CN109402095A - 一种蛋白酶及其制备低镉大米多肽的方法 - Google Patents

一种蛋白酶及其制备低镉大米多肽的方法 Download PDF

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谢艳萍
何球山
谭启程
张国军
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Abstract

本发明公开了一种蛋白酶及其制备低镉大米多肽的方法，属于生物酶技术领域。本发明提供的一种适用于工业化生产的中性蛋白酶，其酶活可达5898.5U/mL，并具有镉离子吸附能力，该酶的酶解反应条件温和，反应周期短，能够实现一步法水解和吸附，应用该蛋白酶制备获得的大米蛋白肽含量达97.2％，镉含量仅为0.078mg/kg，镉吸附率达90％以上，能够有效降低工业生产成本，实现安全食品的绿色生产。

Description

一种蛋白酶及其制备低镉大米多肽的方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶及其制备低镉大米多肽的方法，属于生物酶技术领域。
背景技术
镉是一种对人类健康有害的有毒金属，1974年联合国环境规划署和国际劳动卫生重金属委员会就将其定位重点污染物，美国读物管理委员会(ATSDR)也将其列为第6位危机人类健康的毒害物质。随着中国工业化的快速发展，大量的重金属以多种方式进入水体，造成地表水和地下水等环境的严重污染，进而使土壤或污染水源灌溉的农作物污染严重，极大影响了农作物的食用安全性和经济价值。
大米蛋白是一种高营养、低过敏性的优质谷物蛋白，有良好的氨基酸配比，含有人体所必须的八种氨基酸，非常适合作为老人、婴儿、病人的蛋白补充剂。它的主要成分为谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白。
近年来由于环境的污染，大米中所含的镉等重金属含量普遍偏高，导致现在大米蛋白镉含量严重超标。镉是毒性很强的重金属，当镉的含量超过1.0mg/kg时会严重危害人体的健康。镉很容易蓄积在人体的肾脏、骨组织、眼睛和其他器官和组织中，尤其是在肾脏和骨组织中的蓄积现象最为严重，可引发肾衰竭，易碎性骨折等疾病。目前的大米蛋白肽主要通过大米蛋白水解制备。然而，受到工艺条件的限制，水解过程不能直接有效地除去大米蛋白液中的重金属镉离子，若不进行镉离子的针对性吸附，易发生镉超标的品质缺陷；若在水解处理前/后引入额外的镉吸附工艺，增加了外源添加物和处理工序，使生产成本增加。
发明内容
为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明旨在提供一种适用于工业化生产的具有镉吸附作用的中性蛋白酶，实现一步法蛋白水解和镉吸附。
本发明的第一个目的是提供一种蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码该蛋白酶的DNA分子。
本发明的第三个目的是提供表达所述蛋白酶的基因工程菌。
本发明的第四个目的是提供携带编码所述蛋白酶的基因的载体。
本发明的第五个目的是提供所述蛋白酶在制备含肽的食品方面的应用。
本发明的第六个目的是提供一种大米蛋白肽的制备方法，所述方法应用所述蛋白酶水解大米蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述蛋白酶按1000～2000U/g大米蛋白的比例加入至质量浓度为7～9％的大米蛋白液中，于40～50℃，pH6～7的环境中反应4～6h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)在常温(20～25℃)下，将大米在0.01mol/L氢氧化钠溶液中浸泡8～10h，固液比为1:6～7(g/L)；
(2)将经过步骤(1)处理过的大米湿磨成浆，磨浆后的颗粒小于100μm；
(3)将步骤(2)得到的米浆离心，得到沉淀即为大米淀粉，上清液为大米蛋白；用柠檬酸、乳酸、或醋酸将上清pH调节到6.5，使大米蛋白沉淀，静置35min后，8000rpm离心10min，离心所得沉淀即为大米蛋白粉；
(4)将步骤(3)处理过的大米蛋白粉溶于清水，200-300rpm下搅拌30-60min后滤去液体，重复2-3次，用水调整料液质量浓度为7-9％；
(5)向步骤(4)得到的料液中加入终浓度为1000～2000U/g大米蛋白粉的蛋白酶，于40～50℃反应4～6h；
(6)将步骤(5)反应后的上层清液在-25～-15℃冷冻干燥20～28h，得到大米蛋白肽粉。
有益效果：本发明提供了一种适用于工业化生产的中性蛋白酶，其酶活可达5898.5U/mL，并具有镉离子吸附能力，该酶的酶解反应条件温和，反应周期短，能够实现一步法水解和吸附，应用该蛋白酶制备获得的大米蛋白肽含量达97.2％，镉含量仅为0.078mg/kg，镉吸附率达90％以上，能够有效降低工业生产成本，实现安全食品的绿色生产。
附图说明
图1为不同发酵时间的蛋白酶酶活；
图2为不同反应温度下的镉吸附率；
图3为不同反应pH下的镉吸附率。
具体实施方式
产蛋白酶筛选培养基：脱脂奶粉10g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，葡萄糖5g，琼脂粉16g，蒸馏水1L，pH 7.0，121℃灭菌30min。
镉含量的测定：利用电感耦合等离子体发射光谱法测定。镉的吸附率＝(C0-Ct)/C0×100％。其中，C0为对照上清液中镉的浓度(mg/L)；Ct为吸附后的上清液中镉的浓度(mg/L)。
产蛋白酶的发酵培养基(每100mL)：玉米粉4.5g，蛋白胨1.5g，淀粉0.2g，硫酸铵0.4g，氯化钠0.1g，氯化铵0.15g，硫酸锌0.4，磷酸氢二钠0.4g。
蛋白酶酶活测定：采用福林酚法测定粗酶液蛋白酶活力。
肽的含量测定方法为：根据GB/T 22492大豆肽粉中肽含量的测定方法进行测定，
实施例1产蛋白酶的菌株筛选
以大米种植区域的土壤为菌株筛选来源。
取10g样品加入到盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡混匀10min，采用10倍系列梯度稀释法进行稀释，取0.1mL 10-6稀释液加入到含100、200、400、600、800mg/L镉的产蛋白酶筛选培养基中，涂布均匀，倒置于30℃培养箱中。以不加镉的培养基为对照，将各培养基上获得的透明圈相对较大的单菌落利用平板划线法获得纯培养。
将所获得高产蛋白酶的菌株分别在培养至菌浓为1.0×109～5.0×109CFU/mL，分别离心，向培养基中加入终浓度为100mg/L的镉溶液[CdCl2·5H2O]，45℃下振荡处理4h，设3个重复，以加入等量无菌水的处理为对照。反应4h后，利用电感耦合等离子体发射光谱法测定各体系中镉的浓度，筛选获得高产蛋白酶且镉吸附率高的菌株4株。结果如表1所示。
表1
分别对上述菌株进行菌种鉴定，提取并纯化获得蛋白酶。对纯化后的蛋白酶进行酶学性质分析及测序。以蛋白酶活力最高且镉吸附率较高的Bacillus sp.D12所产的蛋白酶(SEQ ID NO.1所示)用于下一步研究。
实施例2蛋白酶的制备
将Bacillus sp.D12来源的蛋白酶进行密码子优化，获得SEQ ID NO.2所示的基因序列。合成SEQ ID NO.2所示基因，与质粒pMA5同时用限制性内切酶BamHI和NheI双酶切(引物分别为F：GGATCCATGAAACATACAGATAAAGTTGGCC；R：GCTAGCGATGTAAGCAGCTTTGAAAGCTTGT，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μL：1μL双切的载体，4μL双切的目的片段，5μL Solution I连接酶，16℃连接过夜得到pMA5-neutrase；转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，得到重组表达中性蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168pMA5-neutrase(简写为Bacillussubtilis NEU)。
将Bacillus subtilis NEU，在含有50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上划线，于37℃培养箱中培养过夜。第二天挑取单菌落至装有10ml LB液体培养基的试管中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，在37℃，200rpm摇床上培养约10h作为种子液。
将种子液以1％的接种量转接至发酵培养基中，37℃发酵72h，定时取样，离心测定上清液中的蛋白酶酶活，结果如图1所示。发酵60h的蛋白酶酶活可达5562U/mL，发酵72h可达5898.5U/mL。
实施例3蛋白酶在不同条件下的吸附效率
配制镉离子浓度为10mg/L的PBS缓冲液(pH7.0)，加入终浓度为1000U/mL实施例2制备的蛋白酶，分别于40～60℃反应4h，测定镉吸附率。结果显示，在40～50℃时，镉的吸附率达75％以上，反应温度为45℃时吸附率可达84.2％(图2)。
按照上述相同步骤配制pH为5～8的反应体系，加入终浓度为1000U/mL实施例2制备的蛋白酶，于45℃反应4h，测定镉吸附率。结果显示，在pH为6～7时，镉的吸附率达84.2％以上，pH为6.5时吸附率可达84.2％(图3)。
实施例4蛋白酶制备低镉大米蛋白肽
(1)在常温下，将镉含量超标(1.52mg/kg)的大米在0.01mol/L氢氧化钠溶液中浸泡10h，固液比为1:6(g/L)；
(2)将经过步骤(1)处理过的大米湿磨成浆，磨浆后的颗粒小于100μm；
(3)将步骤(2)得到的米浆离心，得到沉淀即为大米淀粉，上清液为大米蛋白；用柠檬酸、乳酸、或醋酸将上清pH调节到6.5，使大米蛋白沉淀，静置35min后，8000rpm离心10min，离心所得沉淀即为大米蛋白粉；
(4)将步骤(3)处理过的大米蛋白粉溶于清水，200-300rpm下搅拌30-60min后滤去液体，重复2-3次，用水调整料液质量浓度为7-9％；
(5)向步骤(4)得到的料液中加入终浓度为1000U/g大米蛋白粉的实施例2方法制备的蛋白酶，于45℃反应4h；
(6)将步骤(5)反应后的上层清液在-25℃冷冻干燥20h，得到大米蛋白肽粉。
对步骤(5)反应后的上清液中的镉含量及肽含量进行测定，结果显示，制备获得的大米蛋白肽含量达97.2％，镉含量为0.078mg/kg。
对比例1
应用商业化枯草杆菌蛋白酶(诺维信)、木瓜蛋白酶(武汉大华伟业医药有限公司)进行大米蛋白肽的制备，具体步骤同实施例4，结果如表2所示。市售的蛋白酶无法同时达到水解蛋白和吸附镉的效果。
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南汇升生物科技有限公司
<120> 一种蛋白酶及其制备低镉大米多肽的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Ala Val Asn Gln Thr Ile Ser Lys Val Val Asn Gly Lys Arg
1 5 10 15
Val Ile Thr Lys Lys Pro Glu Leu Leu Ala Pro Ala Gly Asn Leu Glu
20 25 30
Lys Leu Lys Ile Ala Val His Tyr Gly Ala Asp Ala Val Phe Ile Gly
35 40 45
Gly Gln Glu Tyr Gly Leu Arg Ser Asn Ala Asp Asn Phe Ser Ile Glu
50 55 60
Glu Ile Ala Glu Gly Val Glu Phe Ala Lys Lys Tyr Gly Ala Lys Ile
65 70 75 80
Tyr Val Thr Thr Asn Ile Phe Ala His Asn Glu Asn Met Asp Gly Leu
85 90 95
Glu Glu Tyr Leu Lys Ala Leu Gly Asp Ala Lys Val Ala Gly Ile Ile
100 105 110
Val Ala Asp Pro Leu Ile Ile Glu Thr Cys Arg Arg Val Ala Pro Asp
115 120 125
Val Glu Ile His Leu Ser Thr Gln Gln Ser Leu Ser Asn Trp Lys Ala
130 135 140
Val Gln Phe Trp Lys Glu Glu Gly Leu Asp Arg Val Val Leu Ala Arg
145 150 155 160
Glu Thr Ser Gly Leu Glu Ile Lys Glu Met Lys Glu Lys Val Asp Ile
165 170 175
Glu Ile Glu Thr Phe Ile His Gly Ala Met Cys Ile Ala Tyr Ser Gly
180 185 190
Arg Cys Val Leu Ser Asn His Met Thr Ala Arg Asp Ser Asn Arg Gly
195 200 205
Gly Cys Cys Gln Ser Cys Arg Trp Asp Tyr Asp Leu Tyr Gln Thr Asp
210 215 220
Gly Ala Asn Ala Val Ala Leu Tyr Asp Glu Glu Asp Ala Pro Phe Ala
225 230 235 240
Met Ser Pro Lys Asp Leu Lys Leu Ile Glu Ser Ile Pro Gln Met Ile
245 250 255
Glu Met Gly Ile Asp Ser Leu Lys Ile Glu Gly Arg Met Lys Ser Ile
260 265 270
His Tyr Val Ala Thr Val Val Ser Val Tyr Arg Lys Val Ile Asp Ala
275 280 285
Tyr Cys Ala Asp Pro Glu Asn Phe Val Ile Gln Lys Glu Trp Leu Asp
290 295 300
Glu Leu Asp Lys Cys Ala Asn Arg Asp Thr Ala Pro Ala Phe Phe Glu
305 310 315 320
Gly Thr Pro Gly Tyr Glu Glu Gln Met Phe Gly Glu His Gly Lys Lys
325 330 335
Thr Thr Phe Asp Phe Ala Gly Leu Val Leu Ala Tyr Asp Glu Glu Thr
340 345 350
Gln Met Val Thr Leu Gln Gln Arg Asn Phe Phe Lys Gln Gly Asp Glu
355 360 365
Val Glu Phe Phe Gly Pro Glu Ile Asp Asn Phe Thr Phe Thr Ile Gly
370 375 380
Thr Ile Trp Asp Glu Asp Gly Asn Glu Leu Asp Ala Ala Arg His Pro
385 390 395 400
Leu Gln Ile Val Thr Phe Lys Val Asp Lys Lys Ile Tyr Pro Ser Asn
405 410 415
Met Met Arg Lys Gly Lys
420
<210> 2
<211> 1695
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaacata cagataaagt tggccttaca acagttaacg gcccttctgc tatcatgcct 60
taccctttcg ttcatgctga aacagctgat cttgttgttg aaacaaaaga agatttcaaa 120
cgtaacggca accttacagc ttctcgtcaa aactctgatg aaaacggcca acaagatgct 180
cttaaaggca aagaagttca agctctttct tctaaagatg ttaacacaaa agctaaagtt 240
aacgatacac ttatcgttcg tcgtaaatct tacgatggca cacgtcttgt tcgttaccct 300
caaacatacg aaggccgtga tgtttacggc tacatctaca cagctcatat caacgatgat 360
ggcgttctta catctatcat cggcgattct gctaaagatc ttcaaaacaa agaagatctt 420
aaacaacctc gtcgtctttc tgaagaagat gctaaaaaac aacttttcaa catctacggc 480
aacgatctta cattcatcga agaacctgaa atcaaaggct acggctacgc tgatgaaaac 540
acagaaacag ctacaaacgc ttaccaaatc acattctctg cttctacacc tgaatacgtt 600
tctggctctg ttcttatcga tgctttcggc ggcaaccttc ttaaagaact tgttcaaaaa 660
cttggcatcc aagttgaatc ttctatcgtt caatctgcta catctaacaa atctacagat 720
ccttctaaac ttacaggcac aggcaaagat gatcttggca tcaaccgtac attcggcatc 780
acacaacgtt ctgctgatac atacatgctt gctgattact ctcgtggcaa aggcatcgaa 840
acatacacag ctaacatcca taaccgtaac aactaccgtc gtaacgtttg gggctacctt 900
gatgataacg cttggatcaa ctctatccaa ttcacagatc ctaaagctgt ttctgctcat 960
taccttgcta caaaagttta cgatttctac caagaagaat acggccgtaa ctctttcgat 1020
aacaacggcc aaaaagaact ttctgttgtt tctggctgga acacaaacga agctaacaaa 1080
ggcaacccta aacaatggtt caacgctttc tctaacggcg ctatgcttgt ttacggcgat 1140
cctatcgttc gtgctttcga tgttgctggc catgaattca cacatgctgt tacacgtaac 1200
gaatctggcc ttgaatacgc tggcgaagct ggcgctatca acgaagctct ttctgatatc 1260
cttggcgttg ctgttgaaaa atacgctaac aacggccaac aaaactggac aatgaaagat 1320
caatctggcc gtatcttccg tgatatgaaa gattaccaat accttacatc tcgttaccct 1380
gaagattacc gtcattacaa caaccttcct atcgatgctg atcatgatca tggcggcgtt 1440
catacaaacg ctatcggcaa agaaaaagtt gcttacctta tcgcttctgg cggctctcat 1500
aacggcgtta acatccatgg catcggcgaa gataaaatgt tcgatatctt ctactacgct 1560
aacacagctc ttcttaacat gacatctgat ttcaaagaac ttaaagaagc ttgcatccgt 1620
gttgctacaa acctttacgg caaagattct cttgaagttc aagctgttca acaagctttc 1680
aaagctgctt acatc 1695
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatccatga aacatacaga taaagttggc c 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctagcgatg taagcagctt tgaaagcttg t 31

Claims (10)

1.一种蛋白酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述蛋白酶的DNA分子。
3.表达权利要求1所述蛋白酶的基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为重组枯草芽孢杆菌。
5.携带权利要求2所述DNA分子的载体。
6.权利要求1所述蛋白酶在制备含肽的食品方面的应用。
7.一种大米蛋白肽的制备方法，其特征在于，应用权利要求1所述的蛋白酶水解大米蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的蛋白酶按1000～2000U/g大米蛋白的比例加入至质量浓度为7～9％的大米蛋白液中，于40～50℃，pH6～7的环境中反应4～6h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在常温下，将大米在0.01mol/L氢氧化钠溶液中浸泡8～10h，固液比为1:6～7；
(2)将经过步骤(1)处理过的大米湿磨成浆，磨浆后的颗粒小于100μm；
(3)将步骤(2)得到的米浆离心，得到沉淀即为大米淀粉，上清液为大米蛋白；用柠檬酸、乳酸、或醋酸将上清pH调节到6.5，使大米蛋白沉淀，静置35min后，8000rpm离心10min，离心所得沉淀即为大米蛋白粉；
(4)将步骤(3)处理过的大米蛋白粉溶于清水，200-300rpm下搅拌30-60min后滤去液体，重复2-3次，用水调整料液质量浓度为7-9％；
(5)向步骤(4)得到的料液中加入终浓度为1000～2000U/g大米蛋白粉的蛋白酶，于40～50℃反应4～6h；
(6)将步骤(5)反应后的上层清液在-25～-15℃冷冻干燥20～28h，得到大米蛋白肽粉。
10.应用权利要求7～9任一方法制备的低镉大米蛋白肽。
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