JP2013514771A - サトウキビでのCry抵抗性のシュガーケーンボーラーの防除および昆虫抵抗性管理のためのCRY1FaおよびCRY1Abタンパク質の併用 - Google Patents
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Abstract
Description
(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips bt_corn_refuge_2006.htm)
コーンボーラー保護Bt(Cry1AbおよびCry1F)トウモロコシ製品の特定の構造化要件は、以下の通りである:
構造化緩衝帯:コーンベルトで20%の非鱗翅目Btトウモロコシ緩衝帯;コットンベルトで50%の非鱗翅目Bt緩衝帯
ブロック
1.内部(すなわち、Bt圃場内)
2.外部(すなわち、任意交配を最大にするためにBt圃場から1/2マイル(可能であれば1/4マイル)以内に別個の圃場)
圃場内の帯状地
幼虫の移動の影響を低減するために、帯状地は少なくとも4条(好ましくは6条)の幅でなければならない
National Corn Growers Associationも、彼らのウェブサイト(ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn)で、要件に関して類似した指針を提供する。例えば:
コーンボーラーIRMの要件:
・トウモロコシ畑地の少なくとも20%に緩衝帯雑種を植える
・綿花生産地では、緩衝帯は50%でなければならない
・緩衝帯雑種の1/2マイル以内に植えなければならない
・緩衝帯は、Bt圃場内に帯状地として植えることができる;緩衝帯の帯状地は少なくとも4条の幅でなければならない
・標的昆虫の経済的許容限界に到達する場合だけ、緩衝帯を従来の殺虫剤で処理することができる
・Btベースの噴霧可能な殺虫剤を緩衝帯トウモロコシで用いることはできない
・Btトウモロコシのあらゆる農場に適当な緩衝帯を設けなければならない
Roush et al.(例えば、1780頁および1784頁の右欄)によって述べられるように、スタッキングまたはピラミッド化は、より小さな緩衝帯の使用を可能にすることができる。Roushは、良好なスタックのために、約30〜40%と比較して(およびそれより少ない)約10%の緩衝帯を提案している。
要約−Cry1Faバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)Cryタンパク質に対するCry1Ab感受性および抵抗性のシュガーケーンボーラーの応答
Cry1Faタンパク質は、シュガーケーンボーラー、ジアトラエア・サッカラリス(Diatraea saccharalis)のBt感受性(Bt−SS)およびBt抵抗性(Bt−RR)の両系統に対して殺虫活性を実証した。D.サッカラリス(D. saccharalis)のBt−RR系統は、トリプシン活性化Cry1Abタンパク質への142倍の抵抗性を実証した。D.サッカラリス(D. saccharalis)のこのBt抵抗性系統はCry1Faへの多少の交差抵抗性を示したが、抵抗比はかなり低減された(4倍)。D.サッカラリス(D. saccharalis)および他のコーンボーラー種でCry1Ab抵抗性を管理するために、Cry1Faが効果的である可能性をこの結果は示唆する。
材料および方法
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)Cryタンパク質
精製されたトリプシン活性化バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Bt)Cry1Abタンパク質は、Marianne Puztai−Carey博士、Department of Biochemistry、Case Western Reserve University、Cleveland、Ohioから得た。Cry1Faは、緩衝溶液に入れられて、Dow AgroSciences Company(Indianapolis、IN)によって提供された。Cry1Abは、99.9%の純度レベルで凍結乾燥された。
2004年に北東ルイジアナ州のWinnsboroの近くのトウモロコシ圃場から収集された幼虫を用いて、D.サッカラリス(D. saccharalis)のBt感受性系統(Bt−SS)を確立した。F↓2スクリーニングを用いて、単一のアイソラインファミリーからD.サッカラリス(D. saccharalis)のBt抵抗性系統(Bt−RR)を開発した。これらのBt抵抗性の昆虫は、市販のCry1Abトウモロコシハイブリッドの上で幼生発生を完了し、精製されたトリプシン活性化Cry1Ab毒素へのかなりの抵抗性レベルを実証した。Bt抵抗性の確認の間、Bt抵抗性系統の個体をBt感受性系統のものと戻し交配し、戻し交配のF↓2世代においてCry1Abトウモロコシ葉組織で抵抗性について再選択した。
Cry1AbおよびCry1FaへのD.サッカラリス(D. saccharalis)のBt−SSおよびBt−RR系統の幼虫感受性は、食餌混合手法を用いて判定した。各バイオアッセイで、6つまたは7つのCryタンパク質濃度を用いた。Bt濃度の範囲は、Cry1Abタンパク質の試験については0.03125から32μg/g、Cry1Faの評価については0.03125から128μg/gであった。Btタンパク質をCry1Abの試験のためには蒸留水の、またはCry1Faの検討のためには緩衝液の適当な量と混合することによって、Cryタンパク質溶液を調製した。次に、128セルトレイ(Bio−Ba−128、C−D International、Pitman、NJ)の個々のセルに食餌を分配する直前に、Bt溶液を明らかな成分をある程度含む食餌と混合した。バイオアッセイでは、10ml注射器(Becton、Dickinson and Company、Franklin Lakes、NJ)を用いて、各セルに約0.7mlの処理食餌を入れた。蒸留水(ブランク対照)または緩衝液だけで処理した食餌を対照処理として用いた。D.サッカラリス(D. saccharalis)の1新生子(<24時間)を、各セルの食餌表面に放した。幼虫を接種した後、セルをベント付のふた(C−D International、Pitman、NJ)でカバーした。バイオアッセイトレイは、28℃、50%RHおよび16:8(L:D)時間の光周期に維持された人工気候室に置いた。幼虫の死滅率、幼虫の重量、および重量増加を示さなかった(1幼虫につき<0.1mg)生存幼虫の数を、接種から7日目に記録した。Cryタンパク質濃度別の昆虫系統の各組合せを4反復にし、各反復には16〜32匹の幼虫が含まれた。
幼虫の死滅率基準は、「実際の」死滅率として測定され、それは、実際の死滅幼虫および有意な体重増加を示さなかった(1幼虫につき<0.1mg)生存幼虫を病的であるか非摂食昆虫と見なした。処理でのD.サッカラリス(D. saccharalis)の実際の死滅率は、以下の方程式を用いて計算された:実際の死滅率(%)=100×[死幼虫数+有意な体重増加を示さなかった(1幼虫につき<0.1mg)生存幼虫数]/試験昆虫の総数。各D.サッカラリス(D. saccharalis)系統の「実際の」死滅率(以降、死滅率と単純化する)は、Cry1Abを分析するための無処理対照食餌またはCry1Faを評価するための緩衝液だけで処理した食餌を与えた幼虫の死滅率で補正した。次に、50%(LC↓5↓0)死滅率値を引き起こしたCryタンパク質濃度および対応する95%信頼区間(CI)を決定するために、補正された用量/死滅率データをプロビット解析にかけた。プロビット解析で用いられた処理には、0死滅率をもたらした最高濃度、100%死滅率をもたらした最低濃度およびそれらの両極端の間の全ての結果が含まれた。抵抗性の比率は、Bt−RR系統のLC↓5↓0値をBt−SS昆虫のそれによって割ることによって計算された。抵抗性比率がα=0.05のレベルで有意であるかどうか判定するために、致死用量比判定法を用いた。死滅率データを分析するために二元配置ANOVAも用い、続いて処理差を判定するためにα=0.05レベルでのLSMEANS検定を用いた。
結果
Cryタンパク質処理食餌を与えたD.サッカラリス(D. saccharalis)のBt−SSおよびBt−RR系統の幼虫の死滅率。
Cry1Abタンパク質(図1):Cry1Abタンパク質濃度は、Bt−SSおよびBt−RRの両系統についてD.サッカラリス(D. saccharalis)の幼虫死滅率に有意な影響を及ぼした(F=90.67;df=6、42;P<0.0001)(図1)。Cry1Ab濃度の増加にともない、幼虫死滅率が増加した。Bt−SS系統の幼虫死滅率の有意なレベルが0.031μg/g以上で観察され、死滅率は32μg/gで100%近くに到達した。Bt−RR系統については、有意な死滅率が2μg/gで起こり、32μg/gで61%に到達した。幼虫死滅率におけるかなりの差が、2つの昆虫系統の間で観察された(F=346.73、df=1、42、P<0.0001)。Bt−RR系統の幼虫死滅率は、検討された全てのCry1Ab濃度でBt−SS昆虫のそれより有意に低かった(P<0.05)。昆虫系統および濃度の相互作用も、有意であった(F=18.82;df=6、42;P<0.0001)。Cry1Ab濃度の増加にともない、Bt−RR系統の幼虫死滅率は、Bt−SS系統のそれよりもゆっくりと増加した。
Cry1Abタンパク質(図3):Cry1Ab処理食餌を与えられたD.サッカラリス(D. saccharalis)のBt−SSおよびBt−RR系統の幼虫発育阻害は、濃度間で有意差があった(F=175.07;df=5、36;P<0.0001)。Bt−SSおよびBt−RR幼虫の発育は、Cry1Ab濃度の増加にともない低下した。昆虫系統の発育阻害に及ぼす影響は、Bt−SSとBt−RR系統の間で有意差があった(F=1182.51;df=1、36;P<0.0001)。Bt−SS系統の幼虫発育阻害は、試験した全てのBt濃度にわたってBt−RR系統のそれより有意に大きかった。試験した最低濃度である0.031μg/gの濃度では、Bt−RRはいかなる発育阻害も示さなかったが、Bt−SS幼虫は対照と比較して90%を超える発育阻害を有した。0.5μg/gでは、Bt−RRは27%の発育阻害を実証したが、Bt−SS幼虫の発育はほとんど完全に停止された。昆虫系統およびBt濃度の相互作用も、有意であった(F=110.72;df=5、36;P<0.0001)。Cry1Ab濃度の増加にともない、Bt−RR系統の幼虫発育阻害はBt−SS系統のそれより遅く増加した。
Claims (12)
- Cry1Fa殺虫性タンパク質をコードするDNAおよびCry1Ab殺虫性タンパク質をコードするDNAを含むサトウキビ植物。
- Cry1Faコア毒素含有タンパク質をコードするDNAおよびCry1Abコア毒素含有タンパク質をコードするDNAが遺伝子移入されている、請求項1に記載のサトウキビ植物。
- 請求項1に記載の植物の部分。
- 請求項1に記載の植物の挿し木繁殖体またはクローン繁殖体。
- 非Bt緩衝帯植物および請求項1に記載の複数のサトウキビ植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての植物の40%未満を構成する、圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の30%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の20%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の10%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の5%未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記サトウキビ植物が10エーカーよりも多くを占める、請求項5に記載の植物の圃場。
- 前記Cry1Faタンパク質が配列番号1と少なくとも99%同一であり、前記Cry1Abタンパク質が配列番号2と少なくとも99%同一である、請求項1に記載のサトウキビ植物。
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