JP5420174B2 - ライゲーションによるrna増幅法 - Google Patents
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Description
本発明の方法は新規な核酸構造体の産生、並びにその後の核酸の精製及び増幅での使用に関する。該方法は二本鎖領域と一本鎖領域とを含むDNA配列を必要とする。2つのDNAオリゴを一緒に混合すること、又はヘアピンループを形成できる1つのオリゴを用いることによりこのコンホメーションが形成されうることが特記すべき点である。一本鎖領域は目的のRNA配列と相補的であり、以下を含んでもよい。
1)例えば5′−d[…(T)x]−3′などのポリ(dT)配列
(Xがあらゆる整数であり、「…」がその前の二本鎖領域の1つの鎖を表す)、又は
2)例えば5′−d[…TTT(V)x(N)x]−3′などの可変ヌクレオチド配列を有する3′末端のポリ(dT)配列(VがA、C又はGであってよく、Nが4つの全ヌクレオチドのいずれでもよく、Xがいかなる整数でもあってもよく、「…」がその前の二本鎖領域の1つの鎖を表す)。RNAを次にDNA配列の一本鎖領域にハイブリダイズさせ、その2つの配列を新規な方法によりライゲーションさせ、RNA−DNA分子を調製する。当業者であればポリ(dT)部を除去して一本鎖の構成を5′−d−[…(V)x(N)x]3′、d−[…(V)x]3′又はd[…(N)x]−3′としてもよいことを認識するであろう。
上記方法は特にRNAの増幅及び精製に適用される。様々な供給源に由来するRNAでもよいが、該方法では特にポリAテール部を含む真核生物mRNAが好適である。例えばRNAをヒト又は他の動物などの供給源を由来としてもよく、健常者の集団と疾病/感染の集団との間、又は治療を受けた試料と対照試料の間における、RNA試料の比較試験の一部とすることもでき、RNAを用いて疾患か健康か、癌か癌でないか、治療したか治療しないかに関する試験、薬物スクリーニング、感染性物質スクリーニングを個々人にて評価し、診断に利用することも含まれうる。RNAは通常試料ごとに異なるRNA配列の混合物であって、4つの天然の塩基A,C,G及びUを有するRNA配列を含む。非天然の又は修飾されたその他の塩基が存在してもよい。RNA(特に標識RNA)の多数のコピーの生成は多くの用途にとって重要である。すなわち試料が胎児由来、老人由来、単一の細胞又は限られた細胞による限定的な分析、患者の生検標本、ハイスループット試験用である場合、稀な現象のスクリーニングなどの希薄な試料(混合試料中の細胞、例えば癌の転移の際又は転移前の血液中の癌細胞のスクリーニング)である場合、環境試料(細菌戦における検出、水の純度、食品試験)である場合、などの状況が挙げられる。
RNA試料を、二本鎖領域と一本鎖領域とを含む1以上の核酸配列と混合する。核酸配列中の一本鎖領域がそのRNAにハイブリダイズする。RNAの3′末端に対する、核酸の二本鎖領域中の5′末端のライゲーションは酵素的手段によってなす。用いる核酸配列はDNA、RNA、DNAとRNAの組合せ、又はPNAなどの核酸アナログであってもよい。核酸配列は異なる長さの2つの異なる鎖を含んでもよく、又は二本鎖領域と一本鎖領域を形成できるヘアピン構造を含む一本鎖でもよい。
好適なアフィニティータグを核酸配列中に、好ましくは核酸配列の3′末端に含め、その配列をRNA配列にライゲーションする場合、連結RNA−核酸分子の精製が可能となる。若干の実施形態では、核酸配列はDNA(好ましくは二本鎖DNA)を含む。好ましくはアフィニティータグがDNA配列の二本鎖DNA領域に含まれ、それによりRNAに対するハイブリダイゼーションへの干渉のおそれが最小化される。RNAが核酸配列にライゲーションし、アフィニティータグに間接的にライゲーションするため、RNAの塩基対合(水素結合)に依存する他の方法よりもさらにストリンジェントな精製条件を用いることができる。これを図1の最初の部分において模式的に示す。意図する使用が精製のみである場合、二本鎖DNA領域にRNAポリメラーゼプロモータ領域を含める必要はない。アフィニティータグとしては、例えばビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、Hisタグ及びその他多くの従来技術において周知の多くのものが挙げられる。
図1に示すように、ライゲーションしたDNA―RNA分子は、ライゲーションした二本鎖DNA分子に含まれるプロモータ配列を用いることで、RNA合成の鋳型として機能できる。様々なRNAポリメラーゼを用いてもよいが、T7 RNAポリメラーゼが好適である。ライゲーションしたDNA−RNA分子が転写されると、元の開始mRNA配列と相補的なRNAの多数のコピー(すなわちアンチセンスcRNA鎖)が生じる。Tag#1として示すタグ領域をcRNAの5′領域にも導入できる。
図2に示すように、図1の反応によって得られた5′タグ付cRNA(アンチセンス鎖)を、別のDNA配列にハイブリダイズし、ライゲーションすることができる。このDNA配列は図1に示すDNA構造と全体として同じであるが、図2に示すように一本鎖領域はポリdTでなく、代わりにアンチセンス鎖の3′末端とハイブリダイズするランダムな塩基配列をからなる。さらに、特異的なRNAが増幅されるようにその一本鎖DNA領域に特異的な既知の配列を含めてもよい。
図2又はさらにいずれかの図にて説明したように生産されるRNAは、図3に示すようにcDNAの調製に用いることができる。RNAはそのTag#1と相補的な配列を含む一本鎖DNAプライマーとハイブリダイズする。RNA−DNAハイブリッドは、さらに逆転写酵素及びdNTPを用いて第1のcDNA鎖の合成に用いる。第1のcDNA鎖合成の完了後、RNAseを用いてそのヘテロ二本鎖中のRNAを除去する。Tag#2プライマー、DNAポリメラーゼ及びdNTPsを用いて第2の鎖合成をを行って両端にタグ配列を有する全長cDNAを得る。cDNAにはタンパク質発現、RNAスプライス部位の分析及び遺伝子発見など、多数の用途が存在する。
多くの用途において、使用しない核酸配列を除去するのが好適である。例えば、RNAにライゲーションしなかったDNA配列は適切なエキソヌクレアーゼ(例えばλエキソヌクレアーゼ又はT7遺伝子6エキソヌクレアーゼ)により、適切な段階で反応生成物を処理して除去できる。
上記の多数の用途において、例えばrNTP(UTP、ATP、GTP及びCTP)又はdNTP(TTP、dATP、dGTP及びdCTP)など、標準的なヌクレオチドを用いてもよい。しかし、メチル化ヌクレオチドのようなヌクレオチドアナログ、又はrNTPαS又はdNTPαSなどのヌクレオチドの添加が、若干の用途にとって好適であることもある。標準的なヌクレオチドとヌクレオチドアナログとの混合物が適切でありうる。
熟練した当業者であれば構成成分及び方法にさらに変形を与えることが可能であると理解する。
水
これらの実施形態で用いる、電気泳動用緩衝液の調製に用いる水を含むすべての水を、混入するいかなるRNAヌクレアーゼも除去するため、ジエチルピロカーボネート(DEPC)で処理し、オートクレーブした。ライゲーション又は転写反応液の調製に用いる水はDEPC処理されており、Ambion社から購入した。
1)T7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す(Lopez,et al.J.Mol.Biol.269:41−51(1997)。
2)5塩基の介在配列(IVS)又はそのポリ(dT)配列が開始する転写開始位置に相補的な配列をイタリックで示す。
3)24塩基のポリ(dT)配列(T24)又はmRNAの3′側のポリ(rA)テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
1)5′リン酸基はmRNAの3′水酸基との共有結合の形成に関与する。
2)イタリックの列の4つのdA残基はmRNAのその3′ポリ(rA)テール部の相補的結合を促進する。
3)RNAポリメラーゼによって転写される第1の塩基を下線付きのCで示す。cPT7IVS5 オリゴのその5′末端に向かって、結合するmRNA配列中で合成が行われる。
4)プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
1)T7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す。
2)15塩基のIVS又はそのポリ(dT)配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
3)24塩基のポリ(dT)配列(T24)又はmRNAの3′側ポリ(rA)テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
1)5′リン酸基はmRNAの3′水酸基との共有結合の形成に関与する。
2)イタリック列の4つのdA残基はmRNAの3′ポリ(rA)テール部の相補的な結合を促進する。
3)RNAポリメラーゼによって転写される第1の塩基を下線付きのCで示す。cPT7IVS5オリゴのその5′末端に向かって、IVSを通って、結合しているmRNA配列中で合成が行われる。
4)プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
1)T3 RNAポリメラーゼのそのプロモータ配列を太字で示す(Ling M−L,et al.Nucl.Acids Res 17:1605−1618(1989)。
2)15塩基のIVS又はそのポリ(dT)配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
3)24塩基のポリ(dT)配列(T24)又はmRNAの3′側ポリ(rA)テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
1)5′リン酸基はmRNAの3′水酸基との共有結合の形成に関与する。
2)イタリック列の4つのdA残基はmRNAの3′ポリ(rA)テール部の相補的な結合を促進する。
3)RNAポリメラーゼによって転写される第1の塩基を下線付きのCで示す。cPT7IVS5オリゴのその5′末端に向かって、IVSを通って、結合しているmRNA配列中で合成が行われる。
4)プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
1)5′リン酸基はmRNAの3′水酸基との共有結合の形成に関与する。
2)イタリック列の4つのdA残基はmRNAの3′ポリ(rA)テール部の相補的な結合を促進する。
3)RNAポリメラーゼによって転写される第1の塩基を下線付きのCで示す。ビオチン−cPT7IVS5オリゴのその5′末端に向かって、IVSを通って、結合しているmRNA配列中で合成が行われる。
4)プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
5)ビオチン基を最後の3′側のT残基の塩基の5位に結合させた。
1)2つの突出A残基はホスホロチオネート結合(*)で連結している。
2)T7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す。
3)25塩基のIVS又はそのポリ(dT)配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
4)24塩基のポリ(dT)配列(T24)又はmRNAの3′側ポリ(rA)テール部の「捕捉」に用いる配列を下線で示す。
1)3つの2′−O−メチルウリジンモノリン酸残基及び5つのデオキシチミジンモノリン酸残基はmRNAのポリAテール部にオリゴを向けさせる。
2)dV及びmNは変性塩基であり、dVはA、C、又はGのみであり、mNは2′−O−メチル化された4種全ての塩基であり、それはmRNAメッセージのポリ(A)のすぐ5′側の最後の2つの塩基にオリゴを固定する。
3)メチル化された残基はRNaseHがdT領域の外側でmRNAにニックを入れるのを防止する。
4)5つのdT残基によってRNaseHが結合して、mRNA中この領域への標的ニッキングが可能となる。
1)3つの2′−O−メチルウリジンモノリン酸残基及び5つのデオキシチミジンモノリン酸残基はmRNAのポリAテール部にオリゴを向けさせる。
2)dV及びmNは変性塩基であり、dVはA、C、又はGのみであり、mNは2′−O−メチル化された4種全ての塩基であり、それはmRNAメッセージのポリ(A)のすぐ5′側の最後の2つの塩基にオリゴを固定する。
3)メチル化された残基はRNaseHがdT領域の外側でmRNAにニックを入れるのを防止する。
4)5つのdT残基によってRNaseHが結合して、mRNA中この領域への標的ニッキングが可能となる。
1)4つの2′−O−メチルウリジンモノリン酸残基及び5つのデオキシチミジンモノリン酸残基はmRNAのポリAテール部にオリゴを向けさせる。
2)dV及びmNは変性塩基であり、dVはA、C、又はGのみであり、mNは2′−O−メチル化された4種全ての塩基であり、それはmRNAメッセージのポリ(A)のすぐ5′側の最後の2つの塩基にオリゴを固定する。
3)メチル化された残基はRNaseHがdT領域の外側でmRNAにニックを入れるのを防止する。
4)5つのdT残基によってRNaseHが結合して、mRNA中この領域への標的ニッキングが可能となる。
1)T7 RNAポリメラーゼのプロモータ配列を太字で示す。
2)15塩基のIVS又はそのポリ(dT)配列が開始する転写開始部位に相補的な配列をイタリック体で示す。
3)3塩基のポリ(dT)配列又はmRNAの3′側ポリ(rA)テール部の「捕捉」に用いる配列の一部を下線で示す。
4)V及びNは変性塩基であり、VはA、C、又はGのみであり、Nは4種全ての塩基であり、それはmRNAメッセージのポリ(A)のすぐ5′側の最後の2つの塩基にオリゴを固定する。
1)5′リン酸基はmRNAの3′水酸基との共有結合の形成に関与する。
2)RNAポリメラーゼによって転写される第1の塩基を下線付きのCで示す。cPT7IVS5オリゴのその5′末端に向かって、IVSを通って、結合しているmRNA配列中で合成が行われる。
3)プロモータ配列に相補的な配列を太字で示す。
4)15塩基のIVSをイタリックで示す。
分子内又は分子間での、核酸上の5′−リン酸基と核酸上の3′−水酸基との間の共有結合を形成できるあらゆる酵素を指す。その例としてはT4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ及び大腸菌DNAリガーゼが挙げられる。
合成RNAへの二本鎖DNAのライゲーション
大腸菌DNAリガーゼ(New England Biolabs社、10ユニット/μL)以外のすべてのライゲーション反応の構成要素を、表1に示すように混合した。反応液を5分間の60℃で加熱し、さらに室温に冷却した。大腸菌DNAリガーゼを適切な試験管に添加し、反応液を30℃で2時間インキュベートした。各反応液をRNaseフリーの0.5M EDTA(US Biochemicals社)の1μLの添加によって停止させた。
3つの異なるリガーゼによる二本鎖DNAとRNAとのライゲーション
リガーゼ以外のすべてのライゲーション反応の構成成分を、表2に示すように混合した。反応液を5分間の60℃で加熱し、さらに室温に冷却した。異なるリガーゼを適切な試験管に添加し、反応液を30℃で2時間インキュベートした。各反応液をRNaseフリーの0.5M EDTA(US Biochemicals社)を1μL添加して停止させた。
ライゲーション後のRNAの転写可能性
大腸菌DNAリガーゼ以外のすべてのライゲーション反応液の構成成分を、表3に示すように混合した。反応液を5分間の60℃で加熱し、さらに室温に冷却した。大腸菌DNAリガーゼを適切な試験管に添加し、反応液を16℃で2時間インキュベートした。各反応液をRNaseフリーの0.5M EDTA(US Biochemicals社)の1μLの添加によって停止させた。
mRNAに対する二本鎖DNA
すべての成分を表5に示すように混合し、30℃で15分間インキュベートした。本実施例ではアニーリング工程を含めなかった。RNA35に対するcPT7IVS15のライゲーションの他に、骨格筋ポリA RNA(smRNA;Russian Cardiology Research and Development Center)も、この系のライゲーション標的として用いた。RNaseフリーの0.5M EDTA(US Biochemicals社)を1μL添加し、各反応を停止した。
迅速なライゲーションキネティクス
表7で概説するようなライゲーション反応液を調製した。T4 DNAリガーゼを除いてすべての成分を含むバルクの反応混合液を調製し、7つの試験管に各々19μLずつ分注した。0時点で水1μLを添加し、0.5M EDTAを1μL添加し、ゲル分析まで氷上で保存した。残りのすべての反応液にT4 DNAリガーゼ(350ユニット、タカラ製)1μLを添加し、室温で30秒間、及び8分インキュベートした。指定された時間に0.5M EDTA1μLを適時に試験管に添加し、ゲル分析まで氷上に静置した。
EDTA又はクエン酸の添加による増幅収量の向上
まず本実施例のライゲーションで用いるオリゴを表8で概説するように混合した。表9で概説するようにライゲーション反応液をさらに調製した。ライゲーション液を混合し、30℃で15分間インキュベートした。ライゲーション番号1では0.5M EDTAを1μL添加し、一方ライゲーション番号2〜4では各々0.5M EDTAを2μL添加した。ライゲーション番号2〜4は一緒にプールし、十分混合した。
EDTA存在下での複製キネティクス
EDTAの有無による増幅反応のキネティクスの検討を行った。さらに、すべての反応液中にビオチン−11−UTP(Perkin Elmer Life Sciences社)を添加した。表11のAからCで概説するように、ライゲーション及び複製の反応溶液を調製した。ライゲーション液を混合し、30℃で15分インキュベートし、さらに60℃で10分間加熱し、リガーゼを失活させた。バルクの複製反応溶液を、EDTAを含むものと含まないものとに調製した。各バルク混合液を20μLずつのアリコートとして、インキュベーション用の試験管に分注した。0時点では直接0.5M EDTAを各々1μLずつ添加し、−80℃で保存した。残りの試験管を37℃で1、2、4、8又は16時間インキュベートした。
0.5M EDTAを1μL添加して各反応を停止させ、ゲル分析(データ示さず)及び精製を行うまで−80℃で保存した。各反応液をMicrocon(商標)YM−30フィルターユニット(Millipore社)を用いて製造業者の指示従い精製した。精製後、各反応液の一部の吸光度を260nmで測定した。RNA収率は吸光度測定値×希釈倍率×40μg/mlで算出した。
複製産物のHPLC分析
ライゲーションに基づくRNA増幅反応産物を2つの異なるRNAエキソヌクレアーゼによる同時処理をを行ってHPLC分析した。増幅RNA(cRNA)10μgを、2μgのヘビ毒ホスホジエステラーゼ及び0.6ユニットの細菌アルカリホスファターゼ(共にGE Healthcare Bio−Sciences社)を用い、50mM HEPES緩衝液、pH8及び15mM MgCl2中で、37℃で6時間処理した。さらに対照として各ヌクレオシド三リン酸塩 4mM溶液を消化した。消化後、60μLの反応液を水で120μLにし、0.2μmのナイロン製のAcrodisc(商標)シリンジフィルター(Pall Life Sciences社)を用いて精製し、タンパク質を除去した。各消化物を20〜40μLずつ、XTerra(登録商標)MS C18 5μm 4.6×100mmカラム(水)に接続しているHPLCに注入し、表12記載の緩衝液勾配プロフィールとした。緩衝液Aは0.1%のトリエチルアンモニウム酢酸塩(アプライドバイオシステム社)とし、緩衝液Bはアセトニトリル(VWR Scientific社)とした。
さらに、反応液に低い濃度の変性剤を添加したとき、結果として生じるポリAの合成の減少と共にポリU生成物の鋳型RNAへのアニーリングが妨害されることも示唆される。ライゲーションに基づくRNA増幅反応に0.0005%のSDSを存在させ、RNAエキソヌクレアーゼ消化を用い、HPLC分析した結果を得た。RNAエキソヌクレアーゼによるcRNA消化及びHPLC分析が示すように、反応液に0.0005%のSDSを添加することで非特異的Aピークが減少する結果が示された。
転写産物のマイクロアレイ分析
ラットの腎臓及び肝臓由来の全RNA(Russian Cardiology Research and Development Center)を用いて表14で概説するようにライゲーション液A及びBを調製した。成分を混合し、室温で2分間インキュベートした。ライゲーション液L1及びL2は各々1μLのλエキソヌクレアーゼ(20ユニット/μL、50ユニット/μLから1×ライゲーション緩衝液(NEB)で希釈)を含み、一方ライゲーション液L3及びL4では各々3μLのλエキソヌクレアーゼを添加(T7遺伝子6タンパク質もここに添加;データ示さず)した。すべてのライゲーション液をさらに37℃で30分間インキュベートした。ライゲーション液L1及びL2各々に0.5M EDTA(Ambion社)を1.6μL添加し、一方ライゲーション液L3及びL4各々に0.5M EDTAを4.8μL添加した。ライゲーション液をさらに65℃で15分間インキュベートし、混合液中のすべての酵素を熱で失活させた。これらの操作の後、L1及びL2では全量が各々16.5μL、又はL3及びL4では各々49.5μLであり、EDTA濃度は各々同様に48.48mMであった。
ストレプトアビジンビーズを用いたmRNA精製
表17で概説するようにライゲーション液を調製し、混合し、室温で2分間インキュベートした。λエキソヌクレアーゼを4μLずつ各試験管に添加し、反応液を37℃で15分間インキュベートした。各試験管に0.5M EDTAを6.4μL添加し、反応液を65℃で15分間インキュベートした。精製するライゲーション液ごとに、100μLのMPGストレプトアビジン磁気粒子(PureBiotech LLC社)を、製造業者の指示にしたがい、2M KClを100μLずつ添加して洗浄し、さらに2M KClを100μL及び水を82.5μLずつ添加し再懸濁した。洗浄した磁気ビーズの各182.5μLの調製液に適切なライゲーション液17.5μLを添加し、随時穏やかに混合しながら室温で15分間インキュベートした。磁石を用いてビーズを液相から分離し、各々200μLの70%エタノールで二度洗浄した。各ビーズペレットを水50μLに再懸濁し、65℃で3分間加熱した。磁石を用いてビーズを液相から再び分離し、その液相を次の分析のために保存した。
RNaseHによるポリ(A)テールのトリミング
この実験のワークフローは以下の通りである:1)RNaseH(New England Biolabs社;10ユニット/μL)を用いたmRNAのポリ(A)テールの標的トリミング 2)トリミングされたポリ(A)mRNAのライゲーションに基づく増幅、及び3)RNAエキソヌクレアーゼ消化及びHPLC分析のための特定の反応液の選択。mRNAのポリ(A)テールのトリミングはRNaseH存在下でmRNA又は全RNA(Russian Cardiology Research and Development Center)を、各反応液でオリゴHT−III 10c、HT−III 10d、HT−III 10f又はHT−III10gと混合して行った。RNaseH消化のための代表的な組成を表19に示す。RNaseHを1×ライゲーション緩衝液で2.5Units/μLに希釈し、37℃で30分間消化を実施した。
Claims (16)
- 連結核酸分子の調製方法であって、
a)ポリA以外の一本鎖RNAを供給し、
b)二本鎖領域と一本鎖3′末端領域とを有するDNAからなる1以上の核酸を供給し、
c)RNAに核酸配列の一本鎖3′端末領域をハイブリダイズさせ、RNAの3′末端に対して核酸の二本鎖領域の5′末端を、T4 DNAリガーゼ及び大腸菌DNAリガーゼからなる群から選択されるDNAリガーゼによってライゲーションする
ことを含んでなる方法。 - 前記核酸が
1)後段でRNA合成のプロモータ配列として使用できるヌクレオチド配列、及び
2)核酸の標識又は核酸の操作に使用できるタグ、
からなる群から選択される1以上の特徴を含む、請求項1記載の方法。 - 前記リガーゼがT4 DNAリガーゼである、請求項1記載の方法。
- 1)のヌクレオチド配列及び2)のタグを用いて得られた生成物をRNAポリメラーゼで転写して5′末端配列にタグを付与したcRNAを調製することをさらに含む、請求項2記載の方法。
- 5′末端配列にタグを付与したcRNA分子を、二本鎖領域と一本鎖領域とを含む第2の二本鎖DNA配列とライゲーションする、請求項4記載の方法。
- ライゲーションしたRNA−DNA分子生成物をRNAポリメラーゼによってさらに転写し、RNA分子の5′末端及び3′末端にタグを含むRNAを複数コピーする、請求項5記載の方法。
- 5′末端及び3′末端にタグを付与したRNA配列を、
a)RNAの3′末端の配列タグと相補的なDNAプライマーと混合してハイブリダイズし、
b)逆転写酵素及びdNTPsでインキュベートして一本鎖cDNA−RNAヘテロ二本鎖を調製し、
c)工程b)の生成物をRNaseとインキュベートし、
d)工程c)の生成物を、一本鎖cDNAの3′末端のタグ配列に相補的な配列を含む第2の一本鎖プライマー及びDNAポリメラーゼとインキュベートし、両末端にタグを付与した二本鎖cDNAの配列を調製する、請求項6記載の方法。 - 標的RNA配列の増幅方法であって、
a)一本鎖の形態のRNAを供給し、
b)RNAポリメラーゼのプロモータ配列を含む二本鎖領域と、標的RNAにハイブリダイズする一本鎖領域とを含むDNA配列を添加し、
c)T4 DNAリガーゼ及び大腸菌DNAリガーゼからなる群から選択されるDNAリガーゼによってRNAの3′末端にDNA配列をライゲーションしてDNA−RNAを調製し、
d)RNAポリメラーゼによってDNA−RNAを転写してアンチセンス相補RNA(cRNA)を調製する
ことを含んでなる増幅方法。 - e)RNAポリメラーゼのプロモータ配列を含む二本鎖領域と、cRNAにハイブリダイズする一本鎖領域とを含むDNA配列を添加し、
f)酵素的手段によってcRNAとDNA配列をライゲーションし、
g)RNAポリメラーゼによって工程f)の生成物の転写を行って標的RNAと同じセンスRNAの複数のコピーを調製する
ことをさらに含む、請求項8記載の増幅方法。 - 前記二本鎖DNA配列の少なくとも1つがタグ配列を含む、請求項9記載の増幅方法。
- 前記両方の二本鎖DNA配列がタグ配列を含む、請求項9記載の増幅方法。
- 前記リガーゼがT4 DNAリガーゼである、請求項8記載の増幅方法。
- 前記タグ配列が異なる、請求項11記載の増幅方法。
- 工程b)及びe)で用いる二本鎖DNA配列が異なるRNAポリメラーゼのプロモータを含む、請求項9記載の増幅方法。
- 工程d)が1以上のヌクレオチドアナログを含む反応で実施される、請求項8又は請求項9記載の増幅方法。
- 前記核酸がアフィニティータグをさらに含んでなり、アフィニティータグが連結核酸分子の精製に使用できる、請求項1記載の方法。
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