CN1769437A - 一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法 - Google Patents

一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法 Download PDF

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徐斌
杨萍
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Abstract

本发明公开了一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，所述谷氨酰胺转胺酶由序列表SEQ IDNo1所示的核苷酸序列所编码的序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列，一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，包括如下步骤：(1)根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，获得表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET－22b(+)中，构建表达载体pET－MTG，并转化大肠杆菌成为工程菌；(2)重组MTG包涵体的纯化和复性，即得到一种由序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。

Description

一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种基因重组蛋白及其制备方法，特别是涉及一种茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)微生物中谷氨酰胺转胺酶(MicrobialTransglutaminase，MTG)及其制备方法。
背景技术
从微生物中例如从茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)中分泌的谷氨酰胺转胺酶(MTG，E2.3.2.13)是一种催化多肽链中谷氨酰胺的γ-酰基转移至另一底物中氨基，形成γ-谷氨酰化合物的转移酶。如底物为蛋白质，它能催化两个蛋白质之间的交联反应。底物包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽类肌动球蛋白等。通过催化蛋白质或多肽之间的交联反应，提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳定性、乳化性等功能，使蛋白质类食品在质构、外观和风味得到了改善，并提高了蛋白质的营业价值。目前，MTG已广泛应用于食品工业。谷氨酰胺转胺酶广泛存在于动物许多组织中，但由于含量低、分离困难、热稳定性差、对钙离子的依耐性，使之工业化生产十分困难。上世纪80年代末，Ando等发现茂原链轮丝菌、肉桂链轮丝菌和灰肉链轮丝菌等能分泌MTG，该MTG具有热稳定性、不需要钙离子，产物交联程度高等特点。虽然MTG已工业化生产，但生产成本仍然较高，限制了它的进一步应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，所述PCR引物的正向引物为SEQ ID No3所示，所述PCR引物的反向引物为SEQ ID No4所示，获得表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，所述谷氨酰胺转胺酶的基因片段由序列表SEQ IDNo1所示，通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET-MTG，并转化大肠杆菌成为工程菌；
(2)重组MTG包涵体的纯化和复性：诱导后的工程菌，经超声破菌后离心取沉淀，再经过洗涤获得MTG包涵体；将纯化的包涵体溶于20mol、pH＝8.0 Tris-HCl中，使包涵体蛋白浓度为18～22mg/ml，所述Tris-HCl中含8mol/L尿素，20mmol/L二硫苏糖醇和1mmol/L乙二铵四乙酸二钠，室温搅拌1～3小时，离心去除沉淀后，用HCl调pH至3～5，再次离心去除沉淀，用20mmol、pH4.0的乙酸缓冲液稀释50倍，4℃搅拌放置5～15h，用NaOH水溶液调pH至6.0～7.0，离心去除沉淀后，用10倍体积的20mmol、pH＝6.0磷酸缓冲液，透析二次，复性产物，上SP-琼脂糖凝胶柱，用pH＝6.0磷酸缓冲液洗去未结合的成分，再用0.5mol/LNaCl水溶液洗脱，洗脱液透析后进行超滤浓缩，冻干，即得到一种由序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。
本发明利用基因工程的原理，将谷氨酰胺转胺酶(MTG)的基因克隆至原核表达载体，利用pET(一种用于在大肠杆菌中表达重组蛋白的质粒载体)系统高效表达，建立简便有效的MTG包涵体复性方法，而制备出重组MTG蛋白即谷氨酰胺转胺酶。本发明制备谷氨酰胺转胺酶的方法产量高，成本低。
附图说明
图1.PCR方法扩增MTG片段图；
图2.Nde I+Xho I双酶切PET-MTG电泳图；
图3.MTG纯化SDS-PAGE图；
图4.MTG对牛血清白蛋白的交联作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于下述实施例：
实施例1
一种谷氨酰胺转胺酶，它具有序列表SEQ ID No1所示的核苷酸序列所编码的序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列。
实施例2
一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)PCR扩增MTG基因：根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，以1μg茂原链轮丝菌基因组DNA为PCR反应模板，正向引物为5’-TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC-3’(SEQ ID No3所示)，反向引物为5’-TAAAAACTCAGGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3’(SEQ ID No4所示)，PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件是在94C变性5分钟后开始循环，然后94C变性50秒，58℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环后，再于72℃延伸10分钟，扩增出一条与预计大小(993bp)相符的表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，(由序列表SEQ ID No1所示)(图1)
MTG表达质粒的构建：凝胶回收的PCR产物和pET-22b(+)载体分别用NdeI和XhoI双酶切，并从1％的琼脂糖凝胶中通过凝胶回收试剂盒回收，然后进行连接(16℃，16h)，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证(图2)并进行DNA测序鉴定，重组质粒测序结果显示插入DNA片段序列与GenBank登记的MTG基因序列完全相同。构建的表达质粒被称为pET-MTG；
MTG在E.coli中的表达：以测序验证的pET-MTG表达质粒分别转化BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)感受态细胞；挑取单菌落接种于含50mg/ml氨卞青霉素的LB培养基中，后二种E.coli的培养基中含有50mg/ml氨卞青霉素和30mg/ml氯霉素，37℃振荡培养至OD约为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导3h，离心收集菌体；(2)重组MTG包涵体的纯化和复性：诱导后的工程菌，以50mmol/L、pH8.0 Tris-HCl(含1mmol/L EDTA)悬浮，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，其中沉淀部分(包涵体)以50mmolTris-HCl(pH8.0，含100mmmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100)重悬，并经超声处理洗涤3次，然后再以不含Triton X-100的同一缓冲液洗涤3次，得到纯化的包涵体；MTG的复性参昭Kashiwagi等方法并进行了改进，包涵体中含蛋白浓度为20mg/ml，溶于20mol、pH8.0Tris-HCl中，所述Tris-HCl中含8mol/L尿素，20mmol/L DTT和1mmol/L EDTA，室温搅拌2h，离心去除沉淀后，用HCl调pH至4.0，再次离心去除沉淀，用20mmol、pH4.0的乙酸缓冲液稀释50倍，4℃搅拌放置10小时，用0.5molNaOH调pH至6.0，离心去除沉淀后，用10倍20mmol、pH＝6.0磷酸缓冲液透析二次，复性产物上SP-琼脂糖凝胶(Sepharose)柱，用pH6.0磷酸缓冲液洗去未结合的成分，再用含0.5M NaCl洗脱，洗脱液透析后进行超滤浓缩，冻干，即得到一种由序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。所有样品以SDS-PAGE进行分析(图3)，以Lowry法测定蛋白浓度，共获得MTG蛋白(谷氨酰胺转胺酶)102.4mg。图3为MTG纯化SDS-PAGE图，MTG纯化结果：1、蛋白分子量Marker；2、大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导前总蛋白；3、大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导后总蛋白；4、分离的包涵体；5、纯化的MTG。
实施例3
一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)同实施例1
(2)重组MTG包涵体的纯化和复性：诱导后的工程菌，以50mmol/L、pH8.0 Tris-HCl(含1mmol/L EDTA)悬浮，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，其中沉淀部分(包涵体)以50mmolTris-HCl(pH8.0，含100mmmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100)重悬，并经超声处理洗涤3次，然后再以不含Triton X-100的同一缓冲液洗涤3次，得到纯化的包涵体；MTG的复性参照Kashiwagi等方法并进行了改进，包涵体中含蛋白浓度为18mg/ml，溶于20mol、pH8.0Tris-HCl中，所述Tris-HCl中含8mol/L尿素，20mmol/L DTT和1mmol/L EDTA，室温搅拌1h，离心去除沉淀后，用HCl调pH至3.0，再次离心去除沉淀，用20mmol、pH4.0的乙酸缓冲液稀释50倍，4℃搅拌放置5小时，用0.5mol NaOH调pH至6.0，离心去除沉淀后，用10倍20mmol、pH＝6.0磷酸缓冲液透析二次，复性产物上SP-Sepharose柱，用pH6.0磷酸缓冲液洗去未结合的成分，再用含0.5M NaCl洗脱，洗脱液透析后进行超滤浓缩，冻干，即得到一种谷氨酰胺转胺酶。
实施例4
一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)同实施例1
(2)重组MTG包涵体的纯化和复性：诱导后的工程菌，以50mmol/L、pH8.0 Tris-HCl(含1mmol/LEDTA)悬浮，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，其中沉淀部分(包涵体)以50mmolTris-HCl(pH8.0，含100mmmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100)重悬，并经超声处理洗涤3次，然后再以不含Triton X-100的同一缓冲液洗涤3次，得到纯化的包涵体；MTG的复性参照Kashiwagi等方法并进行了改进，包涵体中含蛋白浓度为22mg/ml，溶于20mol、pH8.0 Tris-HCl中，所述Tris-HCl中含8mol/L尿素，20mmol/L DTT和1mmol/L EDTA，室温搅拌3h，离心去除沉淀后，用HCl调pH至5.0，再次离心去除沉淀，用20mmol、pH4.0的乙酸缓冲液稀释50倍，4℃搅拌放置5小时，用0.5mol NaOH调pH至7.0，离心去除沉淀后，用10倍20mmol、pH＝6.0磷酸缓冲液透析二次，复性产物上SP-Sepharose柱，用pH6.0磷酸缓冲液洗去未结合的成分，再用含0.5M NaCl洗脱，洗脱液透析后进行超滤浓缩，冻干，即得到一种谷氨酰胺转胺酶。
实施例5
MTG的活性测定和对牛血清白蛋白(BSA)的交联作用
比色法测定MTG活性。一个MTG的酶活单位为：37℃时，催化底物CBZ-Gln-Gly生成1μmolL-谷氨酰γ-单异羟基肟酸。BSA的交联实验：BSA溶解于含2mmol DTT的磷酸缓冲液-生理盐水(PBS)，蛋白浓度为1mg/ml，反应总体积为1ml，先在50℃保温10分钟，然后加入1u MTG，37℃保温，对照组为未加入MTG的反应体系。于10、20、30和60分钟取样作SDS-PAGE进行观察(图4)。根据蛋白测定及酶的活性测定，重组MTG的比活为21.5u/mg。
序列表SEQ ID No1
gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc tacgccgaaa cctaccgcct cacggcggat
gacgtcgcga acatcaacgc gctcaacgaa agcgctccgg ccgcttcgag cgccggcccg
tcgttccggg cccccgactc cgacgacagg gtcacccctc ccgccgagcc gctcgacagg
atgcccgacc cgtaccgtcc ctcgtacggc agggccgaga cggtcgtcaa caactacata
cgcaagtggc agcaggtcta cagccaccgc gacggcagga agcagcagat gaccgaggag
cagcgggagt ggctgtccta cggctgcgtc ggtgtcacct gggtcaattc gggtcagtac
ccgacgaaca gactggcctt cgcgtccttc gacgaggaca ggttcaagaa cgagctgaag
aacggcaggc cccggtccgg cgagacgcgg gcggagttcg agggccgcgt cgcgaaggag
agcttcgacg aggagaaggg cttccagcgg gcgcgtgagg tggcgtccgt catgaacagg
gccctggaga acgcccacga cgagagcgct tacctcgaca acctcaagaa ggaactggcg
aacggcaacg acgccctgcg caacgaggac gcccgttccc cgttctactc ggcgctgcgg
aacacgccgt ccttcaagga gcggaacgga ggcaatcacg acccgtccag gatgaaggcc
gtcatctact cgaagcactt ctggagcggc caggaccggt cgagttcggc cgacaagagg
aagtacggcg acccggacgc cttccgcccc gccccgggca ccggcctggt cgacatgtcg
agggacagga acattccgcg cagccccacc agccccggtg agggattcgt caatttcgac
tacggctggt tcggcgccca gacggaagcg gacgccgaca agaccgtctg gacccacgga
aatcactatc acgcgcccaa tggcagcctg ggtgccatgc atgtctacga gagcaagttc
cgcaactggt ccgagggtta ctcggacttc gaccgcggag cctatgtgat caccttcatc
cccaagagct ggaacaccgc ccccgacaag gtaaagcagg gctggccgtg a
序列表SEQ ID No2
DNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAPAASSAGPSFRAPDSDDRVTPPAEPLDRMPDPYRPSYG
RAETVVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELK
NGRPRSGETRAEFEGRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNED
ARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKRKYGDPDAFRPAPGTGLVDM
SRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFRNWSEGYS
DFDRGAYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP
重组质粒的测序结果
gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc tacgccgaaa cctaccgcct cacggcggat
gacgtcgcga acatcaacgc gctcaacgaa agcgctccgg ccgcttcgag cgccggcccg
tcgttccggg cccccgactc cgacgacagg gtcacccctc ccgccgagcc gctcgacagg
atgcccgacc cgtaccgtcc ctcgtacggc agggccgaga cggtcgtcaa caactacata
cgcaagtggc agcaggtcta cagccaccgc gacggcagga agcagcagat gaccgaggag
cagcgggagt ggctgtccta cggctgcgtc ggtgtcacct gggtcaattc gggtcagtac
ccgacgaaca gactggcctt cgcgtccttc gacgaggaca ggttcaagaa cgagctgaag
aacggcaggc cccggtccgg cgagacgcgg gcggagttcg agggccgcgt cgcgaaggag
agcttcgacg aggagaaggg cttccagcgg gcgcgtgagg tggcgtccgt catgaacagg
gccctggaga acgcccacga cgagagcgct tacctcgaca acctcaagaa ggaactggcg
aacggcaacg acgccctgcg caacgaggac gcccgttccc cgttctactc ggcgctgcgg
aacacgccgt ccttcaagga gcggaacgga ggcaatcacg acccgtccag gatgaaggcc
gtcatctact cgaagcactt ctggagcggc caggaccggt cgagttcggc cgacaagagg
aagtacggcg acccggacgc cttccgcccc gccccgggca ccggcctggt cgacatgtcg
agggacagga acattccgcg cagccccacc agccccggtg agggattcgt caatttcgac
tacggctggt tcggcgccca gacggaagcg gacgccgaca agaccgtctg gacccacgga
aatcactatc acgcgcccaa tggcagcctg ggtgccatgc atgtctacga gagcaagttc
cgcaactggt ccgagggtta ctcggacttc gaccgcggag cctatgtgat caccttcatc
cccaagagct ggaacaccgc ccccgacaag gtaaagcagg gctggccgtg a
序列表SEQ ID No3
TAAAAACATATGGACTCCGACGACAGGGTCAC
序列表SEQ ID No4
TAAAAACTCAGGTTACGGCCAGCCCTGCTTTACC

Claims (1)

1.一种谷氨酰胺转胺酶的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)根据茂原链轮丝菌微生物谷氨酰胺转胺酶的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，所述PCR引物的正向引物为SEQ ID No3所示，所述PCR引物的反向引物为SEQ ID No4所示，获得表达谷氨酰胺转胺酶的基因片段，所述谷氨酰胺转胺酶的基因片段由序列表SEQ IDNo1所示，通过NdeI和XhoI双酶切，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET-MTG，并转化大肠杆菌成为工程菌；
(2)重组MTG包涵体的纯化和复性：诱导后的工程菌，经超声破菌后离心取沉淀，再经过洗涤获得MTG包涵体；将纯化的包涵体溶于20mol、pH＝8.0 Tris-HCl中，使包涵体蛋白浓度为18～22mg/ml，所述Tris-HCl中含8mol/L尿素，20mmol/L二硫苏糖醇和1mmol/L乙二铵四乙酸二钠，室温搅拌1～3小时，离心去除沉淀后，用HCl调pH至3～5，再次离心去除沉淀，用20mmol、pH4.0的乙酸缓冲液稀释50倍，4℃搅拌放置5～15h，用NaOH水溶液调pH至6.0～7.0，离心去除沉淀后，用10倍体积的20mmol、pH＝6.0磷酸缓冲液，透析二次，复性产物，上SP-琼脂糖凝胶柱，用pH＝6.0磷酸缓冲液洗去未结合的成分，再用0.5mol/LNaCl水溶液洗脱，洗脱液透析后进行超滤浓缩，冻干，即得到一种由序列表SEQ ID No2所示的氨基酸序列的谷氨酰胺转胺酶。
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