CN105018454A - 一种精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法 - Google Patents
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一种精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法。本发明公开了一种大肠杆菌重组表达精氨酸脱亚胺酶（ArginineDeiminase,以下简称ADI）的制备方法，主要包括重组表达方法、采用尿素作为变性剂的包涵体复性方法。其中重组表达制备而成的ADI其N末端不含甲硫氨酸。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及制药领域。更具体而言，本发明涉及一种重组精氨酸脱亚胺酶发明的制备方法，包括在大肠杆菌中的重组表达方法、包涵体变性及复性方法，采用本方法重组制备的精氨酸脱亚胺酶N末端不含有甲硫氨酸且酶比活性达20单位以上。
背景技术
精氨酸脱亚胺酶（Arginine Deiminase,以下简称ADI），是一种分子量约为46kd的蛋白酶，有多种微生物来源，包括人型支原体（Mycoplasma hominus）、精氨酸支原体（Mycoplasma arginini）、产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)等，其中以支原体来源的精氨酸脱亚胺酶活性最高。精氨酸脱亚胺酶在体内外均能将L-精氨酸降解为瓜氨酸和氨。
L-精氨酸是哺乳动物的一种重要营养物质，在细胞分裂过程中起着重要作用。人体正常细胞在氮的存在下，能够依靠精氨酰琥珀酸合成酶（以下简称ASS）利用瓜氨酸合成精氨酸，也就是说，人体正常细胞可以不需要外来精氨酸，通过自身合成精氨酸满足需要，即精氨酸是人体正常细胞非必需氨基酸。而某些癌症细胞，是精氨酸营养缺陷型，即这些癌症细胞缺乏精氨酰琥珀酸合成酶（以下简称ASS）的基因而不能自身合成精氨酸，只能利用外源的精氨酸才能存活。因此，通过降低血清精氨酸的水平，可阻断ASS缺陷型癌细胞精氨酸供给，即营养饥饿的方法实现抑制癌细胞增殖的目的。
已知人体多种癌细胞中均存在不同程度的ASS缺陷，如黑色素瘤、肝癌、肺癌、白血病、膀胱癌、间皮瘤、胰腺癌、脑瘤等，其中，恶性黑色素瘤和肝癌是典型的ASS缺陷型癌症细胞，体内外抑癌实验研究表明，重组精氨酸脱亚胺酶（ADI）能有效抑制抑制恶性黑色素瘤和肝癌的增殖并诱导其凋亡；两种肿瘤的荷癌裸鼠给予重组ADI后可显著抑制黑色素瘤和肝癌细胞的体内生长。
恶性黑色素瘤和肝癌是两种严重威胁人类生命的恶性肿瘤，患者在确诊后的一年内存活率较低。恶性黑色素肿瘤在白种人国家发病率较高，且近年的发病率正迅速增加。在世界上肝病流行的地区如中国，肝癌的发病率高。目前用于治疗该两种癌症的方法，主要是手术、化疗和放疗，但效果均不理想。而重组精氨酸脱亚胺酶特别是经聚乙二醇化修饰后，为治疗恶性黑色素瘤和肝癌提供了一种新的手段，并经临床试验证明有明显的治疗效果。
微生物来源的重组精氨酸脱亚胺酶血清半衰期只有5小时，且重复注射给药后会诱发严重的人体免疫反应。聚乙二醇是一种亲水性的大分子高聚物，蛋白或酶聚乙二醇化后能增加稳定性、降低其免疫原性和延长体内半衰期。例如用于治疗急性淋巴细胞白血病的聚乙二醇化L-天冬酰胺酶（商品名Oncaspar）。聚乙二醇化重组精氨酸脱亚胺酶和精氨酸酶已有专利报告（中国专利申请号：98805066.8公开号：CN1255944；中国专利申请号：200610011246.4，公开号：CN 101002945A；中国专利申请号：03825264.3，公开号：CN 1809378A）。美国Polaris公司研发的聚乙二醇化重组精氨酸脱亚胺酶（代号ADI-PEG-SS-20）正在进行 期治疗恶性黑色素肿瘤和肝癌的临床试验。
微生物来源特别是人型支原体的精氨酸脱亚胺酶工业制备利用基因工程技术，有文献和专利报道了大肠杆菌的原核表达系统（Jong-Eun Kim et. al., Protein Expression and Purification 53 (2007) 9–15;Satoru Misawa et. al., Journal of Biotechnology 36 (1994) 145-155）。目前，大肠杆菌重组制备精氨酸脱亚胺酶存在以下缺陷，尚未见有文献或专利公开中的解决方法。
1. 据报道，大肠杆菌重组制备的精氨酸脱亚胺酶的N端多出一个甲硫氨酸。
2. 已公开的重组精氨酸脱亚胺酶的包涵体复性均采用盐酸胍作为变性剂。盐酸胍工业化成本较高，且作为变性剂的复性方法，其复性率和和复性后酶比活性有待提高。
本发明公开了一种独特的重组表达ADI的原核大肠杆菌表达体系方法，表达的ADI氨基端经氨基酸测序证明不含甲硫氨酸残基。另一方面，本发明还公开了一种重组ADI的复性方法，该方法采用尿素作为变性剂，经特有的复性方法，重组ADI的复性率和酶比活性有明显提高。利用本专利公开的技术，重组制备的ADI更利于经聚乙二醇化后制备药物或是药物组合，用于治疗ASS缺陷型肿瘤。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法。
本发明的另一目的是提供一种新的精氨酸脱亚胺酶的变性复性方法。
本发明的第一方面，公开了一种新的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法。
本发明中精氨酸脱亚胺酶主要指来源人型支原体的精氨酸脱亚胺酶（序列SEQ ID NO:1）及其突变体（序列SEQ ID NO:2）。该突变体为在序列SEQ ID NO:1的基础上，分别将其氨基端112位的赖氨基酸突变为谷氨基酸，氨基端的210位脯氨基酸突变为丝氨基酸获得，命名为ADI-ES。二者均含有409个氨基酸，一个半胱氨酸。
本发明第一方面所述的重组表达方法包括以下步骤：
选用pET系统作为表达质粒载体、大肠杆菌作为宿主菌；
选用两种合适的核苷酸内切酶，分别双酶切质粒载体和精氨酸脱亚胺酶基因后，连接构建重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌宿主菌筛选重组表达菌菌株；
将重组表达菌株转至培养基中一定温度下发酵培养，用诱导剂诱导表达目的蛋白。
本发明第一方面步骤所述的质粒载体为pET-3c或在pET-3c基础上改造的载体，优选为pET-3c。
本发明第一方面步骤所述的表达宿主菌为大肠杆菌，更具体为E.coli BL21、E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）plysS,优选为E.coli BL21 (DE3)pLysS。
本发明第一方面步骤所述的精氨酸脱亚胺酶基因序列，是基于序列SEQ ID NO:1和序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱密码子对应而成的cDNA核苷酸序列。该核苷酸序列为了插入表达重组pET载体，5'端设计含NdeⅠ核酸内切酶位点、3'端设计含BamHⅠ核酸内切酶位点。
本发明第一方面步骤所述的核苷酸内切酶分别为5'端为NdeⅠ核酸内切酶、3'端为BamHⅠ核酸内切酶。
本发明第一方面步骤所述的培养基选用适合大肠杆菌生长的培养基，可以是LB、M9CA、M9-YE-Glu培养基或在这些培养基基础上的改进及其组合。其中，LB、M9CA、M9-YE-Glu培养基的组成如下：
LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L；
M9CA 培养基组成为：Na2HPO4·7H2O 12.8g/L, KH2PO4 3.0g/L, NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，葡萄糖4g/L，MgSO4 0.24g/L，CaCl2 0.011g/L，酪蛋白氨基酸2.0g/L。
M9-YE-Glu培养基组成： Na2HPO4·7H2O 30g/L，NH4Cl 1.0g/L，NaCl 0.5g/L，KH2PO4 5.0g/L, 葡萄糖10g/L，酵母提取物 5g/L 和胰蛋白胨3g/L。
本发明第一方面步骤所述的培养温度，选用为20℃～45℃,优选为35℃～40℃，最优选为37℃。
本发明第一方面步骤所述的诱导剂，可以选用乳糖、半乳糖或IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），优选为IPTG。
步骤所述的诱导剂IPTG浓度，可以选用0.1mM~2mM，优选为0.5mM~1.0mM,最优选为0.5mM。
步骤所述的培养时间，可以选用1h~10h，优选为2~5h，更优选为3h。
本发明的第二方面，提供了一种新的精氨酸脱亚胺酶的复性方法。
本发明第二方面所述的复性方法，包括以下步骤：
将洗涤后的精氨酸脱亚胺酶的包涵体用含碱性缓冲及还原剂的高pH尿素，按一定比例溶解，搅拌；
配制复性稀释液，调至合适的pH，在一定温度下，按一定比例，将步骤中已搅拌溶解的精氨酸脱亚胺酶尿素溶解液迅速稀释；
将步骤中用复性稀释液稀释后的精氨酸脱亚胺酶溶液，在一定温度下，放置一定时间。
本发明第二方面步骤所述的缓冲试剂是指含有具有碱性pH缓冲作用的溶液，可以是Tris、磷酸盐、乙醇胺、氨基酸等，本发明优选为磷酸盐缓冲，更优选为磷酸钾缓冲溶液。
本发明第二方面步骤所述的还原剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇或半胱氨酸，本发明优选为二硫苏糖醇，其浓度范围为0.1mM~100mM，优选为5mM~15mM，最优选为10mM。
本发明第二方面步骤所述的pH范围为7.0~13.0。
本发明第二方面步骤所述的尿素浓度范围为5M~10M，优选为8M。
本发明第二方面步骤所述的溶解比例为尿素（体积，单位ml）：包涵体湿重（重量，单位g）为1:1~100:1，优选为5:1~10:1。
本发明第二方面步骤所述的复性稀释液的pH范围为6.5~9.0，优选为7.0~8.0。
本发明第二方面步骤所述的复性稀释比例范围为10:1~1000:1，优选为50:1~200:1。
本发明第二方面步骤和步骤所述的复性温度范围为10℃~25℃。
本发明第二方面步骤所述的放置时间范围为12h~96h。
附图说明
图1：pET-3c-ADI重组质粒构建示意图。
图2：pET-3c-ADI酶切鉴定图。其中，泳道1为酶切鉴定正确的pET-3c-ADI重组质粒；泳道2-4为酶切鉴定错误的重组质粒；泳道5为Marker。
图3：pET-3c-ADI的cDNA测序报告。其中，Sequence 6 为ADI的设计序列，Sequence 7为pET-3c-ADI重组质粒的测序序列。
图4：ADI 的SDS-PAGE图。
其中，泳道1为pET-3C-ADI/ BL21 Star（DE3）plysS重组工程菌诱导前；
泳道2为pET-3C-ADI/ BL21 Star（DE3）plysS重组工程菌诱导后；
泳道3为ADI包涵体处理；
泳道4为ADI粗纯化；
泳道5为ADI精纯化。
图5：ADI的氨基端15个氨基酸图谱。其中，图谱20131317 D01.lcd--20131317 D04lcd分别对应ADI氨基端第1-4个氨基酸。
图6: ADI酶活测定图。
下述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明的限制。
具体实施方案
实例1. 精氨酸脱亚胺酶cDNA序列的人工合成
根据精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列（SEQ ID NO:1）而设计的cDNA序列（SEQ ID NO:3），委托人工全基因合成核苷酸序列，嵌入pMD 19-T载体，命名为
名为pMD 19-ADI。
实例2. 精氨酸脱亚胺酶重组质粒和工程菌株的构建
以pMD 19-ADI质粒为模板，用NdeⅠ核酸内切酶和BamHⅠ核酸内切酶双酶切，回收目的片段，再用T4 DNA连接酶与质粒pET-3C（购于Invitrogen）同样经NdeⅠ和BamHⅠ酶切回收的片段连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10，用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3c-ADI（见附图2）。经DNA测序（TAKARA，大连）证明重组质粒中ADI的cDNA序列正确后（见附图3），转化大肠杆菌表达宿主菌BL21 Star（DE3）plysS（Novagen）。经表达筛选获得重组表达菌株。构建示意图见附图1。
实例3. 重组精氨酸脱亚胺酶的发酵培养
将表达最佳的pET-3C-ADI/ BL21 Star（DE3）plysS重组工程菌划线接种于LA琼脂平板，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1000ml，121℃，高压灭菌30min）试管中，37℃培养12小时，然后按1%的比例转接到含200ml LB培养液的1000ml三角瓶中，37℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5%的比例接种于含YT培养液（胰蛋白胨4g/L，酵母提取物3g/L，Na2HPO4·12H2O 30g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，葡萄糖8g/L，121℃，高压灭菌30min）的30L发酵罐中，37℃培养，整个发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30%以上，用28%的氨水调节pH并保持在7.0。至菌液OD600达到10～14时，加入终浓度为0.2mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），继续培养4小时后停止发酵，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。
实例4. 重组精氨酸脱亚胺酶的包涵体处理
破菌
从-20℃冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液（20mM K2HPO4, 5mM EDTA，0.1mg/ml溶菌酶，30μg/ml DNAase），25℃搅拌过夜，10000rpm，10min，取沉淀，弃上清。
包涵体洗涤
洗涤1：取破菌沉淀，放入洗涤液中（20mM K2HPO4，4.0% Triton-100），均质机均散后，25℃搅拌1h，10000rpm，10min，取沉淀，弃上清。
洗涤2：取洗涤1所得沉淀，放入洗涤液中（20mM K2HPO4, 2mM EDTA），均质机均散后，25℃搅拌1h，10000rpm，10min，取沉淀，弃上清。
洗涤3：取洗涤2所得沉淀，放入洗涤液中（20mM K2HPO4），均质机均散后，25℃搅拌1h，10000rpm，10min，取沉淀，弃上清。
洗涤4：取洗涤3所得沉淀，放入洗涤液中（30%乙醇），均质机均散后，25℃搅拌1h，10000rpm，10min，取沉淀，弃上清。
取洗涤4：所得的沉淀，放入溶解液中（8M尿素、20mM K2HPO4、10mM DTT，pH11.5），均质机均散后，25℃搅拌1h，10000rpm，10min，取上清，弃沉淀。
实例5.重组精氨酸脱亚胺酶的复性
取包涵体洗涤后所得的沉淀，放入溶解液中（8M尿素、20mM K2HPO4、10mM DTT，pH11.5），均质机均散后，25℃搅拌1h，10000rpm，10min，取上清，弃沉淀取离心后的精氨酸脱亚胺酶尿素溶解液，冷却至15℃，按体积比1:100的比例，用已冷却至15℃的复性液迅速稀释（20mM K2HPO4，pH7.2），15℃恒温箱中静置72h。0.45μm过滤膜过滤。
实例6. 重组精氨酸脱亚胺酶的纯化
将复性后的精氨酸脱亚胺酶溶液，用DEAE-Sepharose FF柱层析进行纯化。用平衡液（20mM K2HPO4，pH7.2）平衡后，上DEAE-Sepharose FF柱分离纯化目的蛋白，用含20mM K2HPO4的0~2000mM 的NaCl线性梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰。将纯化后的重组蛋白经12%的聚丙酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝显示分子量约为46KD的单一条带，纯度大于95%（见附图4），RP-HPLC分别检测为单一色谱峰。纯化制备的精氨酸脱亚胺酶重组蛋白经过N端序列分析，其N端15个氨基酸序列为SVFDSKFNGIHVYSE，N端不含甲硫氨酸。（见附图5）。
实例7. 精氨酸脱亚胺酶突变体（ADI-ES）的重组制备
根据精氨酸脱亚胺酶突变体（ADI-ES）的氨基酸序列（SEQ ID NO:2），按照实例1-6的方法完成cDNA的人工合成、重组表达载体构建和表达菌株筛选；经发酵、菌体包涵体处理、变性、复性和精纯化后，同样获取N末端无甲硫氨酸的重组ADI-ES。
实例8. 精氨酸脱亚胺酶的酶活测定
精密称取0. 175g L-瓜氨酸，溶于10mL蒸馏水中作为贮备液（100mM），取贮备液100 uL用蒸馏水定容至10mL（终浓度1mM），作为阳性对照品母液。用0.1M PB稀释液将待测样品和阳性对照分别按一定倍数梯度稀释至5μg/ml。在试管中依次加入100ulPB稀释液、100ul 0.1M的精氨酸溶液、800μl的样品，混匀。在37℃恒温水浴中保温5min（计时），各加入1mL终止液（V（H2SO4） ：V（H3PO4）=1：3），混匀后各加入50uL显色液（3﹪的二乙酰一肟），混匀，避光。在PCR仪中98℃ 反应15min。分别取150uL各样品及阳性对照稀释液，对应加入酶标板中，在490nm下测定吸光值。取重组ADI和ADI-ES精纯化的样品，用Lowry法和紫外吸收法测定相应蛋白含量，经测定两者的酶比活性分别为28.5和30.1。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆派金生物科技有限公司
<120> 一种精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法
<160> 3
<210> SEQ ID NO:1
<211> 409
<212> PRT
<213> Mycoplasma hominus
<400> 1
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile
50 55 60
Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu
85 90 95
Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys
100 105 110
Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu
115 120 125
Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu
130 135 140
Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp
145 150 155 160
Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr
165 170 175
Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn
180 185 190
His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys
195 200 205
Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu
210 215 220
Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu
225 230 235 240
Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val
245 250 255
Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp
260 265 270
Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn
275 280 285
Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu
290 295 300
Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala
325 330 335
Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr
340 345 350
Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys
355 360 365
Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His
370 375 380
Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met
385 390 395 400
Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405
<210> SEQ ID NO:2
<211> 409
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile
50 55 60
Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu
85 90 95
Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Glu
100 105 110
Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu
115 120 125
Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu
130 135 140
Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp
145 150 155 160
Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr
165 170 175
Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn
180 185 190
His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys
195 200 205
Met Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu
210 215 220
Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu
225 230 235 240
Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val
245 250 255
Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp
260 265 270
Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn
275 280 285
Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu
290 295 300
Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala
325 330 335
Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr
340 345 350
Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys
355 360 365
Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His
370 375 380
Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met
385 390 395 400
Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405
<210> SEQ ID NO:3
<211> 1242
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
catatgagcg tgtttgatag caaatttaat ggcattcatg tgtatagcga aattggcgaa 60
ctggaaaccg tgctggtgca tgaaccgggc cgtgaaattg attatattac cccggcgcgt 120
ctggatgaac tgctgtttag cgcgattctg gaaagccatg atgcgcgtaa agaacatcag 180
agctttgtga aaattatgaa agatcgtggc attaatgtgg tggaactgac cgatctggtg 240
gcggaaacct atgatctggc gagcaaagcg gcgaaagaag aatttattga aacctttctg 300
gaagaaaccg tgccggtgct gaccgaagcg aataaaaaag cggtgcgtgc gtttctgctg 360
agcaaaccga cccatgaaat ggtggaattt atgatgagcg gcattaccaa atatgaactg 420
ggcgtggaaa gcgaaaatga actgattgtg gacccgatgc cgaatctgta ttttacccgt 480
gatccgtttg cgagcgtggg caatggcgtg accattcatt ttatgcgtta tattgtgcgt 540
cgtcgtgaaa ccctgtttgc gcgttttgtg tttcgtaatc atccgaaact ggtgaaaacc 600
ccgtggtatt atgatccggc gatgaaaatg ccgattgaag gcggcgatgt gtttatttat 660
aataatgaaa ccctggtggt gggcgtgagc gaacgtaccg atctggatac cattaccctg 720
ctggcgaaaa atattaaagc gaataaagaa gtggaattta aacgtattgt ggcgattaat 780
gtgccgaaat ggaccaatct gatgcatctg gatacctggc tgaccatgct ggataaaaat 840
aaatttctgt atagcccgat tgcgaatgat gtgtttaaat tttgggatta tgatctggtg 900
aatggcggcg cggaaccgca gccgcagctg aatggcctgc cgctggataa actgctggcg 960
agcattatta ataaagaacc ggtgctgatt ccgattggcg gcgcgggcgc gaccgaaatg 1020
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Claims (13)
1.一种大肠杆菌重组表达N末端不含甲硫氨酸的精氨酸脱亚胺酶的制备方法，包括：重组表达方法、尿素作为变性剂的包涵体复性方法，其中精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2。
2.权利1所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其步骤包括：
选用pET质粒作为表达载体、大肠杆菌作为宿主菌；
选用两种合适的核苷酸内切酶，重组构建表达质粒，再转入宿主菌筛选重组表达精氨酸脱亚胺酶菌株；
重组表达菌株在一定的培养基中一定温度下培养，经诱导剂诱导表达重组精氨酸脱亚胺酶。
3.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所述的质粒载体，优选为pET-3c。
4.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所述的大肠杆菌宿主菌为E.coli BL21、E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）plysS，优选为E.coli BL21 (DE3)pLysS。
5.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所采用的培养基为LB、M9CA、M9-YE-Glu培养基。
6.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所采用的培养温度范围为26℃～37℃,优选为37℃；采用的诱导时间为2~5h。
7.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所述的诱导剂为乳糖、半乳糖或IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），优选IPTG。
8.权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶的复性方法，其特征在于，采用尿素做为变性剂，包括以下步骤：
将重组精氨酸脱亚胺酶表达的包涵体用含还原剂的高浓度尿素，按一定比例变性溶解；
在一定温度下，将碱性复性稀释液按一定比例加入尿素变性溶解液中；
将步骤中用复性稀释液稀释后含重组精氨酸脱亚胺酶复性溶液，在一定温度下进行足够时间的复性反应。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤中所用的尿素浓度为6M~10M。
10.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤中所述的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇或半胱氨酸，优选10mM的二硫苏糖醇。
11.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤中所述的碱性复性稀释液的pH值范围为8.0～11.0，优选为9.5。
12.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤和步骤中所述的温度范围为10℃~20℃，优选15℃。
13.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤所述的复性稀释比例范围为10:1~100:1，优选40:1；复性时间范围为12~96小时。
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