本鎖ポリヌクレオチド上に、相補的ＲＮＡ鎖を合成する。しかしながら、デオキシリボヌクレオチドを含有する前記ポリヌクレオチド鋳型が、その３’末端のデオキシリボヌクレオチド（すなわち、一本鎖の鋳型の３’末端における最後のヌクレオチド）であって、デオキシ−Ｃヌクレオチドではないものを有する（すなわち、その３’末端にデオキシ−Ｔヌクレオチド、デオキシ−Ａヌクレオチドまたはデオキシ−Ｇヌクレオチドを有する）場合、本発明において有用なカリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、前記鋳型に相補的なＲＮＡ鎖の合成のために、前記鋳型にハイブリダイズするプライマーの存在を必要とする。本明細書中で規定されるようなポリヌクレオチド鋳型が、その３’末端において１個または複数個のデオキシリボヌクレオチドからなる、またはこれを含有する（すなわち、前記鋳型の３’末端がＤＮＡセグメントである、または、最後のヌクレオチドのみがデオキシリボヌクレオチドである）場合、プライマーの非存在下におけるＲＮＡ合成の新規の開始の効率を増大させるために、前記鋳型の３’末端における最後のデオキシリボヌクレオチドがｄＣであり、より好ましくは、前記鋳型の３’末端における少なくとも最後の２個、３個、４個または５個のデオキシリボヌクレオチドがｄＣヌクレオチドであることが好ましい。

ＲＮＡからなる鋳型、または３’末端の領域がリボヌクレオチドから構成される鋳型の場合、本発明のマイクロ波照射方法における重合は、前記鋳型がポリアデニル化、ポリグアニル化またはポリウリジル化されている場合、対応するプライマーの存在を必要とする。前記鋳型がポリシチジル化されている場合、前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成は、また、プライマーの非存在下においても、可能である。この実施形態では、上昇したｒＧＴＰレベル（すなわち、他の所要のｒＮＴＰと比較して、過剰の、例えば２×、３×、４×または５×等のＧＴＰ）が存在することが好ましい。

前記プライマーは、望ましい場合、または必要な場合、それぞれ、配列特異的な（ヘテロポリマーの）ＤＮＡプライマー、もしくはＲＮＡプライマー、もしくは混合されたＤＮＡ／ＲＮＡプライマーであっても良く、または、ランダムプライマー（ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、もしくは混合されたＤＮＡ／ＲＮＡ）であっても良く、または、ホモポリマーのプライマー、例えばオリゴ−ｄＴ−プライマーもしくはオリゴ−Ｕ−プライマーであっても良い。前記プライマーの長さは、本発明の方法を実施する上では重要でなく、通常、例えば約５から約２５ｎｔ、より好ましくは約１０から２０ｎｔ、最も好ましくは約１５から約２０ｎｔの長さを有するオリゴヌクレオチドプライマーが、特に有用である。前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼに関する特徴的な特質のさらなる詳細は、特許文献１に見出すことができる。他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＱβ型のレプリカーゼ等のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとは対照的に、前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ合成を開始させるために、前記ポリメラーゼに特異的な認識配列を有するプライマーを必要としない。したがって、本明細書で使用されるところの「プライマー」は、典型的には、特にＲＮＡポリメラーゼに関する、そのような認識配列を有しないプライマーである。さらに、前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、特異的なプロモーター配列が前記鋳型に存在することを必要としないという点で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等の通常のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと異なる。

前記一本鎖ポリヌクレオチド鋳型は、前記鋳型の３’末端において、少なくとも、デオキシリボヌクレオチドの配列セグメント、すなわち、少なくとも、ｓｓＤＮＡのセグメント、例えば、少なくとも、ＤＮＡのセグメントを、含んでいても良い。この文脈における「セグメント」は、少なくとも２個以上の連続したデオキシリボヌクレオチドを意味する。例えば、本発明に係るポリヌクレオチド鋳型は、その５’末端においてリボヌクレオチドで開始し、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の「中間」領域が続く一本鎖の分子であっても良く、（３’末端において）再びリボヌクレオチドで終了する。他の例は、５’−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’、または５’−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３’、またはＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列を有する任意の他のポリヌクレオチドの種である。本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチド鋳型のさらなる例は、主にｓｓＤＮＡの種であるが、５’末端および／または３’末端の一方または両方に、好ましくは３’末端に、１個から複数個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）のリボヌクレオチドを有するものを含む。代替的には、本発明によって使用される鋳型は、主にｓｓＲＮＡであるが、５’末端および／または３’末端の一方または両方に、好ましくは３’末端に、１個から複数個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）のデオキシリボヌクレオチドを有するものであり得る。勿論、本発明に係る一本鎖ポリヌクレオチド鋳型は、また、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡのみからなっていても良い。

既に言及されたように、３’末端にｄＡ残基、ｄＴ残基またはｄＧ残基を有する、本発明のポリヌクレオチド鋳型は、通常、前記ＲＮＡポリメラーゼによる相補的ＲＮＡ鎖の合成のために、プライマーを必要とする。しかしながら、３’末端にＣヌクレオチドを有しないようなポリヌクレオチド配列であっても、プライマーを必要とすることなく、本発明の方法によって、ＲＮＡへと効率的に転写することができる。特に、この場合、以下に限定されるものではないが、前記方法に、唯一のヌクレオチドとしてのｒＣＴＰの存在下において、前記ＲＮＡポリメラーゼが少なくとも１個のｒＣ（または、それ以上の、例えば２個、３個、４個もしくは５個のｒＣ）ヌクレオチドを前記鋳型の３’末端に付加するような条件下で、上で規定されるような、前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼと前記一本鎖ポリヌクレオチド鋳型とを含有する組成物を、効率的な量のマイクロ波エネルギーで照射する初期工程を付加しても良い。その後、そのようにして生成された、３’末端に１個または複数個のＣリボヌクレオチドを有する鋳型を、上で規定されるようなＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動されるＲＮＡ合成へと導入することができ、その結果、前記ＲＮＡポリメラーゼが相補的ＲＮＡ鎖を合成し、この工程は、プライマーの非存在下において実施することができる。しかしながら、また、この実施形態において、例えば、必要に応じて、前記ＲＮＡポリメラーゼによって生成すべきＲＮＡ鎖中に選択された配列を導入するために、または他の目的で、プライマーを使用しても良いことを理解すべきである。

前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性に鑑みて、本発明は、また、上で規定されるような一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の３’末端に、１個または複数個のリボヌクレオチドを転移するための方法を提供し、前記方法は、ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰもしくはｒＣＴＰ、またはそれらの修飾もしくは標識された類似体の存在下において、上で規定されるようなカリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼを含有する組成物を、効率的な量のマイクロ波エネルギーで照射する工程を含む。

本発明の方法の好ましい実施形態によれば、マイクロ波照射下で前記ＲＮＡポリメラーゼによって生成される二本鎖分子は、一本鎖へと分離され、ｓｓＲＮＡおよび前記鋳型をもたらす。この工程は、熱変性もしくは化学的変性によって、または酵素的に、例えば一本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドへと分離することが可能な酵素、例えばヘリカーゼによって、実施しても良い。しかしながら、本発明の特に好ましい実施形態によれば、本明細書中で規定されるような、マイクロ波照射下で前記ＲＮＡポリメラーゼによって生成される二本鎖ポリヌクレオチドのこの分離工程および他の分離工程は、同じ酵素、すなわち前記ＲＮＡポリメラーゼそれ自体によって実施され、この工程は、好ましくは、また、マイクロ波による照射下で実施される。この工程は、前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を有益に利用する。

上で概説されるように得られる一本鎖を、本明細書中で規定されるようなカリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼと共に、マイクロ波照射下で、および前記ＲＮＡポリメラーゼが前記一本鎖の各々に相補的なＲＮＡ鎖を合成するような条件下で、再び（または、さらに）インキュベートすることがさらに好ましい。ＲＮＡ合成の工程と鎖の分離の工程とを、１回または複数回、例えば約３から約４０回、好ましくは約５から約３０回、より好ましくは約１０から約２０回、繰り返すことができることが明らかである。さらに好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、最終的なＲＮＡ合成工程を含む。特に、鎖の分離とＲＮＡ合成とのサイクルの繰返しの場合、この方法は、たとえ元の鋳型がＤＮＡのセグメント（１個または複数個）を含有していた、またはＤＮＡからなるものであったとしても、ほぼ純粋なｄｓＲＮＡの生成をもたらす。

既に上で概説されたように、任意のさらなる、鎖の分離の工程を、熱変性もしくは化学的変性によって、または酵素的に、例えば一本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドへと分離することが可能な酵素、例えばヘリカーゼによって、実施しても良い。しかしながら、より好ましくは、また、前記さらなる鎖の分離の工程は、前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼによって実施される。したがって、複数から多数の鎖の分離の工程とＲＮＡ合成の工程とを含む、本発明に係る好ましい方法を、前記鋳型、カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼ、適当な緩衝液（以下を参照されたい）、およびｒＮＴＰ（すなわち、以下でさらに概説されるような、ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰおよびｒＧＴＰ、または修飾もしくは標識されたｒＮＴＰ）を含有する反応混合物の１回のマイクロ波照射のみを必要とする単一バッチ反応（特に、本明細書中で規定されるようなＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成のためにプライマーを必要としない鋳型を使用する場合）において、実施することができることが明らかである。

本発明によれば、「ＲＮＡ重合条件」という用語は、前記ＲＮＡポリメラーゼが鋳型鎖に相補的なＲＮＡ鎖を合成することを可能とする、緩衝液、塩および金属イオン（適用可能な場合）の条件に特に関連する条件を意味する。ＲＮＡポリメラーゼに関する適当な緩衝液、塩、金属イオン、還元剤（適用可能な場合）、および他の条件は、当業者に既知である。例えば特許文献１を参照されたい。したがって、前記ポリヌクレオチド鋳型は、典型的には、例えば、反応体積５０マイクロリットル当たり１マイクログラムから４マイクログラムの量で、使用される。リボヌクレオシド三リン酸（以下でさらに概説されるような、任意の修飾または標識されたリボヌクレオシド三リン酸（複数の場合もあり）を含む）の濃度は、好ましくは０．１マイクロモル／ｌから１マイクロモル／ｌまでの範囲であり、例えば０．４マイクロモル／ｌである。前記ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、例えば１マイクロモル／ｌから１０マイクロモル／ｌであっても良い。

典型的な緩衝液の条件は、１０から８０ｍＭ、より好ましくは２０から５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０から８．０）、１から５ｍＭ、例えば３ｍＭの酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マンガンまたは塩化マンガン、および１から５ｍＭの還元剤、例えばＤＴＴである。

典型的な停止溶液は、２から１０ｍＭ、好ましくは４から８ｍＭの酢酸アンモニウム、および５０から２００ｍＭ、例えば１５０ｍＭのＥＤＴＡを含有する。

前記一本鎖ポリヌクレオチド、例えばｓｓＲＮＡ鋳型の長さおよび起源は、一般的に重要ではない。前記鋳型は、天然のまたは人工的な配列を有していても良く、前記鋳型は、化学的に合成することができるか、または、真核生物起源、原核生物起源もしくはウイルス起源由来の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、バクミド等の多様な供給源、もしくはＲＮＡおよびＤＮＡの任意の他の供給源から得ることができる。二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡは、本発明の方法において鋳型として用いる前に、熱またはマイクロ波照射または化学的変性によって、それぞれｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡへと、分離する必要がある。

本発明の方法は、二本鎖ＲＮＡ生成物を提供するために、および／または前記ｓｓＲＮＡ鋳型を増幅するために、ＲＮＡ鋳型を利用するのに特に有用である。本発明の特に好ましい実施形態は、アンチセンス技術またはＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシング用途のための、また、マイクロＲＮＡによって駆動されるＲＮＡ干渉を抑制することを目的とする、マイクロＲＮＡまたは非コードＲＮＡの規定の配列に指向性を有するアンチセンス（アンタゴミア（antagomirs））のための、低分子ＲＮＡ分子の提供に関する。

そのような用途のために、本発明の方法において使用される前記鋳型（好ましくはＲＮＡ）は、典型的には、８から４５ヌクレオチド、例えば１５から３０ヌクレオチド、好ましくは２１から２８ヌクレオチド、より好ましくは２１から２３ヌクレオチドの長さを有する。後者の長さの分子は、ｓｉＲＮＡの用途に特に有用である。

前記ＲＮＡポリメラーゼが、マイクロ波照射下で、ＲＮＡ合成（ターミナルトランスフェラーゼ活性を含む）中に、（上で規定されるような、任意に存在する修飾されたＧＴＰ（例えば２’−フルオロ−ＧＴＰまたはα−チオ−ＧＴＰ）に加えて）修飾されたリボヌクレオチドを利用することが、さらに意図される。例えば、前記修飾は、前記ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖ＲＮＡ合成生成物を検出するための標識であっても良い。代替的に、また、標識化は、鎖の分離後に得られるｓｓＲＮＡ生成物の検出のために、実施しても良い。本発明において使用される標識は、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、放射性基（例えば、^３２Ｐ標識リボヌクレオチド）、および特異的結合対のパートナー、例えばビオチン化ｒＮＴＰを含む。

本発明のある特定の実施形態においては、少なくとも１個の、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性によって相補鎖中に組み込まれる修飾されたリボヌクレオチドが、リボース部分、リン酸部分および／または塩基部分に、化学的修飾（それらの１個または複数個）を有していても良い。特にＲＮＡ分解酵素に対する、増大した安定性を有する分子に関して、骨格部分、すなわちリボース部分および／またはリン酸部分における修飾が、特に好ましい。

本発明の方法の化学的に修飾されたＲＮＡ生成物は、好ましくは、非修飾のｓｓＲＮＡ類似体、または非修飾のｄｓＲＮＡ類似体と比較して、増大した安定性を有する。

リボースが修飾されたリボヌクレオチドの好ましい例は、２’−ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２またはＣＮから選択される基によって置換され、Ｒが、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロが、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、類似体である。本発明との関連では、「修飾されたリボヌクレオシド三リン酸」または「修飾されたリボヌクレオチド」という用語が、また、幾つかの例で「デオキシヌクレオチド」とも称され得る２’−デオキシ誘導体を含むことが明らかである。

２’位で修飾されたリボースを有する、そのようなリボヌクレオチド類似体の典型的な例は、５−アミノアリル−ウリジン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ウリジン、２’−アジド−２’−デオキシ−ウリジン、２’−フルオロ−２’−デオキシ−グアノシンおよび２’−Ｏ−メチル−５−メチル−ウリジンを含む。

所望の二本鎖の生成物中にリン酸骨格の修飾をもたらすリボヌクレオチドの例は、ホスホチオエート（phosphothioate）類似体である。

本発明によれば、少なくとも１個の修飾されたリボヌクレオチドは、また、塩基部分に化学的修飾を有する類似体から選択しても良い。そのような類似体の例は、６−アザ−ウリジン、８−アザ−アデノシン、５−ブロモ−ウリジン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ^６−メチル−アデノシン、５−メチル−シチジン、プソイド−ウリジンおよび４−チオ−ウリジンを含む。

上記のおよび他の化学的に修飾されたリボヌクレオシド三リン酸は、例えばSigma-Aldrich Chemie GmbH（Munich, Germany）またはTrilink technologies（USA）から、市販されている。

また、前記ポリヌクレオチド鋳型が、上で概説されるような、および／または当該技術分野においてさらに知られているような、１個または複数個の修飾または標識されたヌクレオチドを含有していても良いことを理解すべきである。

（例えば、上で記載されるような）低分子の鋳型は、通常、化学的合成によって調製される。前記一本鎖ポリヌクレオチド鋳型を提供するための他の方法は、酵素的操作、例えば、ＲＮＡの逆転写、およびＲＮＡ鎖のその後の分解、より高分子のｄｓＤＮＡ分子の制限酵素（複数の場合もあり）による切断、およびｓｓＤＮＡを形成するための熱変性または化学的変性によるその後の鎖の分離、全細胞ＲＮＡの調製、ｍＲＮＡの調製等を含む。

好ましい反応体積は、２０から２００マイクロリットルまで、好ましくは５０から１００マイクロリットルの範囲である。典型的には、上で概説されるような緩衝液の条件、および他の条件は、適当なストック溶液（通常、５×濃縮または１０×濃縮されている）を混合し、前記ＲＮＡポリメラーゼ、前記鋳型、および所望の最終反応体積まで再蒸留水または脱イオン水（好ましくは、使用前にＲＮＡｓｅおよび／またはＤＮＡｓｅを含まない状態としたもの）を添加することによってもたらされる。

「有効量のマイクロ波エネルギー」という用語は、カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼを使用する、一本鎖ポリヌクレオチド鋳型上への相補鎖のＲＮＡ重合のために、または一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端への、少なくとも１個のリボヌクレオチドの転移のために、それぞれ必要とされるマイクロ波エネルギーの量である。所与の鋳型に対するマイクロ波エネルギーの明確な量は、日常的な実験を使用して、当業者が決定することができ、特に、前記鋳型の種類および長さに依存する。本明細書で使用されるところの「マイクロ波エネルギー」、「マイクロ波照射」、または「マイクロ波による照射」、または単に「マイクロ波」という用語は、同義語として使用され、電磁スペクトルの電波領域と赤外領域との間に見出される、１から１００ギガヘルツの周波数に対応する、約０．３から３０ｃｍの波長を含む電磁スペクトルの部分に関する。生命体によって吸収される電磁エネルギーの量は、組織、細胞および生物学的分子の誘電特性によって決定される。

本発明の目的のためのマイクロ波エネルギーの産生は、重要ではなく、当該技術分野で既知の任意の手段によって行うことができる。例えば、本発明に係る反応組成物にマイクロ波放射線を適用するための好適な手段は、多数の供給業者から市販されており、大抵の生物学の研究室において標準設備の一部を日常的に形成する、電子レンジである。そのような電子レンジは、典型的には、約５００Ｗから約１０００Ｗまでの最大電力レベルを有する。最も小さな電子レンジでさえも、本発明において使用するために十分なレベルのマイクロ波照射をもたらし、したがって、出力が調節可能な電子レンジにおいて、より低い電力設定を使用することが好都合であろう。したがって、本明細書中に開示される本発明の方法の好ましい実施形態によれば、前記組成物は、約１５００ＭＨｚから約３５００ＭＨｚまでの周波数を有し、約５０から約１０００Ｗまでの電力を有するマイクロ波で照射される。

本発明の好ましい実施形態によれば、また、より低い電力設定が、より長い時間間隔にわたって、適用される電力を時間的に分散させるために、および、エネルギー取込みの局在化と分子の損傷の発生との可能性を最小化するために、使用される。特に好ましい実施形態では、マイクロ波の電力が、マイクロ波の電力が試料に適用されない「休止」間隔を伴う一連の間隔にわたって、試料に適用される。電力の適用の間隔、および休止の間隔は、通常、各々１から６０秒までの範囲であり、１５から６０秒までの電力の適用の間隔、および０．５から５秒までの休止の間隔が好ましい。最も好ましくは、電力は、１から２秒の休止の間隔によって隔てられる約４５秒の間隔で適用される。

しかしながら、特に前記一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の長さに応じて、照射工程を、１秒から５分、より好ましくは３秒から１２０秒の期間のマイクロ波エネルギーの単回適用（間隔）で、実施しても良い。長さがより短い鋳型（例えば、ｓｉＲＮＡ等の低分子ｄｓＲＮＡを調製するための鋳型）を利用する場合、後者の短い期間が、特に有用である。特に、ｓｓＲＮＡ鋳型からのｄｓＲＮＡの調製に関して、本明細書において記載されるような方法が、当該技術分野において既知のインキュベーション時間と比較して、実質的に短い反応時間を可能とすることが、本発明によって示されている。

前記カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼによって二本鎖ポリヌクレオチド生成物をもたらすためのマイクロ波照射の使用は、二本鎖ＲＮＡの調製との関連で、特に有益である。既に言及されたように、そのような反応は、これまでは、３０から４２℃で、より長いインキュベーション時間を使用して実施されており、二本鎖ＲＮＡ生成物を分離するために熱が使用され得る。しかしながら、そのような状況下では、そのようにして生成されたｄｓＲＮＡは、分解する傾向があり、その結果、所望の長さを有する純粋なｄｓＲＮＡの生成を達成することが困難なことが多い。

それとは対照的に、本発明に係るマイクロ波エネルギーの使用は、前記ＲＮＡポリメラーゼによる重合反応を促進し、その結果、ＲＮＡの分解の問題が回避される。

本発明の実施の好ましい様式では、装置の「電力」設定を最大未満で使用することに加えて、経時的に適用される電力を分散させるための上記の努力がなされるべきであることを理解すべきである。実際に、多くの市販の電子レンジは、６５０〜９００Ｗという一定のマグネトロン出力を維持し、１０％のデューティサイクルに相当する「１」の設定から９０％のデューティサイクルに相当する「９」の設定までマグネトロンのデューティサイクルを変化させることによって、適用される電力を変調させる。最も好ましくは、７００から８００Ｗの出力で、１から８までの設定、すなわち１０％から８０％までのマグネトロンのデューティサイクルが使用される。１間隔当たり約７０ワット秒から３５０００ワット秒まで、好ましくは３０００から３５００ワット秒までに相当する、その総計の出力のエネルギーが、上で記載されるような間隔または単一の間隔において適用される。

図面は以下を示す。

サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、プライマー非依存性の、ＲＮＡ合成の新規の開始、および二本鎖ＲＮＡの産生を実証する、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。レーン１：ＲＮＡ鋳型。レーン２：マイクロ波照射（８００Ｗ、６０秒間）後の、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼと鋳型との反応混合物は、２５ｂｐのｄｓＲＮＡマーカーと共に移動するバンドをもたらす。レーン３：Ｓ１ヌクレアーゼ処理後のレーン２の生成物。２５ｂｐの生成物は、Ｓ１ヌクレアーゼによって消化されず、前記生成物の二本鎖の性質を示す。Ｍ：表示されるような、１７ｂｐ、２１ｂｐおよび２５ｂｐのｄｓＲＮＡ、ならびに２４ｎｔのｓｓＲＮＡに対応するＲＮＡマーカー。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、プライマー非依存性の、ＲＮＡ合成の新規の開始、および二本鎖ＲＮＡの産生のためのエネルギー条件を特徴付けるために使用される、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、それぞれ８０Ｗ（レーン１）、１６０Ｗ（レーン２）、２４０Ｗ（レーン３）、３２０Ｗ（レーン４）、４００Ｗ（レーン５）、４８０Ｗ（レーン６）、５６０Ｗ（レーン７）、６４０Ｗ（レーン８）、７２０Ｗ（レーン９）および８００Ｗ（レーン１０）で６０秒間のマイクロ波照射下で、２４ｎｔのｓｓＲＮＡ鋳型と共にインキュベートした。レーン１から１０は各々、２５ｂｐのｄｓＲＮＡマーカーと共に移動する生成物を示す。Ｍ：表示されるような、それぞれ１７ｂｐ、２１ｂｐおよび２５ｂｐのｄｓＲＮＡ、ならびに２４ｎｔのｓｓＲＮＡに対応するＲＮＡマーカー。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、プライマー非依存性の、ＲＮＡ合成の新規の開始、および二本鎖ＲＮＡの産生のために必要とされる照射時間を特徴付けるために使用される、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、８０Ｗでそれぞれ６０秒間（レーン１）、３０秒間（レーン２）、１５秒間（レーン３）および５秒間（レーン４）、または８００Ｗでそれぞれ６０秒間（レーン５）、３０秒間（レーン６）、１５秒間（レーン７）および５秒間（レーン８）のマイクロ波照射下で、２４ｎｔのｓｓＲＮＡ鋳型と共にインキュベートした。レーン１から８の各々が、２５ｂｐのｄｓＲＮＡマーカーと共に移動する生成物を示す。Ｍ：表示されるような、それぞれ１７ｂｐおよび２５ｂｐのｄｓＲＮＡ、ならびに２４ｎｔのｓｓＲＮＡに対応するＲＮＡマーカー。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼが、反応物をマイクロ波照射に曝露すると、プライマー非依存的に、ＤＮＡ鋳型上に新規にＲＮＡ合成を開始させ、２’−フルオロ−ＧＭＰを組み込み、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ生成物をもたらすことを実証する、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよび２’−フルオロ−ＧＴＰの存在下において、８００Ｗで６０秒間のマイクロ波照射下で、３’末端に５個のｄＣを有する２４ｎｔのｓｓＤＮＡ鋳型（レーン１）、または３’末端に５個のｒＣを有する以外は同じ配列のｓｓＤＮＡ鋳型（レーン２）と共にインキュベートした。上記と同じ条件下で、ならびにｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよびｒＧＴＰの存在下においてマイクロ波で照射した、前記サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼと、前記ＤＮＡ鋳型と同じ配列のｓｓＲＮＡ鋳型とを含有する反応物は、対照の役割を果たした（レーン３）。二本鎖の合成生成物、および一本鎖の鋳型が表示される。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼが、反応物をマイクロ波照射に曝露すると、プライマー非依存的に、ＤＮＡ鋳型上に新規にＲＮＡ合成を開始させ、α−チオ−ＧＭＰを組み込み、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ生成物をもたらすことを実証する、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよびα−チオ−ＧＴＰの存在下において、８００Ｗで６０秒間のマイクロ波照射下で、３’末端に５個のｄＣを有する２４ｎｔのｓｓＤＮＡ鋳型（レーン１）、または３’末端に５個のｒＣを有する以外は同じ配列のｓｓＤＮＡ鋳型（レーン２）と共にインキュベートした。上記と同じ条件下で、ならびにｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよびｒＧＴＰの存在下においてマイクロ波で照射した、前記サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼと、前記ＤＮＡ鋳型と同じ配列のｓｓＲＮＡ鋳型とを含有する反応物は、対照の役割を果たした（レーン３）。二本鎖の合成生成物、および一本鎖の鋳型が表示される。カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼによって、マイクロ波によって駆動される、ＲＮＡ合成が新規に開始され、二本鎖ＲＮＡが産生されるが、他のウイルスのＲＮＡポリメラーゼによっては、ＲＮＡ合成が新規に開始されず、二本鎖ＲＮＡが産生されないことを実証する、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。２４ｎｔのｓｓＲＮＡ鋳型を、８００Ｗで６０秒間のマイクロ波照射下で、サポウイルス（レーン１）、ノロウイルス（レーン２）、ベシウイルス（レーン３）、ラゴウイルス（レーン４）、ポリオウイルス（レーン５）またはＣ型肝炎ウイルス（レーン６）のＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベートした。２５ｂｐのｄｓＲＮＡマーカーと共に移動する二本鎖の生成物が、カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（レーン１から４）によって生じるが、ポリオウイルス（レーン５）またはＣ型肝炎ウイルス（レーン６）のＲＮＡポリメラーゼによっては生じない。Ｍ：表示されるような、それぞれ１７ｂｐおよび２５ｂｐのｄｓＲＮＡ、ならびに２４ｎｔのｓｓＲＮＡに対応するＲＮＡマーカー。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、ｓｓＤＮＡ鋳型上における、ＲＮＡ合成の新規の開始、および二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ生成物の産生を実証する、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、８００Ｗで６０秒間のマイクロ波照射下で、３’末端に５個のｄＣを有する２４ｎｔのｓｓＤＮＡ鋳型（レーン１）、または３’末端に５個のｒＣを有する以外は同じ配列の２４ｎｔのｓｓＤＮＡ鋳型（レーン３）と共にインキュベートした。対照として、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼと、同じ配列のｓｓＲＮＡ鋳型とを含有する反応物を、上記と同じ条件下で、マイクロ波で照射した（レーン２）。全ての反応を、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよびｒＧＴＰの存在下において実施した。２５ｂｐのｄｓＲＮＡマーカーと共に移動する二本鎖の生成物が、レーン２およびレーン３に出現するが、レーン１には出現せず、二本鎖の生成物が、ｓｓＤＮＡ鋳型の３’末端におけるｒＣヌクレオチドの存在下でのみ、産生されることを示す。Ｍ：表示されるような、２０ｎｔ、４０ｎｔおよび８０ｎｔのｓｓＤＮＡに対応するＲＮＡマーカー。Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、マイクロ波照射下で、ＲＮＡを合成することが可能でないことを実証する、反応物の電気泳動による分離後の、エチジウムブロマイド染色された未変性２０％ポリアクリルアミドゲルの写真を示す図である。Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、３７℃で２時間（レーン１）、またはマイクロ波で８００Ｗで６０秒間照射して（レーン２）、ｄｓＤＮＡ鋳型（１１６ｂｐの１８ＳｒＲＮＡ配列を含む、直線化されたプラスミド）と共にインキュベートした。全ての反応を、そうでなければ、Ｔ７−ＭｅｇａｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔＫｉｔ（Ambion, Inc.）の製造業者によって推奨される条件下で実施した。３７℃で２時間という等温のインキュベーション後に反応生成物が出現する（レーン１）が、マイクロ波照射後には出現しない（レーン２）。サーモブロックによって産生される熱を使用する、サポウイルスのＲｄＲｐによる、プライマー非依存性のＲＮＡ合成の新規の開始の酵素反応の速度論を反映するグラフである。反応速度論の決定のために、サポウイルスのＲｄＲｐ（配列番号１１）を、ＲＮＡ鋳型（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。反応を、３７℃のサーモブロックに配置して、２５μｌの総体積で行った。反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲｄＲｐ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、および２ｍＭのＧＴＰ、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μｌの総体積まで、含有していた。マイクロ波エネルギーを使用する、サポウイルスのＲｄＲｐによる、プライマー非依存性のＲＮＡ合成の新規の開始の酵素反応の速度論を反映するグラフである。反応速度論の決定のために、サポウイルスのＲｄＲｐ（配列番号１１）を、ＲＮＡ鋳型（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。反応を、１６０ワットの電子レンジに配置して、２５μｌの総体積で行った。反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲｄＲｐ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、および２ｍＭのＧＴＰ、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μｌの総体積まで、含有していた。

本発明は、以下の非限定的な例によって、さらに例示される。

実施例１：サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、プライマー非依存性の、ＲＮＡ合成の新規の開始、および二本鎖ＲＮＡの産生
サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）を、従来の電子レンジにおいて、８００Ｗで６０秒間のマイクロ波照射下で、ＲＮＡ鋳型（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。前記サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、鋳型として一本鎖ＲＮＡを使用して、二本鎖ＲＮＡを産生する（図１、レーン２を参照されたい）。得られた生成物を、Ｓ１ヌクレアーゼと共にインキュベートした。Ｓ１ヌクレアーゼと共にするインキュベーションの後、生成物の消化は、観察されず（図１、レーン３を参照されたい）、前記生成物の二本鎖の性質を示した。全ての反応を、２５μｌの総体積で行った。ＲＮＡ重合の反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲＮＡポリメラーゼ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、および２ｍＭのＧＴＰ、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μｌの総体積まで、含有していた。Ｓ１ヌクレアーゼ消化のために、Ｓ１ヌクレアーゼ（２５０Ｕ）を、反応物に添加し、反応混合物を、３０℃で１時間インキュベートした。生成物を、電気泳動によって未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

実施例２：カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動されるＲＮＡ合成のために必要とされるマイクロ波の電力および照射時間の特徴付け
サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）を、ＲＮＡ鋳型（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。反応を、従来の電子レンジに配置して、それぞれ８０Ｗ、１６０Ｗ、２４０Ｗ、３２０Ｗ、４００Ｗ、４８０Ｗ、５６０Ｗ、６４０Ｗ、７２０Ｗおよび８００Ｗで６０秒間、２５μｌの総体積で行った。さらなる実験では、反応を、同じ電子レンジにおいて、８０Ｗで６０秒間、３０秒間、１５秒間もしくは５秒間（図２Ｂ、レーン１から４を参照されたい）、または８００Ｗで６０秒間、３０秒間、１５秒間もしくは５秒間（図２Ｂ、レーン５から８を参照されたい）、実施した。予想された大きさの生成物が、全ての反応において産生された（図２Ａ、図２Ｂ）。

反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲＮＡポリメラーゼ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、および２ｍＭのＧＴＰ、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μｌの総体積まで、含有していた。生成物を、電気泳動によって未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

実施例３：カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、マイクロ波照射を使用した場合、プライマー非依存的に、ＤＮＡ鋳型上に新規にＲＮＡ合成を開始させ、２’−フルオロ−ＧＭＰを組み込み、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ生成物をもたらす
サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）を、ｓｓＤＮＡ鋳型（５’−ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１６）、または３’末端に（ｒＣ）_５配列モチーフを有する以外は同じ配列のＤＮＡ鋳型（５’−ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡｒＣｒＣｒＣｒＣｒＣ−３’；配列番号１７）と共にインキュベートした。対照として、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、上記の一本鎖ＤＮＡと同じ配列を有する一本鎖ＲＮＡ（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。全ての反応を、従来の電子レンジに配置して、８００Ｗで６０秒間、２５μｌの総体積で行った。反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲＮＡポリメラーゼ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、およびＧＴＰ（ｓｓＲＮＡ鋳型を使用する対照反応のために；図３、レーン３を参照されたい）または２’−フルオロ−ＧＴＰ（ｓｓＤＮＡ鋳型を使用する反応のために；図３、レーン１およびレーン２を参照されたい）のいずれか、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μｌの総体積まで、含有していた。生成物を、電気泳動によって未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

図３（レーン１およびレーン２を参照されたい）は、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、ｓｓＤＮＡ鋳型上におけるＲＮＡ合成、および２’−フルオロ−ＧＭＰの組込みを実証する。

実施例４：カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、マイクロ波照射を使用した場合、プライマー非依存的に、ＤＮＡ鋳型上に新規にＲＮＡ合成を開始させ、α−チオ−ＧＭＰを組み込み、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ生成物をもたらす
サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）を、ｓｓＤＮＡ鋳型（５’−ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１６）、または３’末端に（ｒＣ）_５配列モチーフを有する以外は同じ配列のＤＮＡ鋳型（５’−ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡｒＣｒＣｒＣｒＣｒＣ−３’；配列番号１７）と共にインキュベートした。対照として、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、上記の一本鎖ＤＮＡと同じ配列を有する一本鎖ＲＮＡ（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。全ての反応を、従来の電子レンジに配置して、８００Ｗで６０秒間、２５μｌの総体積で行った。反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲＮＡポリメラーゼ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、およびＧＴＰ（ｓｓＲＮＡ鋳型を使用する対照反応のために；図４、レーン３を参照されたい）またはα−チオ−ＧＴＰ（ｓｓＤＮＡ鋳型を使用する反応のために；図４、レーン１およびレーン２を参照されたい）のいずれか、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μｌの総体積まで、含有していた。生成物を、電気泳動によって未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

図４（レーン１およびレーン２を参照されたい）は、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、ｓｓＤＮＡ鋳型上におけるＲＮＡ合成、およびα−チオ−ＧＭＰの組込みを実証する。

実施例５：カリシウイルス科の種々のＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、プライマー非依存性の、ＲＮＡ合成の新規の開始、および二本鎖ＲＮＡの産生
サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）、ノロウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）、ベシウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１３）、またはラゴウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１４）を、マイクロ波照射下で、ＲＮＡ鋳型（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。全てのカリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼが、鋳型として一本鎖ＲＮＡを使用して、二本鎖ＲＮＡを産生する（図５、レーン１から４）。さらに、他のウイルス（ポリオウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）起源のＲＮＡポリメラーゼが、マイクロ波照射下で、同じ反応を同等に行うことができるかどうかを調査した。したがって、ポリオウイルスのＲＮＡポリメラーゼ、およびＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、マイクロ波照射下で、同じｓｓＲＮＡ鋳型と共にインキュベートした。しかしながら、ポリオウイルスのＲＮＡポリメラーゼ、およびＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、カリシウイルスのＲＮＡポリメラーゼに関して使用したのと同じ条件下で、二本鎖ＲＮＡを産生しない（図５、レーン５およびレーン６を参照されたい）。全ての反応を、従来の電子レンジに配置して、８００Ｗで６０秒間、２５μｌの総体積で行った。反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲＮＡポリメラーゼ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、および２ｍＭのＧＴＰ、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μlの総体積まで、含有していた。生成物を、電気泳動によって未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

実施例６：サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼによる、マイクロ波によって駆動される、プライマー非依存性の、ＲＮＡ合成の新規の開始、およびＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖の産生
サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）を、３’末端に（ｄＣ）_５配列モチーフを有するＤＮＡ鋳型（５’−ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１６）と共に、または３’末端に（ｒＣ）_５配列モチーフを有する以外は同じ配列のＤＮＡ鋳型（５’−ＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＡＡｒＣｒＣｒＣｒＣｒＣ−３’；配列番号１７）と共にインキュベートした。対照として、サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼを、一本鎖ＤＮＡ鋳型と同じ配列を示す一本鎖ＲＮＡ（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。前記サポウイルスのＲＮＡポリメラーゼは、前記ＤＮＡ鋳型の３’末端におけるＣリボヌクレオチドの存在下でのみ、鋳型として一本鎖ＤＮＡを使用して、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を産生する（図６、レーン２およびレーン３を参照されたい）。全ての反応を、従来の電子レンジに配置して、８００Ｗで６０秒間、２５μｌの総体積で行った。反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲＮＡポリメラーゼ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、および２ｍＭのＧＴＰ、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μlの総体積まで、含有していた。生成物を、電気泳動によって未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

比較例：等温条件下とマイクロ波照射下とにおける、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＤｄＲｐ）によるＲＮＡ合成の効率の比較
Ｔ７ＤｄＲｐを、３７℃、２時間という推奨される等温インキュベーション条件下で、またはマイクロ波照射（８００Ｗ、６０秒間）を使用して、二本鎖ＤＮＡ鋳型（１１６ｂｐの１８ＳｒＲＮＡ配列を含む、直線化されたプラスミド；反応前に１μｇ）上におけるＲＮＡ合成に使用した。Ｔ７−ＭｅｇａｓｃｈｏｒｔｓｃｒｉｔｐＫｉｔ（Ambion, Inc）の試薬を使用した。全ての反応を、製造業者の取扱説明書に従って行った。等温条件下でインキュベートした反応の生成物を、図７、レーン１に示す。比較として、反応混合物をマイクロ波照射に曝露した（８００Ｗ、６０秒間；図７、レーン２）場合、生成物は合成されなかった。反応生成物を、電気泳動によって未変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。

上記の実施例および比較例は、カリシウイルス科というウイルスの科（カリシウイルス）のＲＮＡポリメラーゼは、マイクロ波照射下で、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合されたＲＮＡ／ＤＮＡ鋳型上に相補的ＲＮＡ鎖を重合するが、構造的に関連する、他のウイルス（ポリオウイルス、ＨＣＶ）のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＤｄＲｐ）は、マイクロ波照射下で、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合されたＲＮＡ／ＤＮＡ鋳型上に相補的ＲＮＡ鎖を重合しないことを示す。

実施例７：サーモブロックによって産生される熱と比較して、マイクロ波エネルギーを使用した場合の、サポウイルスのＲｄＲｐによるＲＮＡ合成の触媒効率の増大
反応速度論の決定のために、サポウイルスのＲｄＲｐ（配列番号１１）を、ＲＮＡ鋳型（５’−ＡＵＡＣＣＵＡＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＣ−３’；配列番号１５）と共にインキュベートした。全ての反応を、３７℃のサーモブロック、または１６０ワットの電子レンジのいずれかに配置して、２５μｌの総体積で行った。反応混合物は、１μｇの鋳型、７．５μＭのＲｄＲｐ、０．４ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの各々、および２ｍＭのＧＴＰ、５μｌの反応緩衝液（ＨＥＰＥＳ２５０ｍＭ、ＭｎＣｌ_２２５ｍＭ、ＤＴＴ５ｍＭ、ｐＨ７．６）、ならびにＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅを含まない水を２５μｌの総体積まで、含有していた。図８Ａは、サーモブロックによって産生される熱を使用する反応の速度論を示す。図８Ｂは、マイクロ波エネルギーを使用する反応の速度論を示す。４回の独立した測定の中央値＋／−ＳＥＭ（エラーバー）を示す。

サポウイルスのＲｄＲｐは、サーモブロックによって産生される熱と比較して、エネルギーの供給源としてマイクロ波を使用した場合、触媒効率の増大（Ｋ_ｃａｔは５倍まで、Ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍは１．６倍まで）を示す。

Claims

一本鎖ポリヌクレオチド鋳型上に、相補的ＲＮＡ鎖を重合するための方法であって、前記鋳型にハイブリダイズするプライマーの存在下または非存在下において、ＲＮＡ重合条件下で、カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼと前記鋳型とを含有する組成物を、有効量のマイクロ波エネルギーで照射することを含み、ただし、前記鋳型が、デオキシリボヌクレオチドを含有する場合、前記照射は、修飾されたＧＴＰ、好ましくは２’−フルオロ−ＧＴＰまたはα−チオ−ＧＴＰの存在下において実施され、前記デオキシリボヌクレオチドを含有する鋳型が、その３’末端にデオキシ−Ｃヌクレオチドではないデオキシリボヌクレオチドを有する場合、前記照射工程は、前記鋳型にハイブリダイズするプライマーの存在下において実施され、ただし、前記鋳型が、ポリアデニル化、ポリグアニル化もしくはポリウリジル化されたＲＮＡであるか、またはそれぞれポリＡＲＮＡ、ポリＧＲＮＡもしくはポリＵＲＮＡである場合、前記照射工程は、前記鋳型にハイブリダイズするプライマーの存在下において実施され、前記鋳型がポリシチジル化されており、前記照射工程がプライマーの非存在下において実施される場合、前記組成物は、それぞれＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰに対して過剰のＧＴＰを含有する、方法。
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ノロウイルス、サポウイルス、ベシウイルスまたはラゴウイルスのＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
前記ＲＮＡポリメラーゼが、ノロウイルス株ＨｕＣＶ／ＮＬ／Ｄｒｅｓｄｅｎ１７４／１９９７／ＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ７４１８１１）のＲＮＡポリメラーゼ、またはサポウイルス株ｐＪＧ−Ｓａｐ０１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ６９４１８４）のＲＮＡポリメラーゼ、またはベシウイルス株ＦＣＶ／Ｄｒｅｓｄｅｎ／２００６／ＧＥ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ４２４８９２）のＲＮＡポリメラーゼ、またはラゴウイルス株ｐＪＧ−ＲＨＤＶ−ＤＤ０６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＦ３６３０３５．１）のＲＮＡポリメラーゼである、請求項１または２に記載の方法。
前記ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、１５００ＭＨｚから３５００ＭＨｚまでの周波数、および５０から１０００Ｗまでの電力を有するマイクロ波で照射される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、３から１２０秒間、マイクロ波で照射される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、前記修飾されたＧＴＰ、好ましくは２’−フルオロ−ＧＴＰまたはα−チオ−ＧＴＰに任意に加えて、少なくとも１個の修飾または標識されたリボヌクレオチドを含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
前記鋳型が、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、混合された一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ、またはそれらの混合物である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
前記鋳型が、１５から３０ヌクレオチド、好ましくは２１から２８ヌクレオチド、より好ましくは２１から２３ヌクレオチドの長さを有し、前記照射工程が、プライマーの非存在下において実施される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記鋳型が、その３’末端に少なくとも１個のＣヌクレオチド、好ましくは１から５個のＣヌクレオチドを有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
ＲＮＡ重合条件下での前記照射工程を実施する前に、唯一のヌクレオチドとしてのｒＣＴＰの存在下において、カリシウイルス科のウイルスの前記ＲＮＡポリメラーゼと前記鋳型とを含有する前記組成物が、有効量のマイクロ波エネルギーで最初に照射される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＮＡポリメラーゼが、マイクロ波照射下で、二本鎖の生成物を、一本鎖へと分離し、各々の一本鎖上に、任意にプライマーの存在下において、相補的ＲＮＡ鎖を合成し、相補鎖の分離の工程とＲＮＡ合成の工程とを、任意にプライマーの存在下において、１回または複数回繰り返す、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
一本鎖ポリヌクレオチド鋳型の３’末端に、１個または複数個のリボヌクレオチドを転移するための方法であって、ｒＡＴＰ、もしくはｒＧＴＰ、もしくはｒＵＴＰ、もしくはｒＣＴＰ、またはそれらの修飾もしくは標識された類似体の存在下において、カリシウイルス科のウイルスのＲＮＡポリメラーゼを含有する組成物を、有効量のマイクロ波エネルギーで照射する工程を含む、方法。
前記鋳型が、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、混合された一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ、またはそれらの混合物である、請求項１３に記載の方法。