CN101253925A - 一种大米蛋白抗氧化活性肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种大米蛋白抗氧化活性肽的制备方法，属于大米蛋白精深加工技术领域。本发明以大米为原料，经粉碎、碱溶酸沉、离心分离、上清液等电点沉淀、沉淀洗涤、加水均质后再经精制中性蛋白酶水解、离心分离、上清液经冷冻干燥得到了分子量分布范围在392～1367Da，具有抗氧化活性的大米蛋白肽。该产品所用原料来源广泛，成本低廉，方法简便，无毒安全，所得产品能够清除自由基，抑制亚油酸过氧化活性，螯合金属离子，具有营养和保健两方面的优越性。本发明技术设计科学合理，对实现大米蛋白的综合利用和提高其附加值具有重要的意义。
Description
技术领域
一种大米蛋白抗氧化活性肽的制备方法，属于大米蛋白深加工技术领域，用于研制开发保健品和功能食品的基料。
背景技术
大米在中国乃至世界上都是最重要的植物之一，大米蛋白是发酵工业生产味精、乳酸、柠檬酸及其它生化药品后大量存在的副产物，干基蛋白质含量在50％以上，属于优质谷物蛋白，有良好的氨基酸组成配比，含人体必需的八种氨基酸，有极其重要的利用价值，是一种潜在的植物蛋白资源。从经济的角度来看，从大米及其加工副产品中开发出抗氧化食品，原料来源容易，成本低，消费者容易接受。以前往往将其随废液排走造成浪费和污染，现在多将其干燥后用作动物饲料，或者只进行了部分未确定的酶法改性，但工业附加值低。因此将大米蛋白酶解而得到生物活性肽不失为进一步开发利用大米蛋白的途径，是大米深加工产品的发展方向。国内外尚未有大米蛋白抗氧化肽的报道，本发明产品分子量分布范围在392～1367Da，能够清除自由基，抑制亚油酸过氧化活性，螯合金属离子，是一种具有抗氧化活性的大米蛋白肽，具有营养和保健两方面的优越性。
发明内容
本发明的目的是提供大米蛋白抗氧化活性肽的制备方法，所得产品能够清除自由基，抑制亚油酸过氧化，螯合金属离子，能有效地起到抗氧化作用，具有营养和保健两方面的优越性，方法简便，成本低廉，易得，无毒，安全。
本发明的技术方案：一种大米蛋白抗氧化活性肽的制备方法，通过粉碎大米，加水，碱性环境下溶解大米蛋白，离心分离收集上清液，调节上清液pH值等电点沉淀，洗涤沉淀至中性，加水均质，再添加精制中性蛋白酶进行水解反应，灭酶冷却，离心分离所得上清液，真空浓缩，冷冻干燥得到大米蛋白抗氧化活性肽；
(1)原料粉碎：大米粉碎至过40目筛网；
(2)碱性环境溶解大米蛋白：称取(1)所得原料大米粉，加水，大米粉与水质量比为1∶12，并调节提取液pH值至12.75～12.85，20℃、600～800r/min搅拌反应2h；
(3)离心分离：将(2)所得反应料液3000～4000r/min、离心分离15～20min收集上清液；
(4)上清液处理：调节(3)所得上清液pH值至5.45～5.55，沉淀45～90min；
(5)洗涤沉淀：采用去离子水反复洗涤沉淀至中性；
(6)沉淀加水均质：按沉淀与水的质量比为1∶20～1∶30，向(5)所得沉淀中加去离子水混匀并均质；
(7)蛋白酶解：调节(6)均质后的溶液pH值至6.90～7.10，温度35～40℃，按[E/S]＝1.33％～1.55％的比例添加精制中性蛋白酶，保持pH值、温度不变，水解2.5～3.5h，所用精制中性蛋白酶酶活为130,000U/g；
(8)灭酶冷却：(7)所述水解反应结束后升温至60℃灭酶10min，快速冷却反应液；
(9)离心分离：将(8)所述反应液离心分离，2500～3500r/min、离心8-12min，收集上清液；
(10)真空浓缩：将(9)所得上清液在真空度0.09MPa、温度为45～50℃进行真空浓缩，浓缩至固形物达60％以上；
(11)冷冻干燥：冷冻干燥(10)所得浓缩液至粉末状，冷冻干燥真空度为10～30Pa，冻干温度低于-30℃，干燥时间20～24h，水分含量在5％以下，干燥后的产品即为大米蛋白抗氧化活性肽。
本发明的有益效果：本发明所用原料来源广泛，成本低廉，方法简便，无毒安全，所得产品大米蛋白抗氧化活性肽能够清除自由基，抑制亚油酸过氧化活性，螯合金属离子，具有营养和保健两方面的优越性。本发明技术设计科学合理，对实现大米蛋白的综合利用和提高其附加值具有重要的意义。
附图说明
图1产品的DPPH清除能力。
图2产品在亚油酸体系中抗氧化能力。
图3产品的金属离子螯合能力。
图4大米蛋白抗氧化活性肽制备工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例1
称取经过粉碎、过40目筛的3kg大米粉，加入水36L搅拌混匀，调节pH值至12.80，20℃下搅拌(800r/min)2h后，离心分离(3500r/min，15min)，所得上清液pH值调至5.5，将所得悬浊液置于4℃下沉淀1h后，离心分离(3000r/min，10min)得沉淀，采用去离子水反复洗涤沉淀至中性，之后按1∶25的比例在沉淀中加水混匀并均质，pH值调至7.00，温度37℃后，按E/S＝1.33％的比例添加精制中性蛋白酶(酶活为130,000U/g)作用3h；结束后60℃、10min灭酶，酶解液冷却至室温后离心分离(3500r/min，10min)，真空浓缩(真空度0.09MPa，温度为48℃)，最后真空度为20Pa，-30℃对酶解液进行冷冻干燥20h，得到大米蛋白抗氧化活性肽。
DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基清除能力测定
将干燥的水解产物分别溶解在4mL蒸馏水中，制得浓度为0％，0.04％，0.08％，0.12％，0.16％，0.2％和0.24％(m/v)蛋白质溶液。在各样品溶液中添加1mL的40μM DPPH自由基的乙醇溶液。25℃下静置30min，于517nm测定吸收值。根据以下公式计算不同浓度样品中清除的自由基：
清除DPPH自由基能力(％)＝[1-(A样品/A空白)]×100
A空白指1mL的40μM DPPH自由基的乙醇溶液加入到浓度为0％的4mL蒸馏水中测得的吸收值；A样品指1mL的40μM DPPH自由基的乙醇溶液分别加入到其余浓度的4mL样品溶液中测得的吸收值。
产品在亚油酸体系中抗氧化能力测定-硫氰酸铁法
比较水解产物、α-生育酚、TBHQ(叔丁基对苯二酚)的抗氧化能力：
将10mg水解产物、10mgα-生育酚、10mg TBHQ分别溶解于10mL的50mM(pH 7.0)的磷酸盐缓冲液中，各加入0.15mL亚油酸和10mL99.5％乙醇。最后用蒸馏水定容至25mL，称之为亚油酸混合液。之后密闭放在暗处40℃恒温。空白对照以超纯水替代样品、α-生育酚、TBHQ。
过氧化值的测定采用硫氰酸铁法：取0.1mL亚油酸混合液，依次加入4.7mL75％的乙醇和0.1mL 30％的硫氰酸铵，再加入0.1mL 0.02M已经溶解于3.5％盐酸中的氯化亚铁，快速混匀，准确反应3min后，在500nm测定吸光度。0时刻测定值为A0，以后每隔24h测定一次，计为At。样品的抗氧化能力以144h时的氧化抑制率表示，抑制率按下式计算：
图2显示，酶解产物具有明显的抗氧化能力，其抗氧化能力接近于α-生育酚，比TBHQ的抗氧化能力稍差，但是TBHQ属于化学合成的抗氧化剂，TBHQ适用范围会受到限制。
金属离子螯合能力测定
酶解样品与EDTA(乙二胺四乙酸)金属离子螯合能力比较：
用超纯水配置浓度分别为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的酶解产物样品溶液，以及相应浓度的EDTA溶液，取1mL样品液，加入0.05mL 2mM FeCl2溶液和1.85mL超纯水，混合均匀，再加入0.1mL 5mMferrozine(SIGMA公司)溶液，剧烈震荡均匀，室温下静置10min，测定562nm的吸光值A样品，取1mL超纯水代替样品测定A对照，所有测定值均为三次平均值。
螯合率按下式计算：螯合率(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100
图3显示，酶解产物具有明显的金属离子螯合能力，其金属离子螯合能力比EDTA稍差一些。
Claims (1)
1、一种大米蛋白抗氧化活性肽的制备方法，其特征是粉碎大米，加水，碱性环境下溶解大米蛋白，离心分离收集上清液，调节上清液pH值等电点沉淀，洗涤沉淀至中性，加水均质，再添加精制中性蛋白酶进行水解反应，灭酶冷却，离心分离所得上清液，真空浓缩，冷冻干燥得到大米蛋白抗氧化活性肽；
(1)原料粉碎：大米粉碎至过40目筛网；
(2)碱性环境溶解大米蛋白：称取(1)所得原料大米粉，加水，大米粉与水质量比为1∶12，并调节提取液pH值至12.75～12.85，20℃、600～800r/min搅拌反应2h；
(3)离心分离：将(2)所得反应料液3000～4000r/min、离心分离15～20min收集上清液；
(4)上清液处理：调节(3)所得上清液pH值至5.45～5.55，沉淀45～90min；
(5)洗涤沉淀：采用去离子水反复洗涤沉淀至中性；
(6)沉淀加水均质：按沉淀与水的质量比为1∶20～1∶30，向(5)所得沉淀中加去离子水混匀并均质；
(7)蛋白酶解：调节(6)均质后的溶液pH值至6.90～7.10，温度35～40℃，按[E/S]＝1.33％～1.55％的比例添加精制中性蛋白酶，保持pH值、温度不变，水解2.5～3.5h，所用精制中性蛋白酶酶活为130,000U/g；
(8)灭酶冷却：(7)所述水解反应结束后升温至60℃灭酶10min，快速冷却反应液；
(9)离心分离：将(8)所述反应液离心分离，2500～3500r/min、离心8-12min，收集上清液；
(10)真空浓缩：将(9)所得上清液在真空度0.09MPa、温度为45～50℃进行真空浓缩，浓缩至固形物达60％以上；
(11)冷冻干燥：冷冻干燥(10)所得浓缩液至粉末状，冷冻干燥真空度为10～30Pa，冻干温度低于-30℃，干燥时间20～24h，水分含量在5％以下，干燥后的产品即为大米蛋白抗氧化活性肽。
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