BR112019024615A2 - Regulação transbiótica de expressão genética bacteriana - Google Patents

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Pedro COSTA-NUNES
Pedro Costa-Nunes
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Abstract

A tecnologia inventiva pode incluir novos sistemas para regulação da expressão de genes bacterianos através da introdução de RNA antissenso (asRNA) que pode interromper a expressão de genes patogênicos de alvo e/ou seus produtos (mRNA, proteínas). Em algumas modalidades, a tecnologia inventiva pode incluir novas cepas bacterianas doadoras geneticamente modificadas que são configuradas para distribuir eficientemente e continuamente polinucleotídeos asRNA para um patógeno receptor e infrarregular a expressão de um ou mais genes essenciais.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO REGULAÇÃO TRANSBIÓTICA DE EXPRESSÃO GENÉTICA BACTERIANA
[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido Provisório US Nº 62/509.272, depositado em 22 de maio de 2017. Todo relatório descritivo e as figuras do pedido acima mencionado são incorporados por meio deste em suas totalidades por referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de sequências, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 22 de maio de 2018, é nomeada PCT6_Seq-Listing. txt e tem 2 Kbytes de tamanho.
CAMPO TÉCNICO
[003] Geralmente, a tecnologia inventiva se refere a novas estratégias transbióticas para controlar agentes causadores de doenças, incluindo bactérias resistentes a múltiplos fármacos em um organismo eucariótico hospedeiro. Em particular, a tecnologia inventiva pode incluir novos sistemas para regular expressão de gene bacteriano através da introdução de RNA antissentido (asRNA) que pode interromper a expressão de genes patogênicos de alvo e/ou seus produtos (RNA, proteínas). Em algumas modalidades, a tecnologia inventiva pode incluir novas cepas bacterianas doadoras geneticamente modificadas por engenharia configuradas para distribuir eficientemente e continuamente polinucleotídeos de asRNA para um patógeno receptor e infrarregular a expressão de um ou mais genes essenciais em um hospedeiro.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] Segundo um relatório da World Health Organization (WHO), mais de 20% do total de mortes no mundo são devido a doenças infecciosas. Os mecanismos de infecção de hospedeiro mediados por bactérias são baseados nas interações entre as proteínas do patógeno e seu hospedeiro. Patógenos de plantas bacterianos resultam em perdas de colheitas estimadas serem de centenas de bilhões de dólares anualmente e foram diretamente responsáveis por aumentar a insegurança alimentar em todo o mundo.
[005] Tradicionalmente, bactérias patogênicas têm sido gerenciadas através do uso de compostos antibióticos em ambos os sistemas de plantas e animais. De fato, os compostos antibióticos têm sido uma pedra angular da medicina clínica desde a segunda metade do século XX. No entanto, o início da resistência a antibióticos em bactérias é uma crise crescente, pois tanto a faixa de resistência a antibióticos microbianos em ambientes clínico expande quanto o caminho para o desenvolvimento de novos antibióticos contrai. Este problema é agravado pelo escopo genômico global do resistoma antibiótico, de modo que a resistência a antibióticos abrange um continuum de genes em patógenos encontrados na clínica até aqueles de micróbios ambientais benignos.
[006] Infecções resistentes a múltiplos fármacos (MDR) causadas por bactérias resistentes a antibióticos estão ameaçando nossa capacidade de tratar infecções comuns, causando uma estimativa de 20 bilhões de dólares em custos diretos com cuidados de saúde. O aumento gradual nas taxas de resistência de vários patógenos importantes, incluindo Staphylococcus aureus resistente a meticilina, Enterococcus resistente a a vancomicina, Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos, Acinetobacter baumannii resistente a imipenen e Escherichia coli e Klebsiella pneumonia resistentes a cefalosporina de terceira geração coloca uma séria ameaça à saúde pública. Patógenos produtores de β- lactamase de espectro estendido e MRSA são endêmicos em muitos hospitais em todo o mundo.
[007] Uma solução proposta é a utilização de moléculas baseadas em RNA modificadas por engenharia. Por exemplo, o uso de asRNA como fármacos antibacterianos altamente específicas tem sido amplamente explorado nas últimas décadas. A tecnologia de RNA antissentido (asRNA) emprega a produção de uma molécula de RNA que é complementar e hibridiza com um mRNA alvo. Como resultado da hibridização do asRNA com o mRNA alvo, o mRNA é incapaz de servir como modelo para tradução de proteína, portanto, a interação asRNA-mRNA leva à eliminação ou redução de níveis da proteína codificada de mRNA nas bactérias. Além disso, o mRNA alvo pode ser hidrolisado por RNases, resultando em silenciamento de gene pós-transcricional. Um dos maiores obstáculos para a aplicação prática de asRNA como tratamentos antibacterianos, no entanto, tem sido o modo de produção e distribuição de asRNA para sítios de infecção. O desafio tem sido como produzir e distribuir continuamente quantidades suficientes de asRNA através de um longo período de tempo para silenciar o gene essencial alvo no patógeno a custo muito baixo ou sem custo.
[008] Como tal, existe uma necessidade de uma nova solução para os problemas técnicos e práticos acima mencionados. De fato, os problemas anteriores relativos ao controle de patógenos bacterianos podem representar uma necessidade há muito sentida de uma solução eficaz - e econômica - para os mesmos. Embora elementos de implementação tenham sido disponibilizados, tentativas reais para atender a esta necessidade podem ter faltado até certo ponto. Isto pode ter sido devido a uma falha daqueles versados na técnica em apreciar ou entender completamente a natureza dos problemas e desafios envolvidos. Como resultado desta falta de entendimento, tentativas de atender a estas necessidades há muito sentidas podem ter falhado em resolver efetivamente um ou mais dos problemas ou desafios aqui identificados. Estas tentativas podem mesmo ter desviado das orientações técnicas adotadas pela presente tecnologia inventiva e podem mesmo resultar nas realizações da presente tecnologia inventiva sendo consideradas, até certo ponto, um resultado inesperado da abordagem adotada por alguns no campo. Como será discutido em mais detalhes abaixo, a atual tecnologia inventiva supera as limitações dos sistemas tradicionais de controle de patógeno bacteriano.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] A presente invenção se refere à utilização de bactérias doadoras geneticamente modificadas que podem ser configuradas para produzir certos polinucleotídeos de asRNA que podem direcionar para genes bacterianos específicos e/ou seus produtos (RNA, proteínas) em sistemas de plantas e/ou animais. Estes polinucleotídeos de asRNA podem inibir ou reduzir a expressão de certos genes e/ou causar comprometimento ou degradação de produtos de genes em um agente causador de doença. A invenção pode compreender novas técnicas, sistemas e métodos para controlar bactérias patogênicas, vírus, fungos e/ou protozoários em hospedeiros eucarióticos.
[010] Um objetivo da atual tecnologia inventiva pode incluir novos sistemas, métodos e composições para a regulação transbiótica da expressão de genes bacterianos em uma bactéria patogênica receptora por asRNA. Uma modalidade da invenção pode incluir a expressão eficaz de altos níveis de asRNA em uma espécie de bactéria doadora abrigada no hospedeiro. Em certa modalidade, esta bactéria doadora pode ser uma espécie de bactéria entérica, endofítica e/ou simbiótica geneticamente modificada por engenharia para expressar um ou mais polinucleotídeos de asRNA heterólogos.
[011] Outro objetivo da presente invenção pode incluir a produção de asRNA heterólogo em uma bactéria doadora que pode ainda ser distribuída para uma bactéria aceitadora, mais especificamente uma bactéria patogênica. Estes polinucleotídeos de asRNA heterólogos podem direcionar genes específicos e seus produtos de RNA e/ou proteína que podem ser únicos e/ou restritos a um patógeno bacteriano alvo. Tais polinucleotídeos de RNA heterólogos podem ser totalmente complementares ou conter incompatibilidades em relação aos seus alvos; ambos os aspectos podem induzir a degradação de seus alvos ou prejudicar sua tradução, tornando-os indisponíveis para atingir sua função.
[012] Em ainda outro objetivo da presente invenção pode incluir a supressão de expressão de gene direcionada nas bactérias receptoras, resultando na supressão de populações bacterianas e/ou atividade patogênica das bactérias em um organismo eucariótico hospedeiro.
[013] Outro objetivo da presente invenção pode incluir a geração de um ou mais plasmídeos e/ou cromossomos artificiais bacterianos (BACs) que podem codificar um ou mais polinucleotídeos de asRNA heterólogos. Um objetivo adicional pode incluir integração de elementos dos genes específicos codificando um ou mais asRNA no genoma de um patógeno. Um objetivo adicional da invenção pode ser produzir constructos dos genes que podem produzir moléculas de RNA não codificadoras, tal como os polinucleotídeos de asRNA heterólogos mencionados acima, por um par de promotor/terminador de gene constitutivo, indutível, heterólogo ou homólogo na cepa de bactéria doadora. Ainda outro objetivo da presente invenção pode incluir a coexpressão de certas proteínas ou outros fatores que podem proteger a molécula de RNA não codificante de degradação.
[014] Um objetivo adicional da presente invenção pode incluir o desenvolvimento de cepas bacterianas auxotróficas geneticamente modificadas que podem produzir polinucleotídeos de asRNA heterólogos que podem ainda ser distribuídos mais eficientemente para um patógeno alvo via nanotubos.
[015] Outro objetivo da presente invenção pode incluir novas estratégias de biocontrole para vários organismos, incluindo espécies de animais e plantas adicionais. Outro objetivo da presente invenção pode incluir, em uma modalidade preferida, novas estratégias de biocontrole para populações de aquacultura. Nesta modalidade, a tecnologia inventiva inclui vários mecanismos de reino cruzado para a derrubada de genes patógenos essenciais em animais aquáticos cultivados em sistemas de aquacultura. Isto pode ser conseguido através da introdução de microrganismos engenheirados em populações de animais de aquacultura que expressam polinucleotídeos de asRNA heterólogos específicos que podem infrarregular e/ou suprimir genes essenciais de patógenos selecionados.
[016] Outro objetivo da invenção pode ser a geração de cepa bacteriana simbiótica e/ou probiótica geneticamente modificada que pode expressar um ou mais polinucleotídeos de RNAs heterólogos. Em certas modalidades, bactérias probióticas de camarão, podem ser geneticamente modificadas para expressar uma ou mais moléculas de RNA inibidoras direcionadas a genes de patógenos essenciais, preferencialmente em Vibrio sp.
[017] Outro objetivo da invenção, a presente tecnologia inventiva, pode incluir sistemas e métodos para introduzir polinucleotídeos de asRNA heterólogos em um hospedeiro alvo através de infecção por microrganismos doadores geneticamente modificados. Em uma modalidade, a invenção pode fornecer microrganismos geneticamente engenheirados que podem expressar um ou mais polinucleotídeos de asRNA heterólogos dentro de um organismo alvo e podem ser direcionados para infrarregular a expressão de genes essenciais em um patógeno causador de doença. Tais organismos alvo podem incluir animais aquáticos, animais aquáticos em sistemas de aquacultura, bem como outros animais vertebrados e invertebrados em geral.
[018] Objetivos adicionais da tecnologia inventiva se tornarão evidentes a partir das figuras e descrições aqui contidas aqui abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[019] As figuras anexas, que são incorporadas e fazem parte do relatório descritivo, ilustram uma ou mais modalidades da presente invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção. Os desenhos são apenas para o propósito de ilustrar uma ou mais modalidades preferidas da invenção e não serão interpretados como limitando a invenção. Nas figuras:
[020] Figura 1 - AsRNA inibe fluorescência de GFP. A) Redução de nível de fluorescência em cepa HT-115-pGFP de E. coli cocultivada com cepa HT-27 de E. coli expressando asRNA-GFP em comparação com cocultivo com bactérias expressando asRNA-COP1 (ns) não específicas; B) Redução em nível de fluorescência em cepa Ag1-pAD-43-25 cocultivada com cepa HT-27 de E. coli HT-27 expressando qualquer asRNA-GFP (as-gfp1) em comparação com cocultivo com asRNA-COP (ns) não específico.
[021] Figura 2 - Efeitos potenciais da expressão de bloqueio de asRNA do gene dam. Diminuição em metilação de região de origem/promotora de DnaA leva à interrupção do ciclo de regulação de replicação de DNA e à inibição da divisão celular Vibrio. A repressão da expressão de Dam inibe a formação de biofilme por mecanismos desconhecidos que podem incluir inibição transcricional de promotores de gene específicos, resultando em uma desaceleração do crescimento celular.
[022] Figura 3 - Efeito de cocrescimento de Vibrio com asRNA-Dam expressando AG1 em adequação de Vibrio e formação de biofilme. Bactérias doadoras (Enterobacter Ag1) e aceitadoras (Vibrio RifR) de asRNA foram coinoculadas e crescidas juntas em várias condições. O número de células de bactérias resistentes a rifamicina (Vibrio) foi determinado por plaqueamento de sua diluições em série. A) Cocrescimento com Ag1-asRNADam leva a diminuição de 3 vezes na contagem de células Vibrio em culturas de líquido (N=24); B) Cocrescimento com Ag1-asRNA-Dam leva a diminuição de 1,5 vezes na contagem de células Vibrio na superfície de ágar (N=8); C) Biofilmes formados após 24 h de crescimento em placa de microtítulo foram corados por violeta cristal e pontuados. O cocrescimento com Ag1-asRNA-Dam leva a redução de 2 vezes na formação de biofilme.
[023] Figura 4 - Efeito de cocrescimento de Ag1-asRNA-Dam em metilação de DNA de DNA cromosômico Vibrio. A) Adeninas de DNA de Vibrio são pesadamente metiladas; B) Cocrescimento com asRNA-Dam expressando Ag1 diminui 6mA de teor de DNA Vibrio. Em experimentos de controle Vibrio foram cocultivados com Ag1 expressando RNA não específico, por exemplo, asRNA- GFP; C) Resultados de análise de mudanças em metilação de DNA Vibrio em resposta a cocrescimento com Ag1-asRNA-Dam. Cocrescimento com Ag1- asRNA-Dam leva a 30% de diminuição em 6mA de teor em DNA Vibrio (N=16).
[024] Figura 5 - Cocrescimento de Vibrio com Ag1-asDam resulta em diminuição de 6mA de níveis de metilação de DNA de Vibrio origem de replicação I de cromossomo (oriC). A) Desenho esquemático dos locais de metilação dde dam (DpnI/MboI) nas proximidades do promotor oriC/dnaA. Os fragmentos de PCR usados na análise de qPCR são mapeados abaixo do diagrama oriC. Os oligonucleotídeos utilizados na análise são apresentados na Tabela 4; B) a diminuição do estado de metilação do DNA 6 mA deVibrio oriC na presença de
Dam causa maior clivagem pela enzima de restrição MboI - corta apenas o DNA não metilado - e consequentemente menor acúmulo de amplicons em comparação ao controle (N = 8); C) Por outro lado, o DNA oriC é mais sensível à digestão por DpnI - que corta apenas o DNA metilado 6mA - em amostras de controle como resultado de níveis mais altos de metilação do DNA em comparação com o Vibrio oriC na presença de Ag1-asDam (N = 8).
[025] Figura 6 - Análise qRT-PCR da expressão dos genes dam e dnaA. A) Desenho esquemático de Vibrio dam e do gene dnaA com sítios de produtos de PCR mapeados; B) Especificidade dos oligonucleotídeos utilizados no ensaio para DNA Vibrio ; C) O cocrescimento de Vibrio com Ag1-asDam leva a uma diminuição significativa nos mRNAs de dam e dnaA N = 6).
[026] Figura 7 - A análise qRT-PCR da expressão de dam em Vibrio que vive no intestino de C. elegans alimentado com Ag1-asRNA-Dam ou Ag1-asRNA- GFP mostra redução dos níveis de RNA de dam como resultado da regulação pós-transcricional por asRNA-Dam RNA.
[027] Figura 8 - Cassete e plasmídeo que expressam AsRNA. A) Mapa de plasmídeo que expressa asRNA; B) projeto de cassete que expressa asRNA; C) Estrutura de asRNA hairpina - RNA antisentido asRNA-Dam com asRNA-Dam em laço. A dobra foi realizada pelo aplicativo Mfold no servidor web Mfold.
[028] Figura 9 - Alinhamento de asRNA-dam ao dam mRNA.
[029] Figura 10 - Diagrama que descreve o modo de ação de um asRNA generalizado expresso em uma bactéria manipulada.
[030] Figura 11 - Diagrama da via de detecção de quorum generalizada em Vibrio harveyi.
[031] Figura 12 - Diagrama do sistema CRISPR/Cas9 exemplar. MODO(S) PARA REALIZAR A(S) INVENÇÃO(ÕES)
[032] A presente invenção inclui uma variedade de aspectos, que podem ser combinados de diferentes maneiras para descrever geralmente os novos sistemas, métodos e composições relacionados à regulação transbiótica da expressão de genes bacterianos em uma bactéria patogênica receptora por asRNA expresso e entregue por uma bactéria doadora. As seguintes descrições são fornecidas para listar os elementos e descrever algumas das modalidades da presente invenção. Esses elementos são listados com modalidades iniciais, no entanto, deve-se entender que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicionais. Os exemplos descritos de maneira diversa e modalidades preferidas não devem ser interpretados para limitar a presente invenção apenas aos sistemas, técnicas e aplicações explicitamente descritas. Além disso, esta descrição deve ser entendida para apoiar e abranger as descrições e as reivindicações de todas as várias modalidades, sistemas, técnicas, métodos, dispositivos e aplicativos com qualquer número dos elementos divulgados, com cada elemento sozinho e também com todo e qualquer permutações e combinações de todos os elementos nesta ou em qualquer aplicação subsequente.
[033] A tecnologia inventiva pode compreender sistemas e métodos para controlar a virulência de patógenos bacterianos ou outros patógenos específicos por inativação seletiva de genes patogênicos, essenciais ou outros genes-alvo. Esta inativação genética direcionada pode ser realizada pela expressão e entrega de moléculas de asRNA heterólogas de uma bactéria doadora a um patógeno hospedeiro alvo. Em uma modalidade preferida, uma ou mais espécies ou cepas bacterianas de doadores podem ser geneticamente modificadas para expressar moléculas de asRNA heterólogas que podem atuar para regular e/ou inibir a expressão genética em agentes causadores de doenças alvo.
[034] Como geralmente mostrado na Fig. 10, o asRNA pode incluir uma molécula de RNA de cadeia simples não codificante que pode exibir uma relação complementar com uma fita de RNA mensageiro específica (mRNA) transcrita de um gene alvo. As modalidades adicionais podem incluir asRNA tendo uma ou mais incompatibilidades em relação ao seu mRNA alvo. Independentemente da homologia entre o mRNA e o asRNA, nesta modalidade, o asRNA pode fisicamente emparelhar e se ligar ao mRNA complementar. Esta ligação complementar pode inibir a tradução de um mRNA complementar por emparelhamento de bases das moléculas de RNA e, desse modo, obstruir fisicamente ou dificultar estereotipicamente o mecanismo de tradução.
[035] Deve-se notar que , ao se referir ao asRNA como complementar, significa que o polinucleotídeo para uso na supressão antissentido pode corresponder a todo ou parte do complemento da sequência que codifica o polipeptídeo alvo, todo ou parte do complemento da região não traduzida 3' e/ou 5' do transcrito do polipeptídeo alvo, ou todo ou parte do complemento da sequência de codificação e das regiões não traduzidas de um transcrito que codifica o polipeptídeo alvo. Uma molécula de ácido nucleico complementar é a que é complementar a um transcrito de mRNA de toda ou parte de uma molécula de ácido nucleico alvo. Além disso, o polinucleotídeo antissentido pode ser totalmente complementar (isto é, 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) ou parcialmente complementar (isto é, menos de 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) à sequência alvo.
[036] A supressão antissentido pode ser usada para inibir a expressão de várias proteínas na mesma célula. Além disso, porções dos nucleótidos antissentido podem ser utilizadas para perturbar a expressão da molécula de ácido nucleico alvo. Geralmente, podem ser usadas sequências antissentido de pelo menos 10 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300, 500, 550, 500, 550 ou superior, e qualquer quantidade intermediária. A sequência pode ser complementar a qualquer sequência do RNA mensageiro, ou seja, pode ser proximal ao 5'-terminal ou sítio de capeamento, a jusante do sítio de capeamento, entre o sítio de capeamento e o códon de iniciação e pode cobrir todo ou apenas uma porção da região não codificadora, pode ligar a região não codificadora e codificadora, ser complementar à toda ou parte da região codificadora, complementar ao 3′- terminal da região codificadora ou complementar à região não traduzida 3' do mRNA.
[037] A sequência antissentido pode ser complementar a uma sequência única ou uma sequência repetida, de modo a aumentar a probabilidade de ligação.
Assim, a sequência antissentido pode estar envolvida com a ligação de uma sequência única, uma única unidade de uma sequência repetitiva ou de uma pluralidade de unidades de uma sequência repetitiva. Os métodos de preparação de moléculas de ácido nucleico antissentido são geralmente conhecidos na técnica.
[038] Como tal, em certas modalidades, a presente invenção pode incluir sistemas, métodos e composições para inibir a expressão de uma molécula de ácido nucleico do agente causador da doença ou, em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico do agente causador da doença. Ao se referir à inibição da expressão de um gene alvo, entende-se que a expressão da molécula de ácido nucleico é inibida, interrompida ou de outra forma interferida, de modo que o receptor eucariótico ou o hospedeiro alvo seja protegido da doença. A inibição da expressão de um gene alvo também pode geralmente se referir à tradução da molécula de ácido nucleico sendo inibida, interrompida ou de outra forma interferida com tal que o receptor eucariótico ou o hospedeiro alvo seja protegido da doença. A inibição da expressão de um gene alvo também pode significar que a expressão da molécula de ácido nucleico, como um polinucleotídeo de asRNA, inibe, interrompe ou interfere com a expressão ou tradução de um gene essencial em um patógeno que o receptor eucariótico ou o hospedeiro alvo apresenta taxas de infecção, taxas de transmissão, cargas de patógenos mais baixas ou sintomas de doenças que os hospedeiros WT.
[039] Como observado anteriormente, em uma modalidade, a invenção pode incluir o uso de asRNA que é complementar a uma molécula de ácido nucleico de um gene alvo em um agente causador de doença. RNA antissentido é um RNA que é complementar a um alvo, geralmente um RNA mensageiro (mRNA) de uma molécula de ácido nucleico alvo. Por antissentido pretende-se uma sequência que está em orientação inversa à orientação normal de 5' a 3' da molécula de ácido nucleico alvo. Em uma modalidade preferida, uma bactéria doadora pode ser geneticamente modificada para expressar um asRNA heterólogo. Esta expressão pode ser parte de um vetor de expressão e pode ser parte de um cassete de expressão e pode ainda ser operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle de expressão. Esta bactéria doadora geneticamente modificada pode ser introduzida em um hospedeiro alvo e expressar o asRNA heterólogo alvo que pode ser exportado da bactéria doadora e absorvido no agente causador da doença alvo, que nesta modalidade pode ser uma bactéria patogênica. O asRNA heterólogo, sendo entregue às bactérias patogênicas receptoras, pode impedir a expressão normal da proteína codificada pela molécula de ácido nucleico alvo. Isso pode resultar na interferência no ciclo de vida do agente causador da doença, na capacidade de se replicar e/ou na patogenicidade, proporcionando assim um sistema eficaz de entrega antibacteriana. Nesta modalidade, a bactéria doadora pode ser uma cepa de bactéria simbiótica que pode persistir no hospedeiro alvo e fornecer expressão contínua de asRNA heterólogo, fornecendo assim produção contínua no alvo hospedeiro para combater o agente causador da doença. Em uma modalidade adicional, a bactéria doadora pode ser uma bactéria probiótica ou do tipo probiótico que pode persistir no hospedeiro alvo e expressar e entregar asRNA heterólogo a um patógeno bacteriano receptor por um período de tempo. Desta maneira, exposições múltiplas e sequenciais do hospedeiro alvo a um probiótico ou bactéria do tipo probiótico podem efetivamente fornecer asRNA heterólogo, mas não persistem permanentemente no hospedeiro alvo.
[040] Em outra modalidade preferida, uma bactéria doadora geneticamente modificada pode ser introduzida em um hospedeiro alvo que não foi exposto a um agente causador da doença e pode expressar o asRNA heterólogo direcionado que pode ser exportado da bactéria doadora para o ambiente celular e/ou intracelular do hospedeiro alvo. O asRNA heterólogo, sendo entregue ao hospedeiro receptor, pode atuar como uma vacina profilática, de modo que quando o agente causador da doença alvo, como uma bactéria patogênica, é introduzido no hospedeiro alvo, o asRNA heterólogo impede a expressão normal da proteína codificada pelo molécula de ácido nucleico alvo e pode impedir a capacidade do agente causador da doença de colonizar ou afetar o hospedeiro alvo. Nesta modalidade, a bactéria doadora pode ser uma cepa de bactéria simbiótica que pode persistir no hospedeiro alvo e fornecer expressão contínua de asRNA heterólogo, fornecendo assim s produção contínua de vacina profilática no hospedeiro conferindo um nível de imunidade ao agente causador da doença.
[041] As modalidades adicionais podem incluir inativação genética induzida por asRNA de um, ou uma pluralidade de genes alvo. Por exemplo, em uma modalidade preferida, a inativação de genes pode ser direcionada a um ou mais genes de patógenos que são essenciais para virulência, proteínas de revestimento, atividade metabólica, vias de infecção e/ou produção de energia e semelhantes. Embora fornecido em um modelo exemplar, um gene alvo pode incluir um ou mais genes responsáveis pela patogenicidade de uma bactéria ou pela capacidade de causar uma condição de doença no hospedeiro. Exemplos de tais genes alvo bacterianos também podem incluir um ou mais fatores de virulência. Os fatores de virulência podem ajudar as bactérias a: 1) invadir o hospedeiro, 2) causar doenças e/ou (3) fugir das defesas do hospedeiro. Em uma modalidade preferida, uma cepa ou espécie de bactéria pode ser modificada para expressar asRNA que pode exibir uma relação complementar com uma cadeia de RNA mensageiro específica (mRNA) transcrita de um gene de fator de virulência alvo. Exemplos de tais fatores de virulência podem incluir, entre outros: • Fatores de adesão: Esse grupo pode incluir os genes que ajudam um patógeno bacteriano a aderir a determinadas células; • Fatores de invasão: Esse grupo pode incluir os genes para os componentes da superfície que permitem que a bactéria invada as células hospedeiras; • Cápsulas: Este grupo pode incluir os genes para as cápsulas estruturais que podem proteger as bactérias da opsonização e da fagocitose; • Endotoxinas: Esse grupo pode incluir os genes para vários tipos de lipopolissacarídeos tóxicos que podem provocar uma resposta imune;
• Exotoxinas: Esse grupo pode incluir os genes para vários tipos de toxinas proteicas e enzimas produzidas e/ou secretadas por bactérias patogênicas. As principais categorias incluem citotoxinas, neurotoxinas e enterotoxinas; e • Sideróforos: Este grupo pode incluir os genes para vários tipos de fatores de ligação ao ferro que permitem que algumas bactérias competam com o hospedeiro pelo ferro, que está ligado à hemoglobina, transferrina e lactoferrina.
[042] Em uma modalidade, a invenção pode incluir a identificação de um gene alvo em um agente causador de doença. Nesta modalidade preferida, o gene alvo pode incluir um gene essencial de um agente causador de doença, o que significa que a inibição, interrupção ou interferência na expressão e/ou tradução de um ou mais genes essenciais resulta na redução no número de agentes causadores de doenças, melhoria da patogenicidade do agente causador de doenças, interrupção no ciclo de vida do agente causador de doenças, capacidade de colonizar o hospedeiro eucariótico, evitar uma resposta imune específica ou geral no hospedeiro ou causar um estado de doença.
[043] Em uma modalidade, o asRNA heterólogo, direcionado a uma sequência de ácido nucleico no agente causador da doença que deve ser expresso ou inibido (molécula de ácido nucleico alvo ou gene alvo), pode expressar, inibir ou competir pelos sítios de ligação com qualquer molécula alvo de ácido nucleico como esta que, quando administrada, resulta em proteção ao hospedeiro eucariótico do agente causador da doença.
[044] Em uma modalidade, a invenção pode incluir a geração e entrega de um asRNA heterólogo direcionado a um ou mais genes alvo em Vibrio harveyi por uma bactéria simbiótica doadora. Em uma modalidade preferida, um ou mais genes alvo podem estar envolvidos em mecanismos de detecção de quorum e na formação de biofilmes. (Veja a Fig. 11). Geralmente, a detecção de quorum descreve um sistema de estímulos e resposta correlacionado à densidade populacional bacteriana. A detecção de quorum pode permitir que as bactérias produzam e excretem constantemente moléculas de sinalização de baixo peso molecular, geralmente chamadas de autoindutores (AIs), no ambiente circundante. À medida que o número de bactérias aumenta, aumenta também a concentração de AIs. Em um limiar definido da concentração de AI, a população bacteriana pode expressar uma resposta sincronizada e específica de AI - geralmente um fenótipo, como virulência, produção de luz ou formação de biofilme, que é mais eficaz quando implantado por um grupo de células do que por um único bactéria. Tais respostas de detecção de quorum podem aumentar significativamente a virulência de patógenos bacterianos, além de dificultar a interrupção do crescimento microbiano por meio de antibióticos ou outros meios químicos, como é o caso dos biofilmes bacterianos.
[045] Em uma modalidade específica, pode ser gerado um asRNA que pode ser total ou parcialmente complementar ao mRNA de um ou mais genes que fornecem o mecanismo de detecção de quorum em um patógeno bacteriano alvo. Em uma modalidade preferida, uma espécie ou cepa de bactérias pode ser modificada para produzir um asRNA que pode ser complementar ao mRNA de um ou mais genes de AI no Vibrio, algumas espécies das quais são patógenos conhecidos de camarões e outros hospedeiros animais. Esses genes de AI alvo podem incluir HAI-1, AI-1 e/ou CAI-1. Como também pode ser visto a seguir, os alvos dos genes adicionais envolvidos na via de detecção de quorum de Vibrio harveyi também podem ser alvos com asRNA complementar, como CqsA, LuxM, LuxS e LuxP.
[046] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método para controlar um organismo infectado patogenicamente, o método compreendendo a administração a um organismo hospedeiro alvo, que em uma modalidade preferida pode incluir organismos aquáticos, um agente de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que regula especificamente uma expressão de pelo menos um produto do gene de patógeno alvo essencial, em que a regulação negativa da expressão de pelo menos um produto do gene de patógeno alvo essencial no host alvo torna o hospedeiro alvo protegido do estado de doença causada por patógeno. Em uma modalidade preferida, esse agente de ácido nucleico pode incluir um polinucleotídeo asRNA identificado como SEQ ID NO 1 ou um homólogo e/ou ortólogo do mesmo. As modalidades adicionais podem incluir qualquer ácido nucleico que abranja uma região superior à média da homologia entre os genes alvo essenciais de várias cepas de um patógeno causador de doença. Uma modalidade preferida pode incluir qualquer ácido nucleico que abranja uma região de homologia superior à média entre os genes alvo essenciais, de várias cepas de um Vibrio. No exemplo de um agente causador da doença de Vibrio harveyi , este pode incluir, como mostrado geralmente abaixo na região que codifica o gene dam identificado como SEQ ID NO. 3, entre outros.
[047] Em uma modalidade, a presente invenção inclui a geração de um novo sistema para o controle de patógenos causadores de doenças. A invenção pode incluir especificamente um sistema configurado para fornecer a um hospedeiro infectado por patógeno ou suscetível a patógenos, um ou mais polinucleotídeos de RNA heterólogos configurados para inibir a expressão de um ou mais genes essenciais no referido patógeno. Em uma modalidade, a invenção pode incluir um ou mais microrganismos geneticamente modificados, que podem preferivelmente ser simbióticos e/ou endossimbióticos com um hospedeiro e ainda configurados para fornecer uma ou mais moléculas de RNA heterólogas, como polinucleotídeos de asRNA, a patógenos/agentes causadores de doenças. Em uma modalidade preferida, a invenção pode incluir uma ou mais bactérias simbióticas manipuladas por engenharia genética configuradas para entregar uma ou mais moléculas de asRNA a bactérias patogênicas em um organismo hospedeiro. Em uma modalidade preferida, a invenção pode incluir uma ou mais bactérias simbióticas geneticamente modificadas configuradas para fornecer uma ou mais moléculas de asRNA para bactérias patogênicas em um organismo hospedeiro aquático, como camarão ou outros organismos comumente criados através da aquicultura.
[048] Em outra modalidade preferida, a atual tecnologia inventiva pode estender essa tecnologia a microrganismos simbióticos que persistem nos tecidos, filhos e/ou ovos de um hospedeiro durante todo o seu desenvolvimento e na fase adulta. Dessa maneira, os microrganismos simbióticos geneticamente modificados podem produzir e entregar as moléculas de asRNA continuamente aos patógenos alvo como Vibrio. Isso pode ser usado para tratar uma condição de doença em um hospedeiro já infectado e/ou imunizar uma população suscetível.
[049] A presente invenção pode ainda incluir um ou mais vetores para inibir a expressão de múltiplos genes patógenos, em que o vetor compreende um, ou uma pluralidade de polinucleotídeos asRNA heterólogos, que podem corresponder a um ou mais genes patógenos selecionados. Esta modalidade pode incluir o uso de um sistema de expressão de plasmídeo. Em algumas modalidades, este plasmídeo pode ter um ou mais cassetes de expressão, incluindo: pelo menos uma cassete de supressão de genes contendo um polinucleotídeo operacionalmente ligado a uma(s) sequência(s) de controle de expressão, em que o polinucleotídeo codifica uma molécula de asRNA heteróloga configurada para reduzir a expressão de um gene patogênico alvo, como geralmente descrito aqui.
[050] Uma modalidade preferida da presente invenção inclui um vetor para modular múltiplos genes de patógenos, em que o vetor compreendendo um ou uma pluralidade de asRNAs pode corresponder a um ou mais genes hospedeiros selecionados. Esta modalidade pode incluir o uso de um sistema de expressão de plasmídeo. Em algumas modalidades, este plasmídeo pode ter um ou mais cassetes de expressão, incluindo: pelo menos um cassete de supressão de genes contendo um polinucleotídeo operacionalmente ligado a uma(s) sequência(s) de controle de expressão, em que o polinucleotídeo codifica uma molécula de asRNA heteróloga configurada para reduzir a expressão de um gene patogênico alvo, como geralmente descrito aqui.
[051] A presente invenção também inclui um vetor para inibir a expressão do gene do agente causador da doença em um hospedeiro, em que o vetor compreende pelo menos um cassete de supressão de genes contendo um polinucleotídeo operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão, em que o polinucleotídeo codifica uma molécula de asRNA que reduz a expressão de um gene patogênico alvo no hospedeiro por interferência de RNA. Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o asRNA compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO. 1. Exemplos de promotores adequados para os cassetes de supressão de genes incluem, entre outros, promotor T7, promotor bla, promotor U6, promotor pol II, promotor Ell e promotor CMV e semelhantes. Opcionalmente, cada uma das sequências promotoras dos cassetes promotores de genes e dos cassetes supressores de genes pode ser induzível e/ou específica de tecido.
[052] A molécula de asRNA, nesta modalidade identificada como SEQ ID NO. 1, pode ser parcialmente autocomplementar e, portanto, formar uma estrutura de haste e alça. (Ver Fig. 8C) A região de sentido e a região antissentido do duplex de RNA contêm uma ou mais incompatibilidades, de modo que uma estrutura protuberante ou secundária (como uma estrutura em hairpina) possa ser formada. O duplex de RNA contém na faixa de cerca de 4 a cerca de 23 incompatibilidades de pares de bases nucleotídicas. Mais preferivelmente, o RNA duplex contém na faixa de cerca de 7 a cerca de 9 incompatibilidades de pares de bases nucleotídicas. Em ainda outra modalidade, a alça de asRNA contém na faixa de cerca de 50 a 200 bp, ou 59 alças de comprimento longo e ~ 90 bp.
[053] Em aspectos adicionais, a presente invenção inclui métodos para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais bactérias doadoras geneticamente modificadas que expressam um polinucleotídeo de asRNA heterólogo. Em uma modalidade, esta quantidade terapeuticamente eficaz pode ser a quantidade de bactérias ou a quantidade de polinucleotídeo heterólogo de asRNA expresso por uma bactéria doadora geneticamente modificada que pode ser transportada para fora do doador e absorvida por um patógeno alvo para melhorar, reduzir ou eliminar uma condição de doença.
[054] Em outra modalidade, esta quantidade terapeuticamente eficaz pode ser a quantidade de bactérias geneticamente modificadas ou a quantidade de polinucleotídeo heterólogo de asRNA expresso por um doador de bactérias geneticamente modificadas que podem ser transportadas para fora do doador, de modo que o hospedeiro tenha maior resistência à infecção por um patógeno introduzido posteriormente.
[055] Em outra modalidade, esta quantidade terapeuticamente eficaz pode ser a quantidade de bactérias doadoras geneticamente modificadas que podem colonizar ou se tornar endêmica dentro de uma população de hospedeiros alvo por transferência vertical e/ou horizontal.
[056] Em uma modalidade, a presente invenção pode incluir métodos de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma bactéria geneticamente modificada, configurada para expressar polinucleotídeo de asRNA heterólogo, pode alvejar um gene alvo essencial no Vibrio e pode ser identificada como SEQ ID NO. 1.
[057] Em uma modalidade, a presente invenção pode incluir métodos para o tratamento e/ou prevenção da formação de biofilmes bacterianos. Nesta modalidade, o método pode incluir a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma bactéria geneticamente modificada, configurada para expressar polinucleotídeo de asRNA heterólogo, pode alvejar um gene alvo essencial no Vibrio que está envolvido na produção de biofilme e pode ser identificado como SEQ ID NO. 1.
[058] Em uma modalidade, a presente invenção pode incluir métodos para a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma bactéria geneticamente modificada, configurada para expressar polinucleotídeo de asRNA heterólogo, pode alvejar um gene alvo essencial no Vibrio que está envolvido na metilação do DNA e pode ser identificada como SEQ ID NO. 1.
[059] As modalidades alternativas da presente invenção podem incluir um novo método in vitro e/ou in vivo para selecionar as bactérias simbióticas que podem ser utilizadas em um sistema eficaz de supressão de genes de patógenos. Em particular, outro objetivo da presente invenção pode incluir um novo método in vitro e/ou in vivo para selecionar as bactérias hospedeiras simbióticas que podem ser utilizadas em um sistema eficaz de supressão de genes de patógenos. Essas bactérias hospedeiras simbióticas podem não ser patogênicas aos seres humanos e, além disso, têm cultura, transformabilidade, mobilização de plasmídeos e são capazes de secretar ácidos nucleicos alvo, como asRNA e semelhantes, endêmicas ou capazes de se tornar endêmicas nas populações hospedeiras, dispersíveis, por exemplo, por aerossolização, capazes de sobreviver no ambiente e ser consumidas ou absorvidas pelos hospedeiros em todas as fases da vida, preferivelmente.
[060] Em outro aspecto, a presente invenção inclui os métodos para a produção dos vetores da presente invenção. Ainda em outro aspecto, a presente invenção inclui métodos para produzir os microrganismos transformados ou geneticamente modificados da presente invenção, por exemplo, através da transformação com um plasmídeo recombinante.
[061] Outra modalidade da presente invenção pode incluir uma célula, como um micro-organismo geneticamente modificado, configurado para expressar um agente de ácido nucleico heterólogo, como um asRNA, ou o construto de ácido nucleico, como um plasmídeo, de algumas modalidades da invenção. Em uma modalidade preferida, a presente invenção pode incluir uma bactéria geneticamente modificada, configurada para expressar um polinucleotídeo de asRNA heterólogo. Em uma outra modalidade preferida, o polinucleotídeo heterólogo de asRNA pode ter como alvo um gene alvo essencial no Vibrio e pode ser identificado como SEQ ID NO. 1.
[062] Outra modalidade da presente invenção pode incluir uma célula compreendendo o agente de ácido nucleico isolado, como um asRNA, ou o construto de ácido nucleico, como um plasmídeo, de algumas modalidades da invenção, em que a célula é selecionada do grupo que consiste em um célula bacteriana, célula de algas, bactéria simbiótica e célula de um micro-organismo da superfície da água. De acordo com um aspecto de algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um composto ingerível compreendendo a célula de algumas modalidades da invenção.
[063] Em outra modalidade preferida, uma espécie ou cepa de bactéria pode ser modificada para produzir um asRNA que pode ser complementar ao mRNA que codifica o DNA adenina metilase (Dam) em Vibrio harveyi. Essas bactérias modificadas podem incluir cepas ou espécies que fazem parte da flora normal do camarão e/ou simbiótica e/ou endossimbiótica com um hospedeiro alvo, como camarão ou outros organismos aquáticos. Após a introdução, essas bactérias geneticamente modificadas podem ser absorvidas pelo camarão e se tornar parte da flora normal.
[064] Nesta modalidade, o asRNA expresso em uma bactéria doadora, como E. coli ou Enterobacter, pode suprimir a expressão de dam ou outro gene essencial no Vibrio em um hospedeiro alvo. Em outra modalidade, asRNA-Dam expressa em uma bactéria doadora, identificada como SEQ ID NO. 1, pode diminuir a aptidão do Vibrio e também gerar um declínio pronunciado na formação ou patogênese do biofilme. Conforme detalhado a seguir, a diminuição da aptidão do Vibrio está diretamente relacionada à redução da expressão de Dam nas células de Vibrio receptoras, conforme indicado pela observação de que: 1) o DNA de Vibrio é 30% menos metilado quando cocultivado com bactérias que expressam RNA-Dam; 2) A origem da replicação de Vibrio oriC e o promotor do dnaA, elementos críticos no início da replicação do DNA, foram duas vezes menos metilados do que nos controles não expostos a bactérias que expressam a RNA-Dam; 3) A expressão do gene de Vibrio dam também diminuiu 2 vezes em relação aos controles; 4) A expressão do gene Vibrio dnaA foi reduzida em três vezes em relação aos controles; 5) A expressão do gene Vibrio dam diminuiu 6 vezes quando exposta ao Ag1 de Enterobacter que expressa a asRNA-Dam no organismo animal modelo. Tais resultados demonstram a capacidade da presente invenção de controlar a geração de doenças e biofilmes por produção e entrega direcionadas de asRNA de um doador a uma bactéria receptora em um organismo hospedeiro.
[065] Como observado anteriormente, a entrega de asRNA heterólogo pode ser realizada através da introdução de microrganismos doadores específicos em hospedeiros geneticamente modificados, como bactérias entéricas, endofíticas, simbióticas ou endossimbióticas. Esses microrganismos específicos do hospedeiro geneticamente modificados podem incluir: 1) microrganismos que fazem parte do microbioma bacteriano interno ou externo normal do patógeno alvo; 2) microrganismos que foram modificados para serem capazes de colonizar um animal, planta, tecido, célula ou ambiente hospedeiro alvo; 3) microrganismos que são utilizados como alimento ou fonte de energia pelo hospedeiro alvo; ou 4) microrganismos que foram modificados para colonizar ou persistir temporariamente no hospedeiro alvo, como no caso de um micro- organismo probiótico ou do tipo probiótico, um animal, planta, tecido, célula ou ambiente hospedeiro específico. Como observado anteriormente, em uma modalidade preferida, a bactéria doadora de asRNA heterólogo pode incluir E. coli, bem como a bactéria do gênero Enterobacter. Em outra modalidade preferida, a bactéria doadora de asRNA heterólogo pode incluir uma ou mais bactérias entéricas selecionadas do grupo identificado a seguir na Tabela 5 a seguir. Naturalmente, esses exemplos são não limitantes, como qualquer bactéria capaz e/ou configurada para colonizar estável ou entrar em uma relação simbiótica com o hospedeiro alvo, que pode atuar como uma bactéria doadora.
[066] Em uma modalidade preferida, as bactérias dadoras podem ser transformadas com construtos dos genes criados artificialmente, tais como plasmídeos que podem gerar polinucleótidos de asRNA heterólogos. Tais plasmídeos podem ser construídos para serem transferíveis para outras bactérias através de conjugação e outros meios que podem permitir a distribuição generalizada do construto, em alguns casos. Em certas modalidades, as moléculas de asRNA podem ser codificadas em plasmídeos e/ou BACs sob o controle de um par promotor/terminador de gene constitutivo, indutível, heterólogo ou homólogo nas bactérias doadoras que entregam os polinucleotídeos de asRNA heterólogo. Em uma modalidade adicional, os construtos dos genes para a geração de polinucleotídeos de asRNA heterólogo podem ser integrados no genoma bacteriano da bactéria de entrega ou hospedeira.
[067] Em outra modalidade preferida, um ou mais polinucleotídeos de RNAs heterólogo podem ser entregues a um hospedeiro/população animal alvo através de bactérias doadoras geneticamente modificadas que podem colonizar naturalmente o hospedeiro ou ser configuradas para colonizar o hospedeiro. As bactérias doadoras podem então, em uma modalidade preferida, disseminar os construtos dos genes que expressam os polinucleotídeos de asRNA heterólogos para microrganismos hospedeiros que ocorrem naturalmente e/ou bactérias patogênicas no ambiente circundante. Nesta modalidade, uma vez colonizada no hospedeiro alvo, a transmissão vertical das bactérias modificadas pode ser passada para a progênie do hospedeiro, replicando assim naturalmente a resistência bacteriana patogênica às gerações subsequentes. Além disso, as bactérias modificadas também podem ser transmitidas horizontalmente para a população hospedeira em geral através da distribuição das bactérias modificadas no meio ambiente como lixo. Tal característica pode permitir a administração única ou pelo menos periódica das bactérias geneticamente modificadas no hospedeiro e/ou no ambiente do hospedeiro, gerando uma vantagem comercial significativa.
[068] A tecnologia inventiva pode ainda compreender métodos e técnicas para controlar os níveis e o tempo da expressão de polinucleotídeos de asRNA heterólogos nas bactérias doadoras. Em uma modalidade preferida, a expressão de um ou mais polinucleótidos de asRNA heterólogos pode estar sob o controle de uma nova troca de genes. Essa troca de genes pode ser controlada por uma molécula de troca, que pode ser uma molécula solúvel em água e de grau alimentar que pode ser adicionada ao ambiente do organismo do hospedeiro ou a um suprimento de alimentos. A presença desta molécula de troca pode ser ativada, por exemplo produção de asRNA heterólogo. Na sua ausência, a produção de asRNA pode não ocorrer ou apenas ocorrer em níveis desprezíveis.
[069] Em certas modalidades, uma bactéria doadora simbiótica ou específica do hospedeiro pode incluir uma ou mais das seguintes características: 1) uma bactéria predominante no microbioma do hospedeiro alvo, por exemplo, na flora intestinal de um hospedeiro alvo; 2) cultivável fora do hospedeiro, por exemplo, em um fermentador; 3) nenhum impacto ambiental ou de saúde adverso conhecido nos organismos não visados; 4) capaz de ser geneticamente modificado para expressar de maneira estável as moléculas de asRNA heterólogo em quantidades suficientes para inibir a replicação do gene alvo, em pelo menos um, mas preferivelmente todos os estágios de vida do ciclo de vida do hospedeiro; e 5) configurada em construtos dos genes que podem ser mobilizados em outras bactérias dentro do hospedeiro.
[070] As modalidades adicionais da presente invenção podem incluir métodos e sistemas para otimizar a eficácia dos polinucleotídeos de asRNA heterólogos. Em uma modalidade preferida, o asRNA pode ser coexpresso e/ou fundido com proteínas chaperonas para proteger as moléculas de RNA da degradação. As modalidades preferidas adicionais podem incluir a coexpressão e/ou fusão de marcadores/porções de secreção que podem facilitar a secreção e/ou absorção de polinucleotídeos de asRNA heterólogos, aumentando sua eficácia.
[071] Endoribonucleases, exoribonucleases e degradossomas de RNA bacterianas podem degradar as moléculas de RNA não codificadoras, como RNA ou gRNA. Em uma modalidade, a tecnologia inventiva pode incluir modificação das bactérias de entrega previamente identificadas para ter a expressão reduzida ou função ou atividade inativada dessas famílias de proteínas. Esta diminuição ou inativação na expressão e/ou atividade pode inibir ou diminuir a degradação de espécies de RNA não codificadoras de fita simples. Em uma modalidade preferida, as bactérias específicas do hospedeiro previamente identificadas podem ser geneticamente modificadas para expressar eficientemente os polinucleotídeos de asRNA heterólogos em um fundo deficiente em endoribonuclease, exoribonuclease e/ou degradossomas de RNA. Em uma modalidade preferida, uma bactéria dadora pode não ter ou ter a função de RNase III degradada. Nesta modalidade preferida, estes genes de degradação de moléculas de TNA não codificantes podem ser eliminados por recombinação homóloga ou por outros métodos apropriados.
[072] Outra modalidade da tecnologia inventiva pode incluir sistemas e métodos para facilitar a superexpressão de genes bacterianos específicos do hospedeiro conhecidos por melhorar a estabilização e/ou mobilização de moléculas de RNA não codificantes, como asRNA e/ou gRNA, bem como a mobilização e disseminação de seus construtos dos genes subjacentes, como plasmídeos. Nesta modalidade preferida, um ou mais genes conhecidos por estabilizarem asRNA ou mobilizarem os construtos dos genes, tais como plasmídeos podem ser superexpressos para melhorar a sua vida útil e facilitar o movimento no organismo/célula/tecido hospedeiro.
[073] Outra modalidade preferida da presente invenção pode ser o fornecimento de bactérias endofíticas e ectofíticas de folhas e raízes que ainda podem ser geneticamente modificadas para expressar moléculas de RNA não codificadoras, como asRNA e gRNA. Exemplos não limitantes de bactérias endofíticas geneticamente modificadas podem incluir os nos subfilos: Acidobacteria, Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Armatimonadetes, Bacteriodes, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Firmicutes, Grammaproteobacteria e TM7. Em uma modalidade preferida, as bactérias ectofíticas podem ser transformadas com construtos dos genes criados artificialmente, tais como plasmídeos que podem gerar os polinucleótidos de asRNA. Novamente, esses plasmídeos podem ser construídos para serem transferíveis para outras bactérias através de conjugação que pode permitir inoculação ambiental generalizada em alguns casos.
[074] Em outra modalidade, as moléculas de RNA não codificantes, como polinucleotídeos de asRNA heterólogos, podem ser entregues por bactérias modificadas e/ou geneticamente modificadas que induzem a formação de conexões intracelulares, especialmente em condições ambientais não ideais ou onde certos nutrientes essenciais estão ausentes no ambiente circundante. Dessa maneira, as bactérias podem formar nanotubos para trocar nutrientes, material do gene e outros sinais químicos entre as células conectadas e, assim, ajudar a distribuir funções metabólicas nas comunidades microbianas. Nesta modalidade, as bactérias auxotróficas podem ser geneticamente modificadas para induzir a formação de nanotubos que podem permitir a disseminação direta de asRNA de bactérias doadoras para bactérias alvo ou receptoras. Em outra modalidade, as bactérias auxotróficas podem ser geneticamente modificadas para induzir a formação de nanotubos que podem permitir a disseminação de construtos dos genes que codificam para o asRNA para atingir as bactérias que não possuem o construto do gene artificial. Nessa configuração, sob certas condições ambientais ou deficientes em nutrientes, as bactérias de entrega podem disseminar asRNA e/ou os construtos dos genes, como plasmídeos, que codificam um asRNA para outras bactérias na comunidade. Essa ação pode ajudar a prejudicar a expressão de genes alvo específicos em uma grande população de bactérias patogênicas.
[075] Nesta modalidade, esses construtos dos genes podem incluir porções de regulação de transcrição, como promotores, terminadores, coativadores e correpressores e elementos de controle semelhantes que podem ser regulados em sistemas procarióticos, e também eucarióticos. Tais sistemas podem permitir o controle do tipo, tempo e quantidade de polinucleotídeos heterólogos de RNAs, ou outras moléculas de RNA não codificantes, expressas no sistema. As modalidades adicionais podem incluir construtos dos genes que podem ser induzidos por fatores externos, como a presença de uma proteína ou composto específico dentro de uma célula, como proteínas relacionadas ao estresse geradas em resposta a um patógeno ou mesmo as proteínas e outros compostos precursores gerados por patógenos e semelhantes.
[076] Em outra modalidade preferida, a presente tecnologia inventiva pode incluir sistemas e métodos pelos quais bactérias endofíticas e ectofíticas transformadas geneticamente em folhas e raízes que geram uma ou mais moléculas de RNA não codificantes, tais como polinucleotídeos heterólogos de RNA, podem ser entregues a filos vegetais e/ou espécies em que as moléculas de RNA não codificantes podem ser transferidas para bactérias patogênicas e inativar e/ou extinguir a expressão dos genes patogênicos alvo. Em certas modalidades, a seleção de microrganismos, como bactérias que são conhecidos por serem específicos de um filo ou mesmo uma certa espécie, pode ser utilizada. Em outra modalidade, a ativação transcricional e a promoção de moléculas de RNA não codificantes podem depender da presença de certos fatores que podem ser específicos para um filo, ou mesmo para uma determinada espécie de planta ou herbívoro. Por exemplo, em certa modalidade, o RNA não codificante, como as moléculas de asRNA, pode ser codificado em plasmídeos e/ou BACs, sob o controle de um par constitutivo, indutível, heterólogo ou par de gene promotor/terminador homólogo nas bactérias endofíticas ou exofíticas que entregam as moléculas. Em uma modalidade adicional, os construtos dos genes para a geração de asRNA podem ser integradas no genoma bacteriano do doador, hospedeiro que ocorre naturalmente e/ou bactérias patogênicas alvo.
[077] Em certas modalidades, as bactérias endofíticas ou entéricas podem ser geneticamente modificadas para produzir moléculas de RNA não codificantes, como polinucleotídeos heterólogos de asRNA, que podem ter como alvo genes específicos que conferem resistência a determinadas bactérias patogênicas. No caso de uma doença, uma molécula de RNA não codificante pode interferir com um ou mais genes alvo relacionados à patogenicidade bacteriana, bem como genes que conferem resistência ao fármaco. Nesta modalidade, o tratamento de patógenos bacterianos em sistemas vegetais e animais pode ser realizado através da ação das bactérias simbióticas produzindo polinucleotídeos heterólogos de asRNA e/ou gRNA que interrompem um ou mais genes associados apenas ao MDR ou em conjunto com antibióticos tradicionais ou outros compostos farmacológicos. Exemplos de alvos dos genes relacionados à MDR em bactérias patogênicas são fornecidos na Tabela 6 a seguir. Exemplos de patógenos animais que podem ser direcionados com a presente tecnologia inventiva estão incluídos na Tabela 7 a seguir. Essas listas são apenas exemplares e não devem ser interpretadas como limitantes de forma alguma.
[078] Como observado anteriormente, em uma modalidade preferida, um ou mais polinucleotídeos de asRNA heterólogos podem ser entregues a um hospedeiro/população alvo de camarão através de bactérias geneticamente modificadas que podem naturalmente, ou ser configuradas para, colonizar e/ou ser simbióticas com o camarão. Nesta modalidade, uma vez colonizada no hospedeiro, a transmissão vertical das bactérias modificadas pode ser passada para a progênie do hospedeiro, replicando assim naturalmente a resistência patogênica às gerações subsequentes. Em certas modalidades, as bactérias geneticamente modificadas que expressam um ou mais polinucleotídeos de asRNA heterólogos podem colonizar um camarão ao longo de seu ciclo de vida. Por exemplo, uma bactéria doadora geneticamente modificada que expressa um ou mais polinucleotídeos de RNAs heterólogos pode colonizar um camarão enquanto ele é: um ovo, um nauplius, um protozoário, um mysis, estágio pós- larval ou um adulto. Nesta modalidade, as bactérias colonizadas podem expressar polinucleotídeos de asRNA heterólogos, que podem ser direcionados para serem expressos e transportados da bactéria doadora e absorvidos por uma bactéria patógena receptora e inibem a expressão ou um ou mais genes essenciais. Além disso, essas bactérias colonizadas, que se tornam permanente e/ou temporariamente parte do microbioma natural do hospedeiro, podem entregar continuamente os polinucleotídeos de asRNAs heterólogos, em um caso através do intestino, desde os estágios larvais mais antigos até o estágio adulto, fornecendo sobreregulação de mRNA específico para o patógeno de genes patógenos essenciais ao longo do ciclo de vida do hospedeiro. Além disso, como o vetor bacteriano doador pode ser uma parte já natural do microbioma do hospedeiro, sua presença pode não representar nenhum risco para o organismo, o ambiente ou os consumidores finais.
[079] A tecnologia inventiva pode incluir métodos e técnicas para a geração de bactérias específicas do hospedeiro e, em particular, bactérias entéricas ou simbióticas específicas do hospedeiro que podem atuar como um vetor de doador apropriado para polinucleotídeos de asRNA heterólogos direcionados a patógenos bacterianos que afetam organismos aquáticos. Como um modelo exemplar, o camarão pode ser utilizado como hospedeiro alvo. No entanto, como pode ser compreendido por um versado na técnica, esses métodos e técnicas podem ser aplicados a uma variedade de organismos diferentes.
[080] O termo "aquicultura", conforme usado aqui, inclui o cultivo de organismos aquáticos sob condições controladas.
[081] O termo "organismo aquático" e/ou "animal aquático", conforme usado aqui, inclui organismos cultivados em água, seja água doce ou salgada. Os organismos /animais aquáticos incluem vertebrados, invertebrados, artrópodes, peixes, moluscos, incluindo camarão (por exemplo, camarão penaeid, Penaeus esculentu, Penaeus setiferus, Penaeus stylirostris, Penaeus occidentalis, Penaeus japonicus, Penaeus vannamei, Penaeus monodon, Penaeus chinensis, Penaeus aztecus, Penaeus duorarum, Penaeus indicus e Penaeus merguiensis, Penaeus californiensis, Penaeus semisulcatus, Penaeus monodon, camarãode água salgada, camarão de água doce, etc.), caranguejos, ostras, vieiras, amêijoas de camarão, peixe cartilaginoso (por exemplo, pargo, truta, robalo, etc.) robalo, tilápia, peixe-gato, salmonídeos, carpas, peixes-gato, savelhas, peixes- carpa, tambor vermelho, etc.), crustáceos, entre outros. Camarão inclui camarão criado na aquicultura também.
[082] O termo "probiótico" se refere a um micro-organismo, como bactérias, que podem colonizar um hospedeiro por um período de tempo suficiente para desviar uma quantidade terapêutica ou eficaz de um polinucleotídeo de asRNA heterólogo. Um probiótico pode incluir bactérias endossimbióticas ou flora natural que pode colonizar permanentemente temporariamente um animal, como um organismo aquático. Os organismos probióticos também podem incluir algas e fungos, como leveduras.
[083] Exemplos específicos de vetores bacterianos incluem bactérias (por exemplo, cocos e bastonetes), algas filamentosas e detritos. As modalidades específicas de células de vetores bacterianos transformáveis que podem ser endógenas através de todos os ciclos de vida do hospedeiro podem incluir todas as listadas aqui. As modalidades adicionais podem incluir uma ou mais cepas bacterianas selecionadas dos exemplos aqui listados. Naturalmente, essa lista não é exclusiva e é meramente exemplar de certas modalidades preferidas de cepas bacterianas paratransgênicas.
[084] A presente invenção pode incluir novos sistemas e métodos para a expressão de gRNA em uma espécie ou cepa bacteriana de doador simbiótico que pode ser utilizada pelo sistema CRISPR/Cas9 para interromper os genes alvo em bactérias patogênicas que expressam genes CRISPR/Cas9. Geralmente, o CRISPR/Cas9 pode ser usado para gerar um gene alvo nocauteado ou perturbado coexpressando um gRNA específico para o gene a ser alvejado e a endonuclease Cas9. Geralmente referindo-se à Fig. 12, o CRISPR pode consistir em dois componentes: gRNA e uma endonuclease não específica associada ao CRISPR (Cas9). O gRNA pode ser um RNA sintético curto composto por uma sequência de andaime que pode permitir a ligação de Cas9 e um espaçador de ∼20 nucleotídeos ou sequência de direcionamento que define o alvo genômico a ser modificado. Em uma modalidade preferida, as bactérias exemplares, como bactérias simbióticas e endossimbióticas podem ser geneticamente modificadas para produzir um ou mais gRNAs direcionados à sequência genética de um gene patogênico ou outro gene alvo e que podem se associar à endonuclease Cas9 de ocorrência natural da bactéria alvo. Em outra modalidade preferida, as bactérias exemplares, como as bactérias endofíticas e/ou entéricas, podem ser geneticamente modificadas para produzir um ou mais gRNAs que são direcionados à sequência genética de um gene patogênico ou outro gene alvo e que podem se associar à endonuclease Cas9 de ocorrência natural da bactéria alvo.
[085] Como usado aqui, o termo "RNA antisentido" ou "asRNA" se refere a um agente RNAi que é um oligonucleotídeo de fita simples. Em um asRNA típico, a cadeia simples é complementar a todo ou parte do mRNA alvo. A complementaridade de um asRNA pode ser com qualquer parte do transcrito do gene específico, isto é, na sequência não codificante 5', na sequência não traduzida 3', nos íntrons ou na sequência codificante. O asRNA pode ser introduzido em uma célula para inibir a tradução de um mRNA complementar por emparelhamento de bases com ele e obstruir fisicamente a máquina de tradução. O RNA antisentido emparelha a uma sequência alvo de mRNA complementar e a tradução da sequência alvo de mRNA é interrompida como resultado do impedimento estérico seja do acesso ao ribossomo ou da leitura ribossômica. O mecanismo de RNA antisentido é diferente da interferência de RNA (RNAi), um processo relacionado no qual fragmentos de RNA de fita dupla (dsRNA, também chamados de pequenos RNAs interferentes (siRNAs)) desencadeiam o silenciamento de genes mediado cataliticamente, geralmente direcionando o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) para se ligar e degradar o mRNA. O recozimento de uma fita da molécula de asRNA em mRNA ou DNA pode resultar em rápida degradação do RNA duplex, RNA híbrido/DNA duplex ou RNA duplex semelhante ao tRNA precursor por ribonucleases na célula ou pela clivagem do RNA alvo pelo composto antisentido em si.
[086] Como aqui utilizado, o Vibrio é um gênero de bactérias anaeróbicas facultativas Gram-negativas que possuem uma forma de bastão curvo, com Vibrio sp. indicando uma espécie do gênero Vibrio. Em algumas modalidades, Vibrio sp. pode compreender qualquer uma ou mais das seguintes espécies de Vibrio e em todas as combinações possíveis: adaptatus, aerogenes, aestivus, aestuarianus, agarivorans, albensis, alfacsensis, alginolyticus, anguillarum, areninigrae, artabrorum, atlanticus, atypicus, azureus, brasiliensis calviensis, campbellii, casei, chagasii, cólera, cincinnatiensis, coralliilyticus,
crassostreae, cyclitrophicus, diabolicus, diazotrophicus, ezurae, fischeri, fluvialis, fortis, furnissii, gallicus, gazous, gigantis, haliótico, harioti, hepaticápolis, harioti ichthyoenteri, indicus, kanaloae, lentus, litoralis, logei, mediterranei, metschnikovii, mimicus, mytili, natriegens, navarrensis, neonates, neptunius, nereis, nigripulchritudo, ordalii, orientalis, pacinii, parahaicolyusus, pectenicidae, pectenicidae, pectenicidae rotiferianus, ruber, rumoiensis, salmonicida, scophthalmi, splendidus, superstes, tapetis, tasmaniensis, tubiashii, vulnificus, wodanis e xuii.
[087] Como aqui utilizada, a frase "hospedeiro" ou "hospedeiro alvo" se refere a um organismo ou população portadora de um patógeno causador de doença ou um organismo ou população suscetível a um patógeno causador de doença. Um "hospedeiro" ou "hospedeiro alvo" pode ainda incluir um organismo ou população capaz de transportar um patógeno causador de doença.
[088] Conforme usado neste documento, os termos "controle" e/ou "biocontrole" se referem a reduzir e/ou regular a progressão e/ou transmissão de patógenos/doenças.
[089] Como usado aqui, "vacina" se refere a composições que resultam em imunizações ativas e passivas. Tanto os polinucleotídeos quanto os seus produtos dos genes expressos são aqui referidos como vacinas. Uma alimentação incluindo uma bactéria tratada configurada para expressar um polinucleotídeo de RNA heterólogo também pode ser uma vacina. A alimentação com ração tratada a um animal pode ser uma vacinação.
[090] Conforme usado neste documento, a frase "alimento para animais" se refere ao material de consumo animal introduzido como parte do regime de alimentação ou aplicado diretamente à água no caso de animais aquáticos. Uma "ração tratada" se refere a uma ração tratada com uma bactéria tratada configurada para expressar uma bactéria interferente.
[091] O termo "ácido nucleico", conforme usado aqui, se refere a um polímero de ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Tipicamente, os polímeros de "ácido nucleico" ou de "agente de ácido nucleico" ocorrem na forma de fita simples ou dupla, mas também são conhecidos por formar estruturas compreendendo três ou mais fitas. O termo "ácido nucleico" inclui polímeros de ácido nucleico de ocorrência natural, bem como ácidos nucleicos compreendendo análogos de nucleotídicos conhecidos ou resíduos ou ligações modificadas da cadeia principal, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e que são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de referência. Análogos exemplares incluem, entre outros, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, fosfonatos quirometil metil, 2-O- metil ribonucleotídeos e ácidos nucleicos peptídicos (PNAs). "DNA", "RNA", "polinucleotídeos", "sequência de polinucleotídeos", "oligonucleotídeo", "oligonucleotídeo", "nucleotídeo", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "sequência de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico" e "fragmento de ácido nucleico isolado” são aqui utilizados indiferentemente.
[092] O termo "recombinante" quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, organismo, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificada pela introdução de um ácido nucleico heterólogo ou proteína ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativo ou a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes podem expressar genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante ou do tipo selvagem) da célula ou expressar genes nativos que de outra forma são anormalmente expressos, superexpressos, subexpressos ou não expressos de forma alguma.
[093] Os termos "geneticamente modificados", "biotransformados", "transgênicos", "transformados", "transformação" e "transfecção" têm significado semelhante a "recombinantes". "Transformação", "transgênico" e "transfecção" se referem à transferência de um polinucleotídeo para o genoma de um organismo hospedeiro ou para uma célula. Essa transferência de polinucleotídeos pode resultar em herança geneticamente estável dos polinucleotídeos ou nos polinucleotídeos que permanecem extracromossômicos
(não integrados ao cromossomo da célula). A herança geneticamente estável pode potencialmente exigir que o organismo ou célula transgênica seja submetido, por um período de tempo, a uma ou mais condições que exijam a transcrição de parte ou de todo o polinucleotídeo transferido para que o organismo ou célula transgênica viva e/ou cresça. Os polinucleotídeos que são transformados em uma célula, mas não estão integrados no cromossomo do hospedeiro, permanecem como um vetor de expressão dentro da célula. Pode ser necessário crescer a célula sob certas condições ambientais ou de crescimento para que o vetor de expressão permaneça na célula ou na progênie da célula. Além disso, para que a expressão ocorra, o organismo ou célula pode precisar ser mantido sob certas condições. Os organismos ou células hospedeiras contendo o polinucleotídeo recombinante podem ser referidos como organismos ou células “transgênicos” ou “transformados” ou simplesmente como “transformantes”, bem como organismos ou células recombinantes.
[094] O termo "vetor" se refere a alguns meios pelos quais DNA, RNA, uma proteína ou polipeptídeo podem ser introduzidos em um hospedeiro. Os polinucleotídeos, proteínas e polipeptídeos que devem ser introduzidos em um hospedeiro podem ser de natureza terapêutica ou profilática; podem codificar ou ser um antígeno; podem ser de natureza regulatória; etc. Existem vários tipos de vetores, incluindo vírus, plasmídeo, bacteriófagos, cosmídeos e bactérias.
[095] Um "vetor de expressão" é um ácido nucleico capaz de se replicar em uma célula ou organismo hospedeiro selecionado. Um vetor de expressão pode se replicar como uma estrutura autônoma ou, alternativamente, pode integrar- se, no todo ou em parte, aos cromossomos da célula hospedeira ou aos ácidos nucleicos de uma organela ou pode ser usado como uma lançadeira para entregar DNA estranho às células e assim replicar junto com o genoma da célula hospedeira. Assim, os vetores de expressão são polinucleotídeos capazes de se replicar em uma célula hospedeira, organela ou organismo selecionado, por exemplo, um plasmídeo, vírus, cromossomo artificial, fragmento de ácido nucleico e para os quais certos genes no vetor de expressão (incluindos genes de interesse) são transcritas e traduzidas em um polipeptídeo ou proteína dentro da célula, organela ou organismo; ou qualquer construto adequado conhecido na técnica, que compreende um "cassete de expressão". Por outro lado, como descrito nos exemplos deste documento, um "cassete" é um polinucleotídeo contendo uma seção de um vetor de expressão desta invenção. O uso do cassete auxilia na montagem dos vetores de expressão. Um vetor de expressão é um replicon, como plasmídeo, fago, vírus, vírus quimérico ou cosmídeo, e que contém a sequência de polinucleotídeos desejada operacionalmente ligada à(s) sequência(s) de controle de expressão.
[096] Uma sequência de polinucleotídeo é "operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão" (por exemplo, um promotor e, opcionalmente, um intensificador) quando a sequência de controle de expressão controla e regula a transcrição e/ou tradução dessa sequência de polinucleotídeo. Conforme usado aqui, a frase "produto do gene" se refere a uma molécula de RNA ou uma proteína. Além disso, o termo "gene" pode às vezes se referir à sequência genética, ao mRNA transcrito e possivelmente modificado desse gene ou à proteína traduzida desse mRNA.
[097] Os presentes ensinamentos contemplam o direcionamento de homólogos e ortólogos de acordo com as espécies patogênicas selecionadas, por exemplo, espécies de Vibrio. Sequências homólogas incluem sequências ortólogas e paralógicas. O termo "parálogo" se refere a duplicações de genes no genoma de uma espécie que leva a genes parálogos. O termo "ortólogo" se refere a genes homólogos em diferentes organismos devido à relação ancestral. Assim, os ortólogos são contrapartes evolutivas derivadas de um único gene ancestral no último ancestral comum de duas espécies (Koonin EV and Galperin MY (Sequence - Evolution - Function: Computational Approaches in Comparative Genomics. Boston: Kluwer Academic; 2003. Capítulo 2, Evolutionary Concept in Genetics and Genomics. Disponível em: www. ncbi. nlm. nih. gov/books/NBK20255/) e, portanto, tem grande probabilidade de ter a mesma função. Como tal, os ortólogos geralmente desempenham um papel semelhante ao das espécies originais de outras espécies.
[098] A homologia (por exemplo, porcentagem de homologia, identidade de sequência + semelhança de sequência) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia que calcule um alinhamento de sequência em pares. Como usado aqui, "identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo inclui referência aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas. Quando o percentual de identidade de sequência é usado em referência a proteínas reconhece-se que as posições do resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substituições conservativas de aminoácidos, em que os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Onde as sequências diferem nas substituições conservadoras, a identidade percentual da sequência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. As sequências que diferem por tais substituições conservadoras são ditas para terem "similaridade das sequência" ou "similaridade". Os meios para realizar este ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Normalmente isso envolve marcar uma substituição conservadora como uma incompatibilidade parcial e não completa, aumentando assim a identidade da sequência percentual. Assim, por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe uma pontuação de 1 e uma substituição não conservadora recebe uma pontuação zero, uma substituição conservadora recebe uma pontuação entre zero e 1. A pontuação das substituições conservadoras é calculada, por exemplo, de acordo com o algoritmo de Henikoff S e Henikoff JG. [Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89 (22): 10915-9].
[099] De acordo com uma modalidade específica, as sequências de homólogos são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mesmo idênticas às sequências (sequências de ácido nucleico ou aminoácido) fornecidas aqui. Sequências homólogas de qualquer uma das SEQ ID Nos 1-4 entre 50% a 99% podem ser incluídas em certas modalidades da presente invenção.
[0100] A expressão de sobrerregulação de um produto do gene de patógeno pode ser monitorada, por exemplo, por detecção direta de transcritos de genes (por exemplo, por PCR), por detecção de polipeptídeo(s) codificado(s) pelo gene (por exemplo, por Western blot ou imunoprecipitação), por detecção da atividade biológica de polipeptídeos codificados pelo gene (por exemplo, atividade catalítica, ligação a ligantes e semelhantes) ou por monitoramento de alterações no hospedeiro (por exemplo, motilidade reduzida do hospedeiro etc.). Adicional ou alternativamente, a expressão da sobrerregulação de um produto do gene de patógeno pode ser monitorada medindo os níveis de patógeno (por exemplo, níveis bacterianos etc.) no hospedeiro em comparação com um hospedeiro do tipo selvagem (isto é, controle) não tratado pelos agentes da invenção.
[0101] Como usado aqui, o termo "moléculas de RNA interferentes" ou "RNA interferente" se refere a um polinucleotídeo de RNA que é capaz de inibir ou "silenciar" a expressão de um gene alvo em um patógeno. Em certas modalidades, uma "molécula de RNA interferente" ou "RNA interferente" pode incluir um asRNA ou asRNA heterólogo. A sequência inibidora de RNA pode ser maior que 90% idêntica ou mesmo 100% idêntica à porção do transcrito do gene alvo. Alternativamente, a região duplex do RNA pode ser definida funcionalmente como uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma porção do transcrito do gene alvo sob condições rigorosas (por exemplo, NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, hibridação em 60 graus C por 12 libras horárias; seguido de lavagem). O comprimento das sequências de nucleotídeos de cadeia simples complementares ao transcrito do gene alvo pode ser pelo menos cerca de 18, 19, 21, 25, 50, 100, 200, 300, 300, 400, 491, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000 ou mais bases. Em algumas modalidades da invenção, o comprimento da sequência de nucleotídeos de fita dupla é aproximadamente de cerca de 18 a cerca de 530, ou mais, nucleotídeos de comprimento.
[0102] Deve-se notar que o asRNA pode ser definido em termos da sequência de ácido nucleico do DNA que codifica o transcrito do gene alvo e entende-se que uma sequência de asRNA correspondente à sequência de codificação de um gene compreende um complemento de RNA da sequência de codificação do gene ou outra sequência do gene que é transcrita no RNA.
[0103] Por exemplo, para silenciar a expressão de um mRNA de interesse, a síntese do asRNA adequado para uso com algumas modalidades da invenção pode ser selecionada como se segue. Primeiro, a sequência de mRNA é digitalizada, incluindo o 3'UTR e o 5'UTR. Segundo, a sequência de mRNA é comparada a um banco de dados genômico apropriado usando qualquer software de alinhamento de sequência, como o software BLAST disponível no servidor NCBI (wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST /). As regiões putativas na sequência de mRNA que exibem homologia significativa com outras sequências de codificação são filtradas. As sequências alvo qualificadas são selecionadas como modelos para a síntese de asRNA. As sequências preferidas são as que têm pouca homologia com outros genes do genoma para reduzir um efeito "fora do alvo".
[0104] Será compreendido que o agente de silenciamento de RNA de algumas modalidades da invenção não precisa se limitar às moléculas contendo apenas RNA, mas abrange ainda nucleotídeos e não nucleotídeos quimicamente modificados.
[0105] De acordo com uma modalidade, o asRNA tem como alvo específico um gene selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO. 3 ou uma variante do seu homólogo.
[0106] Como usado aqui, o termo "heterólogo" se refere a exógenos, que não ocorrem naturalmente dentro de uma célula nativa do doador, hospedeiro, patógeno ou em uma célula na qual o asRNA é introduzido (como por posição de integração ou sendo encontrado não naturalmente dentro da célula).
[0107] De acordo com uma modalidade específica, o vetor para o polinucleotídeo de asRNA heterólogo ou doador é uma bactéria. Em outras modalidades, o doador é uma célula de algas. Várias espécies de algas podem ser usadas de acordo com os ensinamentos da invenção, uma vez que são uma parte significativa da dieta para muitos tipos de hospedeiros que se alimentam oportunisticamente de microrganismos, bem como de pequenos animais aquáticos, como rotíferos. Exemplos de algas que podem ser usadas de acordo com os presentes ensinamentos incluem, entre outras, algas verde-azuladas e algas verdes. Especificamente, Actinastrum hantzschii, Ankistrodesmus falcatus, Ankistrodesmus spiralis, Aphanochaete elegans, Chlamydomonas sp. , Chlorella ellipsoidea, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella variegate, Chlorococcum hypnosporum, Chodatella tisisisisina, Closterium acis, Closterium acis , Cosmarium botrytis, Desmidium swartzii, Eudorina elegans, Gloeocystis gigas, Golenkinia minutissima, Gonium multicoccum, Nannochloris oculata, Oocystis marssonii, Oocystis minuta, Oocystis pusilla, Palmella texensis, Pandorina simplis, Pandorina piedra, Paulschulzia gelatinosa, Polyedriopsis spinulosa, Pseudococcomyxa adhaerans, Quadrigula closterioides, Radiococcus nimbatus, Scenedesmus basiliensis, Spirogyra pratensis, Staurastrum gladiosum, Tetraedron bitridens, Trochiscia hystrix. Anabaena catenula, Anabaena spiroides, Chroococcus turgidus, Cylindrospermum licheniforme, Bucapsis sp. (U. Texas No. 1519), Lyngbya spiralis, Microcystis aeruginosa, Nodularia spumigena, Nostoc linckia, Oscillatoria lutea, Phormidiumfaveolarum, Spinilina platensis.
[0108] Em uma modalidade adicional, uma composição incluindo uma bactéria geneticamente modificada configurada para expressar asRNA pode ser formulada como um grânulo ou pó dispersível em água que pode ainda ser configurado para ser disperso no ambiente. Ainda em uma outra modalidade, as composições da presente invenção também podem compreender um pó umectável, pulverizador, emulsão, coloide, solução aquosa ou orgânica, polvilho, granulado ou concentrado coloidal. As formas secas das composições podem ser formuladas para se dissolver imediatamente após a umedecimento ou, alternativamente, se dissolver de uma maneira controlada, de liberação sustentada ou de outra maneira dependente do tempo. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreender uma solução aquosa. Tais soluções ou suspensões aquosas podem ser fornecidas como uma solução estoque concentrada que é diluída antes da aplicação ou, alternativamente, como uma solução diluída pronta para aplicação. Tais composições podem ser formuladas de várias maneiras. Elas podem ser empregadas como pós umectáveis, grânulos ou pós, misturando-se com vários materiais inertes, como minerais inorgânicos (derivados de silicone ou silício, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos e semelhantes) ou materiais botânicos (espigas de milho em pó, cascas de arroz cascas de nozes e semelhantes). As formulações ou composições contendo bactérias geneticamente modificadas podem incluir adjuvantes de adesivo espalhador, agentes estabilizadores, outros aditivos pesticidas ou tensoativos. As formulações líquidas podem ser empregadas como espumas, suspensões, concentrados emulsionáveis ou semelhantes. Os ingredientes podem incluir agentes teológicos, tensoativos, emulsificantes, dispersantes ou polímeros.
[0109] As composições da invenção, que podem incluir bactérias doadoras simbióticas geneticamente modificadas que expressam polinucleotídeos de RNA heterólogos, podem ser usadas para o controle biológico de patógenos em um animal ou outro hospedeiro. Tal pedido compreende administrar a um hospedeiro uma quantidade eficaz da composição que expressa do doador polinucleotídeos de RNA heterólogos suficientes que podem ser transportados para fora do doador e absorvidos pelo patógeno alvo, interferindo assim na expressão de um gene essencial alvo e, assim, controlar o patógeno e/ou doença do patógeno causando efeitos no hospedeiro.
[0110] As composições da invenção podem ser usadas para o controle da expressão genética de patógenos in vivo. Tal aplicação compreende administrar ao hospedeiro alvo, como camarão, uma quantidade eficaz da composição que suprime o patógeno transportado pelo hospedeiro, reduzindo ou eliminando o estado da doença no hospedeiro, além de tornar o patógeno intransferível, por exemplo, a uma população hospedeira. Assim, independentemente do método de aplicação, a quantidade de bactérias doadoras simbióticas geneticamente modificadas que expressam polinucleotídeos de RNA heterólogos que podem ser aplicados em uma quantidade eficaz para matar ou suprimir um patógeno, variará dependendo de fatores como, por exemplo, o hospedeiro a ser controlado, o tipo de patógeno, em alguns casos a fonte de água a ser tratada, as condições ambientais e o método, taxa e quantidade de aplicação da composição. A concentração da composição que é usada para aplicação ambiental, sistêmica ou foliar variará amplamente, dependendo da natureza da formulação específica, meios de aplicação, condições ambientais e grau de atividade biocida.
[0111] De acordo com algumas modalidades, o polinucleotídeo de asRNA heterólogo é fornecido em quantidades eficazes para reduzir ou suprimir a expressão de pelo menos um produto de gene de patógeno. Como usado aqui "uma quantidade supressora" ou "uma quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de asRNA que é suficiente para regular (reduzir a expressão do) gene alvo em pelo menos 5%, 10% 20%, 30%, 40%, 50%, ou mais, 60%, 70%, 80%, 90%, oi ainda até 100%. Todas as faixas incluem as faixas estabelecidasespecificamente.
[0112] Como aqui utilizado, o termo "gene" ou "polinucleotídeo" se refere a um único nucleotídeo ou um polímero de resíduos de ácido nucleico de qualquer comprimento. O polinucleotídeo pode conter desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou seus análogos e pode ser de fita dupla ou de fita simples. Um polinucleotídeo pode compreender ácidos nucleicos modificados (por exemplo, metilados), análogos de ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos de ocorrência não natural e pode ser interrompido por resíduos de ácidos não nucleicos. Por exemplo, um polinucleotídeo inclui um gene, um fragmento de gene, cDNA, DNA isolado, mRNA, tRNA, rRNA e RNA isolado de qualquer sequência, polinucleotídeos recombinantes, iniciadores, sondas, plasmídeos e vetores. Incluídos na definição estão os polímeros de ácido nucleico que foram modificados, seja naturalmente ou por intervenção.
[0113] Conforme usado aqui, os termos "aproximadamente" ou "cerca de" se referem a ± 10%. Sempre que uma faixa numérica for aqui indicada, ela deve incluir qualquer número citado (fracionário ou integral) dentro da faixa indicada. As frases "variando/varia entre" um primeiro número indicado e um segundo número indicado e "abrangendo/abrange de" um primeiro número indicado "a" um segundo número indicado são usadas aqui de forma intercambiável e devem incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionários e integrais entre eles.
[0114] Os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tendo" e seus conjugados significam "incluindo, entre outros". O termo "consistindo em" significa "incluindo e limitado a". O termo "consistindo essencialmente em" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas somente se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.
[0115] Como usado neste documento, a forma singular "uma", "um" e "a/o" inclui referências no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo suas misturas.
[0116] Ao longo deste pedido, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve ser compreendido que a descrição em formato de faixa é meramente para conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as possíveis subfaixas, bem como valores numéricos individuais nessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal como de 1 a 6, deve ser considerada como tendo divulgado especificamente subfaixas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc. , bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e
6. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa.
[0117] Conforme usado neste documento, o termo "método" se refere a modos, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa, incluindo, entre outros, modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos, ou facilmente desenvolvidos a partir de modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por praticantes das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas. Como usado aqui, o termo "tratamento" inclui revogar, inibir substancialmente, retardar ou reverter a progressão de uma condição, melhorar substancialmente os sintomas clínicos ou estéticos de uma condição ou impedir substancialmente o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma condição.
[0118] Como usado aqui, "simbiótico" ou "simbiontes" geralmente se refere a uma bactéria que é um simbionte de um hospedeiro. Ele também pode incluir bactérias que persistem ao longo do ciclo de vida de um hospedeiro, interna ou externamente, e podem ser passadas horizontalmente para a prole ou óvulos de um hospedeiro. Os simbiontes também podem incluir bactérias que colonizam fora das células do hospedeiro e até mesmo nos tecidos, linfa ou secreções do hospedeiro. Endossimbiontes geralmente se refere a um subgrupo de simbiontes internos.
[0119] Como usado aqui, "transbiótico" se refere à produção de polinucleotídeos de RNA dentro de bactérias simbióticas ou naturais que vivem dentro do organismo hospedeiro alvo que são projetadas para inibir a expressão dos genes hospedeiros ou patógenos alvo.
[0120] Esta invenção utiliza técnicas de rotina no campo da biologia molecular. Os textos básicos que descrevem os métodos gerais de uso nesta invenção incluem Green e Sambrook, 4ª ed. 2012, Cold Spring Harbor Laboratory; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1993); e Ausubel et al. , eds. , Current Protocols in Molecular Biology, 1994-current, John Wiley &
Sons. Salvo indicação em contrário, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Oxford University Press, 2007 (ISBN 0763740632); Krebs, et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd. , 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc. , 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0121] A invenção agora descrita em geral será mais facilmente entendida por referência aos exemplos a seguir, que são incluídos apenas para fins de ilustração de certos aspectos das modalidades da presente invenção. Os exemplos não se destinam a limitar a invenção, como um versado na técnica reconheceria a partir dos ensinamentos anteriores e dos exemplos a seguir que outras técnicas e métodos podem satisfazer as reivindicações e podem ser empregados sem se afastar do escopo da invenção reivindicada. De fato, embora essa invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências às modalidades preferenciais da mesma, será compreendido pelo versado na técnica que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem se distanciar do escopo da invenção abrangido pelas reivindicações anexas.
EXEMPLOS
[0122] Para demonstrar a regulação transbiótica da expressão do gene bacteriano em uma bactéria patogênica receptora por asRNA expresso e entregue por uma bactéria doadora, os presentes inventores realizaram a seguinte série de experimentos. Primeiro, os presentes inventores usaram a proteína fluorescente verde (GFP) como reportador para quantificar o nível de expressão de um gene direcionado à supressão de asRNA e mostraram que o cocultivo de bactérias que expressam GFP (receptor) com bactérias que expressam GRP específico para asRNAs (doador) leva a uma redução no nível de fluorescência de GFP na cepa receptora.
[0123] Segundo, os presentes inventores designados asRNA que direcionam um gene essencial, dam, no patógeno geral Vibrio harveyi e demonstraram que as bactérias que expressam asRNA-Dam são capazes de suprimir a expressão de Dam em Vibrio e alterar as características de Vibrio dependentes de Dam, levando à supressão de populações bacterianas e estados patogênicos de Vibrio. O gene DAM de Vibrio harveyi, que codifica o gene dam, está envolvido na metilação do DNA, reparo de incompatibilidade de DNA, regulação da replicação do DNA e regulação da expressão do gene. O Dam também está envolvido na regulação da via da virulência em muitas bactérias (Julio at all, 2001).
[0124] Finalmente, os presentes inventores introduziram Enterobacter sp (Ag1) que expressa asRNA-Dam direcionando o gene dam de Vibrio para C. elegans infectados com V. harveyi para confirmar a regulação mediada por asRNA interbacteriana da expressão genética essencial em um sistema de patógeno hospedeiro, resultando em reduções substanciais nas populações de bactérias patogênicas. Exemplo 1: Nível de fluorescência de GFP é reduzido nas bactérias que expressam GFP após cocultivo com a cepa de bactérias doadoras que expressam asRNA-GFP.
[0125] Os presentes inventores demonstram que a fluorescência de GFP exemplar pode ser reduzida através do novo sistema transbótico descrito aqui. Como entendido pelos versados na técnica, GFP é frequentemente usado como reportador para o nível de expressão da proteína. Além disso, existem sequências bem caracterizadas de asRNA que demonstraram suprimir a fluorescência de GFP quando GFP e asRNA-GFP, identificados como SEQ ID NO. 2, são expressos na mesma célula bacteriana. Aqui, os presentes inventores utilizaram uma sequência conhecida de asRNA complementar para o início da sequência de codificação de GFP para determinar se esse asRNA suprimiria a fluorescência de GFP quando GFP e asRNA-GFP fossem expressos em bactérias diferentes estabilizadas ainda mais como uma alça de asRNA flanqueada por um haste de dsRNA rico em GC complementar. Como mostrado geralmente aqui, os presentes inventores demonstram que, essa estrutura de alça de haste permite determinar se a presença ou ausência da nuclease específica de dsRNA, RNase III, nas bactérias receptoras impactaria a eficácia da estrutura de alça de haste de RNAs no silenciamento da RNA-GFP direcionado. Para este fim, os presentes inventores usaram a cepa RNase III Ag1 do tipo selvagem e a cepa HT-115 E. coli deficiente em RNase III como bactérias receptoras nestes experimentos.
[0126] Como mostrado na Fig. 1, para avaliar se a produção de asRNA-GFP em uma bactéria doadora reduziria a expressão de GFP em bactérias aceptoras, os presentes inventores cocultivaram cepas de bactérias doadoras e receptoras juntas. O nível relativo de fluorescência de GFP foi medido em bactérias que expressam GFP após 4 a 7 h de cocultivo de cepas bacterianas de doadores e receptores que expressam tanto o RNAR-GFP específico quanto o RNA1 inespecífico como o gene COP1, identificado como SEQ ID NO. 4, de Aedes aegypti. Tanto a cepa HT-115 de E. coli deficiente de RNase III quanto a bactéria RNase III Ag1 do tipo selvagem foram usadas para expressar GFP para verificar se a presença de RNase III afetaria a preservação da estrutura asRNA-GFP de hairpina na bactéria receptora. Tanto na cepa HT-115 de E. coli deficiente em Ag1 quanto RNase III, o nível de fluorescência de GFP foi reduzido em ~ 15% após 4 h de cocultivo com bactérias doadoras que expressam asRNA-GFP. Uma cepa doadora de controle negativo foi HT-27E. coli que expressa um RNA não específico (HT27ns). Os presentes inventores não observaram efeito desta cepa na expressão de GFP na cepa receptora, indicando que as reduções na expressão de GFP observadas na cepa receptora cocultivada com cepas doadoras que expressam asRNA-GFP foram devido à entrega de asRNA-GFP à cepa receptora e subsequente silenciamento parcial da expressão de GFP. (Veja a Fig. 1). Exemplo 2: Redução da expressão do gene dam em Vibrio harveyi por asRNA-Dam específico expresso por Enterobacter sp Ag1.
[0127] Como afirmado anteriormente, a presente invenção fornece um método robusto para supressão direcionada da expressão genética essencial em bactérias patogênicas por asRNA específico entregue por bactérias manipuladas que crescem no hospedeiro. Como mostrado a seguir, o patógeno exemplar Vibrio harveyi pode ser direcionado para a expressão genética essencial.
[0128] Vibrio harveyi é uma bactéria patogênica oportunista. Muitos Vibrio sp são patógenos comuns de animais de aquicultura, como camarão, ostra, camarão, lagosta e muitas espécies de peixes. O controle de doenças relacionadas ao Vibrioé uma medida importante no desenvolvimento da aquicultura. O gene DAM de Vibrio harveyi (DNA adenina metiltransferase) que codifica a desoxiadenosina metilase é um alvo exemplar para o silenciamento de genes mediado por asRNA para suprimir o crescimento populacional bacteriano e a patogênese bacteriana. Como descrito geralmente na Figura 2, o dam é um gene essencial em Vibrio sp. e está envolvido no reparo incompatível do DNA, na regulação da replicação e na expressão do gene. O dam também está envolvido na regulação das vias de virulência em muitas bactérias. Exemplo 3: Cocultivo de Vibrio com Ag1 que expressa asDam leva a uma aptidão reduzida do Vibrio e à formação de biofilme reduzida.
[0129] O gene dam (DNA adenina metiltransferase) desempenha um papel essencial na replicação do DNA de Vibrio. Assim, uma redução nos níveis de proteína Dam deve levar à redução da replicação bacteriana e, como resultado, à diminuição do crescimento celular. Para determinar se o asRNA-Dam produzido em uma bactéria doadora pode afetar o crescimento populacional de uma bactéria receptora, os presentes inventores cocultivaram a bactéria doadora e receptora e acompanharam o crescimento populacional. O número de células Vibrio foi comparado após 24 h de cocultivo com cepas bacterianas de doadores que expressam asRNA-Dam (Ag1), tanto em cultura líquida quanto em placas de ágar. As culturas de bactérias mistas foram semeadas em placas de LB-ágar com 50 mg/L de rifamicina em diluição em série 10 vezes. Como mostrado nas Figs. 3 AB, uma vez que apenas a cepa Vibrio tinha resistência à rifamicina, esse revestimento permitiu aos presentes inventores discriminar entre as cepas doadoras e receptoras e determinar o impacto da asRNA-Dam entregue à Vibrio em seu crescimento. Como mostrado, os presentes inventores observaram uma redução de três vezes no número de células Vibrio quando cultivadas com bactérias doadoras que expressam asRNA-Dam em comparação com controles que expressam um asRNA simulado quando cultivadas em meio líquido e uma redução de duas vezes quando cultivadas em uma superfície de ágar.
[0130] Os presentes inventores determinaram a seguir se a supressão da expressão da proteína Dam impactou a expressão de características associadas à patogênese na bactéria receptora. Especificamente, os presentes inventores monitoraram a formação de biofilme; um processo associado a estados avançados de patogênese em bactérias. Para avaliar a formação de biofilme em cultura mista, os presentes inventores cocultivaram a bactéria doadora e receptora por 24 h. Em seguida, a formação de biofilme foi medida usando um método de coloração com cristal violeta para quantificação dos níveis de biofilme. Foi demonstrado pelos presentes inventores que as bactérias doadoras que expressam asRNA-Dam reduziram a formação de biofilmes no Vibrio em 50% em relação aos controles (Figura 3C). Como a Dam está envolvida na regulação da formação de biofilme, a diminuição na formação de biofilme é atribuída à expressão reduzida da proteína Dam em Vibrio na presença de bactérias que expressam asRNA-Dam. Exemplo 4: Metilação de DNA de N6-metiladenosina (6mA) geral diminuiu como resultado do cocrescimento de Vibrio com Ag1-asRNA-Dam.
[0131] Além de demonstrar a diminuição da aptidão das células Vibrio nas modalidades descritas anteriormente, resultante da inibição da função Dam, os presentes inventores demonstram ainda que a metilação do DNA de Vibrio também é diminuída. Para determinar se o cocultivo de Vibrio com asRNA-Dam que expressa Ag1 de Enterobacter teve um efeito na metilação do DNA do DNA genômico do Vibrio, foram realizadas experiências de transferência de pontos usando anticorpos primários específicos paraadenina modificada 6mA.
[0132] Primeiro, os presentes inventores analisaram o estado de metilação relativo do DNA genômico de E. coli, V. harveyi e Enterobacter sp. Os presentes inventores descobriram que, em comparação com o DNA de outras bactérias, o DNA de V. harveyi é fortemente metilado (ver Figura 4A). Para demonstrar que a presença de asRNA-Dam expressa pela bactéria Ag1 afeta o nível de metilação do DNA Vibrio, o DNA bacteriano foi purificado das culturas bacterianas mistas (por exemplo, Vibrio e Ag1-asRNA-Dam;Vibrio e Ag1-asRNA- GFP) cultivadas em superfície do ágar e usadas na análise de transferência de pontos para avaliação da metilação do DNA usando anticorpos específicos da metilação, como aqui descrito geralmente. Como mostrado na Fig 4C, os presentes inventores observaram uma diminuição na intensidade do sinal de resposta imune do cocultivo isolado de DNA de Vibrio e Enterobacter (doador) Ag1 que expressam asRNA-Dam (Veja Figura 4B). A metilação do DNA obtido após o cocrescimento com Ag1-asRNA-Dam foi 30% menor que o sinal obtido para o controle não específico negativo (Ag1-asRNA-GFP). Assim, os presentes inventores demonstraram que após co-crescimento com Ag1-asRNA-Dam, o DNA genômico de Vibrio reduziu substancialmente a metilação. Exemplo 5: Diminuição no nível de metilação do DNA é devido à diminuição na metilação do DNA de Vibrio.
[0133] Para verificar que a diminuição no nível geral de metilação foi devido à inibição específica da síntese de Dam por -asRNA-Dam, os presentes inventores realizaram análises de DNA de restrição sensíveis à metilação do DNA genômico do Vibrio usando endonucleases de restrição MboI e DpnI que possuem sensibilidade diferencial à metilação. Por exemplo, o MboI corta apenas o DNA não metilado de dam e, correspondentemente, a inibição da atividade de Dam nas células leva a uma diminuição na concentração de fragmentos não digeridos na mistura de digestão. Ao contrário, o DpnI corta apenas o DNA metilado dam e uma diminuição no estado de metilação do DNA levará a um acúmulo de fragmentos de DNA não digeridos.
[0134] O rendimento de fragmentos de DNA não digerido foi quantificado por qPCR. Os oligonucleotídeos específicos para Vibrio oriC usados no ensaio são apresentados na Tabela 4 a seguir e a justificativa para o seu projeto é mostrada na Fig. 5A. Resumidamente, para análise de restrição sensível à metilação, os presentes inventores escolhem a origem de replicação fortemente metilada, oriC. Uma região de oriC sem sítios de restrição DpnI/MboI foi usada como controle interno no qPCR. Dois conjuntos de iniciadores, oriC 5’ e oriC 3’, contendo 3 e 7 sítios de metilação de Dam, respectivamente (DpnI/MboI), foram projetados para avaliar o estado de metilação em toda a região oriC.
[0135] Como mostrado na Fig. 5, os presentes inventores demonstraram que no caso de metilação diminuída do DNA, a abundância de fragmentos não digeridos com MboI foi diminuída (5 vezes, no caso do fragmento 3' (ver Fig. 5 B)). Correspondentemente, a abundância de fragmentos de DpnI aumentou 2 a 4 vezes (ver Fig. 5 C). Os resultados confirmam que o cocrescimento de Vibrio com Ag1-asRNA-Dam leva à inibição da atividade de Dam nas células Vibrio associada a uma diminuição no estado de metilação do DNA de oriC, levando a uma redução no crescimento bacteriano de Vibrio. Exemplo 6: Cocrescimento de Vibrio com Ag1-asDam leva à redução do dam mRNA.
[0136] Para afetar o estado de metilação do DNA de Vibrio, o asRNA-Dam deve entrar nas células Vibrio e alterar a atividade e/ou concentração da proteína Dam. Aqui, os presentes inventores projetaram asRNA-Dam para sobrepor o códon de início e o potencial sítio de ligação ao ribossomo do mRNA de Dam. Correspondentemente, em uma modalidade preferida, o asRNA-Dam pode funcionar impedindo a tradução de Dam e/ou promovendo a degradação do mRNA. Para estabelecer o mecanismo potencial de asRNA-Dam, os presentes inventores acessaram a concentração de mRNA de dam no RNA total. Como geralmente demonstrado na Fig. 6, foi observada uma redução duas vezes no mRNA de dam no Vibrio cocultivado com Enterobacter Ag1 que expressa asRNA-Dam em comparação com o cocultivo de controle com bactérias que expressam asRNA-GFP inespecífico. Os resultados de experimentos com qPCR confirmam que o nível de dnaA-mRNA foi 3 vezes menor em células de Vibrio que foram cocultivadas com Ag1 que expressam asRNA-Dam que as cocultivadas com Ag1 que expressam asRNA-GFP. Como resultado, os presentes inventores demonstram que o RNA antissentido complementar ao gene da extremidade 5' do gene dam expresso no Enterobacter Ag1 está entrando nas células de Vibrio e inibe a síntese da proteína Dam pela destruição do mRNA da dam. Exemplo 7: Redução da expressão do gene dam em Vibrio harveyi por asRNA específico expresso por Enterobacter sp Ag1 no sistema de patógeno hospedeiro.
[0137] Os presentes inventores determinaram que o asRNA entregue às bactérias também poderia suprimir a expressão de um gene de interesse em bactérias intestinais direcionadas que vivem em um eucariota hospedeiro. Como geralmente mostrado na Fig. 7, os presentes inventores realizaram experimentos in vivo usando C. elegans como um modelo de hospedeiro exemplar. C. elegans foram infectados com Vibrio harveyi e depois alimentados com Enterobacter Ag1 que expressa asRNA-Dam ou que expressa asRNA-GFP por 20 h. Em seguida, o RNA total foi extraído de C. elegans e o nível de mRNA de dam foi avaliado por qPCR usando os mesmos iniciadores identificados na Tabela 3 a seguir. Como os iniciadores são específicos apenas dos genes Vibrio dam e gyrB (padrão de RNA), a presença de C. elegans e Ag1 no RNA total não afetou a análise de qPCR. Os presentes inventores descobriram que a expressão de Vibrio dam foi 6 vezes mais baixa em C. elegans alimentado com Enterobacter Ag1 que expressa asRNA-Dam em comparação com C. elegans alimentado com bactérias Ag1 que expressam asRNA-GFP inespecífica (Veja Figura 7).
MATERIAL E MÉTODOS Projeto de cassete que expressa o asRNA
[0138] O projeto de estabilização de RNA dos terminais emparelhados (PT) para a produção de RNA antissentido (asRNA) desenvolvido por Nakashima et al. ,
(2006) foi usado para criar cassetes que expressam asRNA. Foram adicionados fragmentos de alcance de GC invertidos de flanqueamento de 38 bp de comprimento em ambos os lados da sequência específica de asRNA, formando uma estrutura hairpina com a alça de asRNA no final. Os sítios de restrição EcoRV e XhoI foram adicionados ao final dos inversos de flanqueamento para conveniência de clonar diferentes sequências de asRNA em cassete. O terminador RrnB (terminador do gene rrnB E. coli) foi colocado após uma sequência de conector de 207 bp de comprimento no final da cassete que expressa asRNA e o cassete foi clonado no plasmídeo pAD-43-25 sob o controle do promotor Pupp usando os sítios de restrição XbaI e HindIII (Ver Fig. 8). Medições de fluorescência GFP:
[0139] As cepas doadoras de bactérias (HT27-asGFP e HT27-COP1) e receptoras de bactérias (HT115-pGFP ou Ag1-pad-43-25) foram cultivadas separadamente durante a noite em LB (Thermo-Fisher, 12780052) com 5 mg/mL de cloranfenicol e depois misturados para experimentos de cocultivo em uma razão de doador/receptor de 5:1 a 10:1. As culturas de bactérias mistas foram cocultivadas por 1 a 7 h e as medições de fluorescência foram realizadas pelo leitor de placas Tecan M200. Foram analisadas 3 experimentos independentes com 8 replicatas técnicas para cada experimento para cada tratamento. A fluorescência de GFP em bactérias transformadas em pAD-43-25 foi medida usando excitação a 485 nm e emissão a 528 nm, a fluorescência induzida por uG GFP em células HT115-pGFP foi medida em um comprimento de onda de excitação de 400 nm e comprimento de onda de emissão de 520 nm. Ensaio de contagem de células:
[0140] A aptidão do vibrio antes e depois dos tratamentos foi determinada por ensaios de contagem de células:
[0141] Cocultivo em experimentos de cultura líquida:Vibrio- RifR (cepa receptora de asRNA) e Ag1-asRNA-Dam1 ou Ag1-asRNA-GFP1 (cepas doadoras de asRNA) foram cultivados durante a noite em LBS (10 g/L de Bacto- triptona, 5 g/Extrato de levedura L, 20 g/L de NaCl, 50 mM de Tris-HCl pH 7,5),
diluídos para OD (600 nm) de 0,2 a 0,4 e foram misturados na razão de doador/receptor de 5/1. As culturas mistas foram cultivadas em 28 oC por 24 h e depois semeadas em placas de ágar-LBS com 50 mg/L de rifamicina como 5 µL de diluições em série de 10 vezes. As bactérias foram cultivadas durante a noite a 28o C antes da contagem de células. Foram realizados 3 experimentos independentes para esta análise.
[0142] Cocrescimento na superfície do ágar: 5 µL da cepa doadora durante a noite e 5 µL da cepa receptora foram simultaneamente descartados na placa de agar LBS e crescidos por 24 horas a 28 oC. Em seguida, o ponto bacteriano misto foi cortado da camada de ágar, dissolvido em PBS e semeados em 5 µL em placas de ágar-LBS com 50 mg/L de rifamicina em diluições em série de 10 vezes. 8 experimentos independentes foram usados para esta análise. Ensaio de formação de biofilme
[0143] Vibrio harveyi e Ag1-pAD-pt-Dam1 ou Ag1-pAD-pt-GFP1 foram cultivados durante a noite em meio LBS, diluídos para OD 600 0,2a 0,4 e misturados em uma razão de doador/receptor em 5/1. Em seguida, 100 µL de cultura mista foram adicionados aos poços em placas de 96 poços (foram analisados 3 experimentos independentes com 8 replicatas técnicas em cada experimento para cada tratamento) e incubados sem agitação a 28 oC por 24 h. Após a incubação, o biofilme bacteriano foi corado com cristal de violeta de acordo com o protocolo descrito por O'Toole (O'Toole, 2011) e a absorbância foi medida no leitor de placas Tecan a 550 nm. Análise de transferência de pontos 6-metiladenosina (6mA)
[0144] Herr, abundância de 6mA no DNA bacteriano pelo teste de transferência de pontos usando anticorpo de camundongo criado contra o DNA com N6- metiladenina (6mA). O DNA bacteriano foi purificado usando o kit de purificação de DNA bacteriano Omega. O DNA foi então diluído para uma concentração de 100 ng/µL com 8 M de ureia. As amostras de DNA foram desnaturadas por aquecimento a 95 C por 3 min. As amostras foram resfriadas em gelo imediatamente após a desnaturação para evitar a formação novamente da estrutura secundária. As duplicatas de 2 µL foram aplicadas a uma membrana Amersham Hybond-N + (GE Healthcare). A reticulação UV do DNA para a membrana foi realizada executando o programa de reticulação automática duas vezes usando um Stratalinker 2400. Todos os procedimentos foram realizados em temperatura ambiente. Após lavagem com PBST (NaCl 137 mM, Fosfato 12 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4 e Tween 20 a 0,1%), o anticorpo primário anti-6mA de rato (Synaptic Systems; 212B11) na diluição 1: 1000 foi aplicado durante 2 h de incubação a temperatura ambiente. Após 3 lavagens em excesso de PBST por 30 min, a membrana foi incubada em anticorpo secundário anti-IgG de rato conjugado com HRP (Thermo), depois lavada novamente 3 vezes em excesso de PBST por 30 min. Finalmente, o sinal do anticorpo foi visualizado usando o substrato de duração prolongada SuperSignal West Dura (Thermo Scientific; 34075). Para confirmar a carga igual de DNA, a mesma membrana foi corada com o corante fluorescente Sybr Green e o DNA foi visualizado usando o gerador de imagens Gel Doc Easy (BioRad). Os níveis de 6mA quantificados foram normalizados para a quantidade de DNA carregado. A análise por transferência de pontos foi repetida usando 3 a 8 amostras biológicas independentes e 2 a 3 repetições técnicas. Os sinais das imagens de transferência de pontos foram quantificados por ImageJ e foram objeto da análise estatística. Os resultados foram plotados usando SigmaPlot. qRT-PCR.
[0145] A expressão relativa do gene nas células Vibrio foi medida por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Os RNAs totais foram isolados usando um kit de RNA bacteriano Omega EZNA. A amplificação por PCR em tempo real foi realizada usando um sistema QPCR Mx3000P (Agilent technologies). Um kit de 1 etapa Power SYBR® RNA Green da CT™ (Applied Biosystems) foi utilizado para realizar uma etapa de RT-PCR. A concentração de oligonucleotídeos e as condições de ciclização utilizadas estavam de acordo com as recomendações do fabricante. Os iniciadores específicos de genes estão listados na Tabela 2. Foram utilizados 25 ng de RNA bacteriano total em cada reação. Os níveis de expressão relativa dos transcritos específicos foram calculados usando o nível de expressão de mRNA de gyrB como referência interna para normalização. Ensaios de Digestão por Restrição
[0146] Para determinar o estado de metilação da origem de Vibrio oriC, o DNA genômico foi clivado independentemente com endonucleases de restrição específicas, a fim de decifrar a presença ou a ausência de 6mA. O DNA genômico bacteriano foi purificado usando o kit de DNA bacteriano Omega EZNA. As digestões separadas de 500 ng de DNA usando 5 U por cada enzima de restrição (MboI, somente corte de DNA não metilado e DpnI, somente corte de DNA metilado (Thermo)) foram realizadas por 3 horas a 37 °C. Para determinar a abundância relativa de fragmentos de DNA, que permaneceram intactos após a digestão da enzima de restrição, o qPCR foi realizado usando o kit PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Os iniciadores específicos de genes estão listados na Tabela 2 a seguir. Os níveis relativos dos fragmentos de DNA específicos foram determinados usando o nível de fragmento de DNA de metilação-livre como referência interna para normalização. Ensaio de Caenorhabditis elegans.
[0147] C. elegans foi usado como animal modelo para estudar o efeito do asRNA expresso de forma heterogênea no nível de expressão genética no Vibrio no sistema hospedeiro-patógeno. A cepa N2 deC. elegans foi cultivada em placas de meio de crescimento de nematoides padrão sólido (NGM) a 25 °C e alimentada com OP50 de E. coli. Os vermes foram então sincronizados no estágio dauer, plaqueando as placas NGM vazias. As culturas dauer síncronas foram então transferidas para placas NGM com Vibrio harveyipor 48 h. Em seguida, os vermes foram lavados 3 vezes com tampão M9, ressuspensos e divididos em duas metades, uma foi semeada em placas Ag1-asDam NGM e a segunda em placas Ag1-asGFP. Após 20 h de alimentação pelas bactérias Ag1, os nemátodos foram lavados 3 vezes com M9, um volume duplo de reagente RNAprotect Bacteria (Qiagen) foi adicionado ao tampão e, em seguida, os vermes foram interrompidos por vórtice intensivo com grades metálicas para liberar bactérias intestinais e utilizados para extração de RNA. A expressão relativa do gene dam nas células dam foi medida por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) como descrito anteriormente. Análise de dados.
[0148] As médias e erros padrão da média (SEM) foram calculados a partir de pelo menos três experimentos independentes. Todos os outros dados foram analisados pelo teste Anova com SigmaPlot. A significância das diferenças entre os grupos experimentais foi aceita com um valor de P <0,05.
REFERÊNCIAS:
As seguintes referências são aqui incorporadas na sua totalidade por referência:
TABELAS Tabela 1. Cepas bacterianas.
Cepa Descrição Fonte nome Vibrio ATCC 14126 ATCC harveyi Vibrio Isolado espontâneo de RifR de V. harveyi Esse trabalho ATCC 14126 Ac1 Enterobacter sp Obtido no laboratório NMSU, Xu, isolado de Aedes gambiae no intestino médio Ag1- AG1 (pAD Dam) ApR, como RNA para Plasmídeo asDam Vibrio dam sob Pupp clonado em pAD43-25 produzido por
GENESCRIPT transformado em Ag1 Ag1- AG1 (pAD GFP) ApR, asRNA paragfp sob Plasmídeo asGFP Pupp clonado em pAD43-25 produzido por
GENESCRIPT transformado em Ag1 HT-115 Mutante RNase III deE. coli Ht27 Mutante RNase III deE. coli
Ag1- Cepa que expressa Ag1 (pAD43-25) GFP, Presente invenção pAD-43- ApR 25 Ht115- E. coli Ht115 (pGFPuv)ApR Presente invenção pGFPuv Ht27- E. coli Ht27 (pAD GFP) ApR, asRNA para Presente invenção asGFP gfp sob Pupp clonado em pAD43-25 Ht27- E. coli Ht27 (pAD GFP) ApR, asRNA para Presente invenção COP COP sob Pupp clonado em pAD43-25 TABELA 2: Iniciadores específicos de genes.
Parte de RNA Sequência de RNA Terminais CAGGAGGAAUUAACCAUGCAGUGGUGGUGGUGGUGGU emparelhado G s1 Terminais CACCACCACCACCACCACUGCAUGGUUAAUUCCUCCUG emparelhado s2 asRNA-GFP UAAUUCAACAAGAAUUGGGACAACUCCAGUGAAAAGU
UCUUCUCCUUUACUCAU asRNA-Dam CUUUUUCAUCUACUGCUCUAUCUAUCGACCAAAAAUUA
AG GCUGCGGAAUGUAACAUAU
TABELA 3: Oligonucleotídeos utilizados na qRT-PCR.
Nome Oligo Sequência de DNA Vhv gyrB-for TTA GGT GCT CAA CGA ACG CT Vhv gyrB-rev TAC ACA GAT CCG CTT CTG GC Vhy dnaA-for CTT TGT TCG CAC CTA ACC GC Vhy dnaA rev TGA AGA CTC TGC CGC AAC AT Vhy dam-for GGC GGA TAT TAA CCC CGA CC Vhy dam-rev GCC ATT AAA GCC AAA GCG GT TABELA 4: Oligonucleotídeos utilizados na análise de qPCR.
Nome Oligo Sequência de DNA OriC_Cntrl for ACC TTG TAG CTT ATC TTG CTT CAC OriC_Cntrl rev TTA CTC TGA GGT CTA GGT TAT TGC OriC_5' for TGG AAA TAC TAC TGT CAG TTA GCT C OriC_5'rev CTG TGT ATG AAT TTT CAT TCA TCG G OriC_3' for TGA AAA TTC ATA CAC AGA GTT ATC ACC OriC_3'rev TGT AGC TGG TAG CTC TTC TTG
TABELA 5: Bactérias entéricas doadoras exemplares.
TABELA 6: Alvos genéticos relacionados à MDR em bactérias patogênicas.
Aminocumarinas Topoisomerases de DNA resistentes à aminocumarina GyrB, ParE, ParY resistente à aminocumarina Aminoglicosídeos Acetiltransferases de aminoglicosídeo AAC (1), AAC (2′), AAC (3), AAC (6′) Nucleotidiltransferases de aminoglicosídeo ANT (2″), ANT (3″), ANT (4′), ANT (6), ANT (9) Fosfotransferases de aminoglicosídeos APH(2″), APH(3″), APH(3′), APH(4), APH(6), APH(7″), APH(9) Metiltransferases de rRNA 16S ArmA, RmtA, RmtB, RmtC, Sgm β-lactamas Β-lactamases de classe A AER, BLA1, CTX-M, KPC, SHV, TEM, etc. (metalo-) β-lactamases de classe B BlaB, CcrA, IMP, NDM, VIM, etc. Β-lactamases da classe C ACT, AmpC, CMY, LAT, PDC, etc. Β-lactamases da classe D OXA β-lactamasebe mecA (PBP2 resistente à meticilina) Proteínas porinas mutantes que conferem resistência a antibióticos Omp36, OmpF, PIB (por) resistentes a antibióticos Genes moduladores da resistência à β-lactama Operons bla (blaI, blaR1) e mec (mecI, mecR1) Clorafenicol
Cloranfenicol acetiltransferase (CAT) Fosfotransferase de cloranfenicol Etambutol Arabinosiltransferase resistente a etambutol (EmbB) Mupirocina Isoleucil-tRNA sintetases resistentes à mupirocina MupA, MupB Antibióticos peptídicos Proteína de membrana integral MprF Fenicol CFR 23S rRNA metiltransferase Rifampina ADP-ribosiltransferase de rifampicina (Arr) Glifiltransferase de rifampicina Rifampicina mono-oxigenase Fifotransferase de rifampicina Proteínas de ligação à RNA polimerase resistentes à rifampicina DnaA, RbpA Subunidade beta da RNA polimerase (RpoB) resistente à rifampicina Estreptograminas CFR 23S rRNA metiltransferase Erm 23S rRNA metiltransferases ErmA, ErmB, Erm (31), etc.
Bombas de efluxo de cassetes de ligação ATP (ABC) resistentes às estreptogaminas Lsa, MsrA, Vga, VgaB Streptogamin Vgb lyase Vat acetiltransferase Fluoroquinolonas
Fluoroquinolona acetiltransferase Topoisomerases de DNA resistentes à fluoroquinolona GyrA, GyrB, ParC resistente à fluoroquinolona Proteína de resistência à quinolona (Qnr) fosfomicina Fosfomicina fosfotransferases FomA, FomB, FosC Fosfomicina tiol transferases FosA, FosB, FosX Glicopeptídeos VanA, VanB, VanD, VanR, VanS, etc.
Lincosamidas CFR 23S rRNA metiltransferase Metmtransferases do rRNA do Erm 23S ErmA, ErmB, Erm (31), etc.
Lincosamida nucleotidiltransferase (Lin) Linezolida CFR 23S rRNA metiltransferase Macrolídeos CFR 23S rRNA metiltransferase Metmtransferases do rRNA do Erm 23S ErmA, ErmB, Erm (31), etc.
Esterases de macrolídeos EreA, EreB Glicosiltransferases de macrolídeos GimA, Mgt, Ole Fosfotransferases de macrolídeos MPH(2′)-I, MPH(2′)-II Bombas de efluxo de resistência a macrolídeos
MefA, MefE, Mel Estreptotricina Estreptotricina acetiltransferase (sat) Sulfonamidas Di-hidropteroato sintase resistente a sulfonamida Fol1 resistente a Sul1, Sul2, Sul3, sulfonamida Tetraciclinas PIB porino mutante (por) com permeabilidade reduzida Enzima de inativação de tetraciclina TetX Bombas de efluxo de superfamília facilitadora principal (MFS) de resistência à tetraciclina TetA, TetB, TetC, Tet30, Tet31, etc.
Proteínas ribossômicas de proteção à resistência à tetraciclina TetM, TetO, TetQ, Tet32, Tet36, etc.
Bombas de efluxo que conferem resistência a antibióticos Bomba de efluxo de antibióticos ABC MacAB-TolC, MsbA, MsrA, VgaB, etc.
Bomba de efluxo de antibióticos MFS EmrD, EmrAB-TolC, NorB, GepA, etc.
Transportador de multifármaco e de extrusão de compostos tóxicos (MATE) MepA Bomba de efluxo de resistência-nodulação-divisão celular (RND) AdeABC, AcrD, MexAB-OprM, mtrCDE, etc.
Bomba de efluxo de antibióticos de resistência a multifármacos pequena (SMR) EmrE Genes moduladores do efluxo de antibióticos adeR, acrR, baeSR, mexR, phoPQ, mtrR, etc.
Genes alvo adicionais para MDR dedA RH201207_02818 wabN galE wzabc arnBCADTE lpp surA RH201207_00408 RH201207_00413 rnhA galU fabR RH201207_00757 Pgi Glicose-6-fosfato isomerase, bamB tolQRAB Pal dedD sdhD hupA yhcB RH201207_03912 gspA/rfbD fkpA F degP RH201207_05041/42 tagA cysC ydgA RH201207_01572 cpxR fre mrcB miaA envC TABELA 7 - Exemplos de patógenos animais que podem ser direcionados com a presente tecnologia inventiva.
Acinetobacter baumannii Acinetobacter lwoffii Acinetobacter spp. (incl. MDR) Actinomicetos Adenovirus Aeromonas spp. Alcaligenes faecalis Alcaligenes spp. / Achromobacter spp. Alcaligenes xylosoxidans (incl. ESBL/MRGN) Arbovírus Ascaris lumbricoides. Aspergillus spp. Astrovirus Bacillus anthracis Bacillus cereus Bacillus subtilis
Bacteriodes fragilis Bartonella quintana Blastocystis hominis Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Borrelia duttoni Borrelia recurrentis Brevundimonas diminuta Brevundimonas vesicularis Brucella spp.
Burkholderia cepacia (incl. MDR) Burkholderia mallei Burkholderia pseudomallei Campylobacter jejuni/coli Candida albicans Candida auris Candida krusei Candida parapsilosis Vírus Chikungunya (CHIKV) Chlamydia pneumoniae Chlamydia psittaci Chlamydia trachomatis Citrobacter spp. Clostridium botulinum Clostridium difficile
Clostridium perfringens Clostridium tetani Coronavírus (incl.
SARS e MERS-CoV) Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium spp.
Corynebacterium ulcerans Coxiella burnetii Coxsackievirus Vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo Cryptococcus neoformans Cryptosporidium hominis Cryptosporidium parvum Cyclospora cayetanensis Cytomegalovírus - CMV Vírus da Dengue Dientamoeba fragilis Vírus ebola Echinococcus spp.
Ecovírus Entamoeba dispar Entamoeba Histolytica Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae (incl.
ESBL/MRGN) Enterobius vermicularis
Enterococcus faecalis (incl.
VRE) Enterococcus faecium (incl.
VRE) Enterococcus hirae Epidermophyton spp. Vírus Epstein-Barr – EBV Escherichia coli (incl. EHEC, EPEC, ETEC, EIEC, EAEC, ESBL/MRGN, DAEC) Vermes filariais Vírus da febre aftosa (FMDV) Francisella tularensis Giardia lamblia Haemophilus influenzae Hantavirose Helicobacter pylori Helmintos (vermes) Vírus da hepatite A - HAV Vírus da Hepatite B - HBV Vírus da Hepatite C - HCV Vírus da hepatite D Vírus da hepatite E Herpes simples vírus - HSV Histoplasma capsulatum Enterovírus humano 71 Herpesvírus humano 6 (HHV-6)
Herpesvírus humano 7 (HHV-7) Herpesvírus humano 8 (HHV-8) Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) Metapneumovírus humano Papilomavírus humano Hymenolepsis nana Vírus da gripe (incl.
A(H1N1), A(H1N1)pdm09, A(H3N2), A(H5N1), A(H5N5), A(H5N6), A(H5N8), A(H7N9), A(H10N8)) Klebsiella granulomatis Klebsiella oxytoca (incl.
ESBL/MRGN) Klebsiella pneumoniae MDR (incl.
ESBL/MRGN) Vírus Lassa Leclercia adecarboxylata Legionella pneumophila Leishmania spp.
Leptospira interrogans Leuconostoc pseudomesenteroides Listeria monocytogenes Vírus de Marburg Vírus do sarampo Micrococcus luteus Microsporum spp.
Molluscipoxvirus
Morganella spp.
Vírus da caxumba Mycobacterium chimaera Myco Mycobacterium leprae Myco Mycobacterium tuberculosis (incl.
MDR) Tuberculocidal Mycoplasma genitalium Mycoplasma pneumoniae Naegleria fowleri Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Norovírus Opisthorchis viverrini Orientia tsutsugamushi Pantoea agglomerans Paracoccus yeei Vírus parainfluenza Parvovírus Pediculus humanus capitis Pediculus humanus corporis Plasmodium spp.
Pneumocystis jiroveci Poliovírus Polyomavirus Prevotella spp.
Príon Espécies de Propionibacterium Proteus mirabilis (incl.
ESBL/MRGN)
Proteus vulgaris Providencia rettgeri Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas spp.
Vírus da raiva Ralstonia spp.
Vírus sincicial respiratório – RSV Rinovírus Rickettsia prowazekii Rickettsia typhi Roseomonas gilardii Rotavírus Vírus da rubéola Schistosoma mansoni Salmonella enteritidis Salmonella paratyphi Salmonella spp.
Salmonella typhi Salmonella typhimurium Sarcoptes scabiei (ácaro da coceira) Sapovírus Serratia marcescens (incl.
ESBL/MRGN) Shigella sonnei Espécies de Sphingomonas Staphylococcus aureus (incl.
MRSA, VRSA)
Staphylococcus capitis Staphylococcus epidermidis (incl.
MRSE) Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus pasteuri Staphylococcus saprophyticus Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes (incl.
PRSP) Streptococcus spp.
Strongyloides stercoralis Taenia solium vírus TBE Toxoplasma gondii Treponema pallidum Trichinella spiralis Trichomonas vaginalis Trichophyton spp.
Trichosporon spp.
Trichuris trichiura Trypanosoma brucei gambiense Trypanosoma brucei rhodesiense Trypanosoma cruzi Vírus Usutu Vírus Vaccinia Vírus varicella zoster
Vírus da varíola Vibrio cholerae Vírus do Nilo Ocidental (WNV) Vírus da febre amarela Yersinia enterocolitica Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis Vírus Zika
LISTAS DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO. 1 (asRNA-Dam)
CUUUUUCAUCUACUGCUCUAUCUAUCGACCAAAAAUUAAGGCUGCGGAA
UGUAACAUAU SEQ ID NO. 2 (asRNA-GFP)
UAAUUCAACAAGAAUUGGGACAACUCCAGUGAAAAGUUCUUCUCCUUUA
CUCAU SEQ ID NO. 3 (gene dam de Vibrio)
ATGAAAAAGCAACGAGCCTTTCTTAAGTGGGCAGGAGGCAAATACGGTCT GGTTGAAGACATCCAACGTCATTTACCACCGGCTCGAAAGCTAGTTGAACC CTTTGTTGGTGCTGGCTCGGTTTTTCTAAATACCGACTATGACCACTATCTA CTGGCGGATATTAACCCCGACCTGATTAATCTCTATAACTTACTAAAAGAG CGTCCTGAAGAGTACATCTCAGAAGCGAAGCGCTGGTTTGTTGCAGAGAA CAATCGCAAAGAAGCGTACTTGAATATTCGCGCCGAGTTTAATAAAACGGA TGACGTGATGTACCGCTCGTTGGCGTTCCTATACATGAACCGCTTTGGCTT TAATGGCTTATGTCGTTATAACAAAAAAGGCGGCTTTAATGTCCCGTTTGG TTCTTACAAAAAGCCTTATTTCCCAGAAGCGGAGCTAGAATTCTTTGCTGAA AAAGCCAAGAAAGCGACGTTCGTATGTGAAGGTTACCCAGAAACGTTCAG TCGAGCGCGTAAAGGCAGCGTGGTTTATTGCGATCCACCGTACGCACCGT TGTCGAACACGGCGAACTTTACCTCTTATGCTGGCAACGGCTTTACGCTG GATGATCAAGCTGCATTGGCTGATATTGCAGAGAAAGCCGCAACTGAACG TGGTATCCCTGTTCTGATCTCAAACCATGACACGACATTAACGCGTCGCCT TTATCATGGTGCGGAGCTTAATGTCGTAAAAGTGAAGCGAACCATCAGTCG TAATGGCAGTGGTCGTAATAAAGTTGACGAGTTGCTGGCGCTATTTCGTGC
ACCTGACGCGGACAAATCTGACTCTTAA SEQ ID NO. 4 (RNA-COP1)
CCCTTCACAAACCTGGAGAAAACGTCCGTGCTGCAGGAAACGCGGATGTT TAACGAGACCCCGGTCAATGCCCGCAAGTGTACCCACATCCTGACGAAGA TTCTGTATTTGATCAATCAGGGAGAACAACTGGGTTCCAGAGAGGCCACC GAATGTTTC

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para controlar expressão genética em bactérias patogênicas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - gerar bactérias doadoras geneticamente modificadas configuradas para expressar um polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial de um patógeno bacteriano; - introduzir as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas em um hospedeiro alvo que está infectado com o referido patógeno bacteriano ou é suscetível à infecção pelo referido patógeno bacteriano; - expressar o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial do referido patógeno bacteriano; - transportar o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial do referido patógeno bacteriano para fora das referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas; - introduzir o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial do referido patógeno bacteriano, em que o referido patógeno bacteriano absorve o referido polinucleotídeo asRNA; e - inibir a expressão do referido gene essencial do patógeno bacteriano através da ação do referido polinucleotídeo asRNA heterólogo hibridizando com o mRNA do referido gene essencial de um patógeno bacteriano.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido hospedeiro alvo é um camarão.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas compreendem uma bactéria doadora geneticamente modificada que é simbiótica com o referido camarão.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido patógeno bacteriano é uma espécie de bactéria Vibrio.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida espécie Vibrio é Vibrio Harveyi.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido gene essencial de um patógeno bacteriano compreende DNA adenina metilase (Dam), identificada como SEQ ID NO. 3, ou um homólogo da mesma.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo compreende um polinucleotídeo asRNA heterólogo identificado como SEQ ID NO. 1, ou um homólogo da mesma.
8. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas são bactérias doadoras do tipo probiótico geneticamente modificadas.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras do tipo probiótico geneticamente modificadas compreendem Bacillus subtilis.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas compreendem uma bactéria doadora geneticamente modificada deficiente em RNaseIII.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas que são simbióticas com o referido camarão são selecionadas do grupo que consiste em: Enterobacter e/ou E. coli.
12. Método para controlar formação de biofilme bacteriano, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - gerar bactérias doadoras geneticamente modificadas configuradas para expressar um polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial que contribui para formação de biofilme por um patógeno bacteriano;
- introduzir as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas em um hospedeiro alvo que está infectado com o referido patógeno bacteriano ou é suscetível à infecção pelo referido patógeno bacteriano; - expressar o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial que contribui para formação de biofilme pelo referido patógeno bacteriano; - transportar o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial que contribui para formação de biofilme pelo referido patógeno bacteriano para fora da referida bactéria doadora geneticamente modificada; - introduzir o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo dirigido para um gene essencial que contribui para formação de biofilme pelo referido patógeno bacteriano, em que o referido patógeno bacteriano absorve o referido polinucleotídeo asRNA; e - inibir a expressão do referido gene essencial que contribui para formação de biofilme por um patógeno bacteriano através da ação do referido polinucleotídeo asRNA heterólogo hibridizando com o mRNA complementar do referido gene essencial de um patógeno bacteriano.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido hospedeiro alvo é um camarão.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas compreendem uma bactéria doadora geneticamente modificada que é simbiótica com o referido camarão.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido patógeno bacteriano é uma espécie de bactéria Vibrio.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida espécie Vibrio é Vibrio Harveyi.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido gene essencial de um patógeno bacteriano compreende DNA adenina metilase (Dam), identificada como SEQ ID NO. 3, ou um homólogo da mesma.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo compreende um polinucleotídeo asRNA heterólogo identificado como SEQ ID NO. 1, ou um homólogo da mesma.
19. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas são bactérias doadoras do tipo probiótico geneticamente modificadas.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras do tipo probiótico geneticamente modificadas compreendem Bacillus subtilis.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas compreendem uma bactéria doadora geneticamente modificada deficiente em RNaseIII.
22. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas que são simbióticas com o referido camarão são selecionadas do grupo que consiste em: Enterobacter, e/ou E. coli.
23. Método para tratar uma infecção de Vibrio em um organismo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - gerar bactérias doadoras geneticamente modificadas configuradas para expressar um polinucleotídeo asRNA heterólogo que é complementar ao mRNA de DNA adenina metilase (Dam) de um patógeno bacteriano de Vibrio ; - introduzir as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas em um hospedeiro alvo que está infectado com o referido patógeno bacteriano Vibrio ou é suscetível à infecção pelo referido patógeno bacteriano Vibrio ;
- expressar o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo que é complementar ao referido mRNA de DNA adenina metilase (Dam) do referido patógeno bacteriano Vibrio ; - transportar o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo que é complementar ao mRNA de DNA adenina metilase (Dam) do referido patógeno bacteriano Vibrio para fora das referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas; - introduzir o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo que é complementar ao mRNA de DNA adenina metilase (Dam) do referido patógeno bacteriano Vibrio, em que o referido patógeno bacteriano absorve o referido polinucleotídeo asRNA; e - inibir a expressão do referido gene essencial do patógeno bacteriano através da ação do referido asRNA hibridizando com o mRNA complementar do referido gene essencial do referido patógeno bacteriano Vibrio.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o referido hospedeiro alvo é um camarão.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas compreendem uma bactéria doadora geneticamente modificada que é simbiótica com o referido camarão.
26. Método, de acordo com as reivindicações 23 e 25, caracterizado pelo fato de que a referida espécie Vibrio é Vibrio Harveyi.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida DNA adenina metilase (Dam) é identificada como SEQ ID NO. 3, ou um homólogo da mesma.
28. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo que é complementar ao mRNA de DNA adenina metilase (Dam) de um patógeno bacteriano Vibrio compreende um polinucleotídeo asRNA heterólogo identificado como SEQ ID NO. 1, ou um homólogo da mesma.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas são bactérias doadoras do tipo probiótico geneticamente modificadas.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as bactérias doadoras do tipo probiótico geneticamente modificadas compreendem Bacillus subtilis.
31. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas compreendem uma bactéria doadora geneticamente modificada deficiente em RNaseIII.
32. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas que são simbióticas com o referido camarão são selecionadas do grupo que consiste em: Enterobacter, e/ou E. coli.
33. Microrganismo geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que compreende: - bactérias doadoras geneticamente modificadas que podem ser introduzidas em um hospedeiro alvo e expressam pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo configurado para ser transportado para fora das referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas e ser absorvido por um patógeno bacteriano do referido hospedeiro alvo e inibir ainda mais a expressão de pelo menos um um gene essencial no referido patógeno bacteriano.
34. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o referido patógeno bacteriano compreende uma espécie de Vibrio.
35. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o referido gene essencial compreende adenina metilase (Dam), é identificado como SEQ ID NO. 3, ou um homólogo da mesma.
36. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo asRNA heterólogo de RNA é identificado como identificado como SEQ ID NO. 1, ou um homólogo da mesma.
37. Microrganismo geneticamente modificado, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que as referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas compreendem um microrganismo doador geneticamente modificado selecionado do grupo que consiste em: bactérias doadoras simbióticas geneticamente modificadas, bactérias doadoras geneticamente modificadas tipo probiótico, Bacillus subtilis, Enterobacter, E. coli e/ou algas doadoras geneticamente modificadas.
38. Bactérias geneticamente modificadas configuradas para controlar a infecção de Vibrio, caracterizadas pelo fato de que compreendem: - bactérias doadoras geneticamente modificadas que podem ser introduzidas em um hospedeiro alvo e expressam pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo configurado para ser transportado para fora das referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas e ser absorvido por um patógeno bacteriano Vibrio do referido hospedeiro alvo e inibir ainda mais a expressão de pelo menos um um gene essencial no referido patógeno bacteriano Vibrio; - em que o referido gene essencial no referido patógeno bacteriano Vibrio é DNA adenina metilase (Dam).
39. Composto ingerível para o biocontrole de infecção de Vibrio em um organismo, caracterizado pelo fato de que compreende: - um alimento tratado para um organismo infectado e/ou suscetível a Vibrio tendo bactérias doadoras geneticamente modificadas que expressam pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo configurado para ser transportado para fora das referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas e absorvido por um patógeno bacteriano Vibrio, em que o referido pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo é identificado como SEQ ID NO. 1.
40. Composto ingerível para o biocontrole de infecção de Vibrio em um organismo aquático, caracterizado pelo fato de que compreende: - um alimento tratado para organismo aquático infectado e/ou suscetível a Vibrio tendo bactérias doadoras geneticamente modificadas que expressam pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo configurado para ser transportado para fora das referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas e absorvido pelo referido patógeno bacteriano Vibrio, em que o referido pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo é identificado como SEQ ID NO. 1.
41. Composto ingerível para o biocontrole de infecção de Vibrio em um organismo aquático, caracterizado pelo fato de que compreende: - um alimento tratado para um organismo aquático infectado e/ou suscetível a Vibrio tendo algas doadoras geneticamente modificadas que expressam pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo configurado para ser transportado para fora das referidas bactérias doadoras geneticamente modificadas e absorvido pelo referido patógeno bacteriano Vibrio, em que o referido pelo menos um polinucleotídeo asRNA heterólogo é identificado como SEQ ID NO. 1.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112020002689A2 (pt) 2017-08-07 2020-08-25 Pebble Labs Usa Inc. sistemas e métodos para o controle de doença de necrose hepatopancreática aguda
WO2021127573A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-24 San Diego State University (SDSU) Foundation, dba San Diego State University Research Foundation Compositions and methods for treating or ameliorating a mycobacterium tuberculosis infection

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5294533A (en) * 1988-07-05 1994-03-15 Baylor College Of Medicine Antisense oligonucleotide antibiotics complementary to the macromolecular synthesis operon, methods of treating bacterial infections and methods for identification of bacteria
PL351385A1 (en) * 1999-05-10 2003-04-07 Syngenta Participations Ag Regulation of viral gene expression
US20050227933A1 (en) * 2001-11-29 2005-10-13 Benkovic Stephen J Treatment of bacterial induced diseases using DNA methyl transferase inhibitors
US7247437B2 (en) * 2003-08-21 2007-07-24 Trustees Of Tufts College Vibrionaceae replication factors and methods of use thereof
US20080194504A1 (en) * 2004-02-06 2008-08-14 Advanced Bionutrition Corporation Rna-Mediated Interference to Control Disease in Terrestrial and Aquaculture Animals
WO2008027235A1 (en) * 2006-08-25 2008-03-06 University Of New Mexico Methods and compositions for control of disease in aquaculture
WO2011045796A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions for controlling varroa mites in bees
KR101242821B1 (ko) * 2011-01-31 2013-03-12 씨제이제일제당 (주) 비브리오 속 미생물에 대한 생물학적 방제용 프로바이오틱스
ES2691803T3 (es) * 2013-03-15 2018-11-28 Monsanto Technology Llc Composiciones y procedimientos para la producción y administración de ARN
CA2917108A1 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Basf Se Rnai for the control of phytopathogenic fungi and oomycetes by inhibiting the expression of cyp51 genes
MX2019002949A (es) * 2016-09-16 2020-01-27 Pebble Labs Usa Inc Sistema novedoso paratransgénico para el control biológico de mosquitos transmisores de enfermedades.

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