CN100453641C - 利用罗非鱼内脏提取sod酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法,包括以下步骤:罗非鱼内脏和生理盐水以1∶5(w/v)比例混匀,在50-65℃水浴加热保温5-12min,用组织捣碎机匀浆破碎,离心,取上清液,用可截留分子量为50kD的膜超滤系统进行超滤,取超滤液,用硫酸铵或磷酸钠对超滤提取液进行分离纯化,静置2-4h后,离心,收集沉淀物;将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5-10kD的膜超滤系统进行超滤,脱盐、去除小分子物质,收集浓缩液;然后进行冷冻干燥,即得到高活性的SOD粗酶制品。该工艺简单,生产周期短,适合于工业化生产,有效解决罗非鱼加工废弃物的出路,使资源得到高效利用。

Description

利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法
技术领域
本发明涉及淡水鱼深加工利用的方法,特别是罗非鱼加工下脚料——内脏的综合利用加工方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内一类重要的自由基清除剂,能使自由基的形成和清除处于动态平衡,从而可抵御O2 -·的毒害作用,是一类生物重要保护酶类,具有增强机体抗逆能力和预防衰老等作用。近年来,国内外不断报道SOD可作为药用酶治疗人体的多种疾病,如炎症、肺水肿、自身免疫性疾病、氧中毒、抗肿瘤等,因此,SOD的研究和应用已受到广泛的重视。目前,国内外利用陆生动植物和微生物开发SOD酶的研究较多,特别是利用动物血液(猪、牛、羊、马)的血液中提取SOD酶,但由于疯牛病的影响,欧盟规定不准用牛血中提取的SOD酶作为食品和药物的添加剂;利用富含SOD的植物和微生物提取SOD酶的工艺往往采用多步盐析、有机溶剂法和层析法。从水产品如鱼虾等中开发SOD酶的研究尚少,特别是利用罗非鱼类加工废弃物(内脏)提取SOD的研究未见报道。
由于陆生动物血液中提取SOD酶在欧盟等发达国家的应用受阻,而SOD酶对人体健康具有重要的作用,所以从易得廉价的新资源中获取SOD酶并工业化是当前急需解决的问题。随着罗非鱼加工业的不断发展,加工下脚料中内脏占大部分,罗非鱼内脏中含有丰富的SOD酶,但至今还没有对其进行提取方法的研究。罗非鱼被称为二十一世纪“世界之鱼”,随着全球对这种鱼的需求量不断增加,罗非鱼的养殖加工量不断增长,而罗非鱼加工下脚料——内脏占整条鱼的一半,这部分废弃物被低廉处理为饲料,大部分被废弃。
发明内容
本发明的目的在于提供以罗非鱼内脏为原料,提取SOD酶的方法,从而使罗非鱼内脏得到高值化利用,为人类提供更好的生物酶制剂。
为实现上述目的,本发明是通过以下实施方案来实现的:
a.匀浆:罗非鱼内脏和生理盐水以1∶5(w/v)比例混匀,在50-65℃水浴加热保温5-12min,用组织捣碎机匀浆破碎,离心去除杂蛋白沉淀,取上清液。
b.超滤:取离心上清液,用可截留分子量为50kD的膜超滤系统进行超滤,取超滤液。
c.分离纯化:将超滤后所得的溶液调PH至6~9,采用硫酸铵或磷酸钠对超滤提取液进行分离纯化,静置2-4h后,用10000r/min的冷冻离心机进行离心15-20min,收集沉淀物。
d.二次超滤:将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5-10kD的膜超滤系统进行超滤,进行脱盐、去除小分子物质,收集浓缩液。到纯化SOD酶。
e.冷冻干燥:将浓缩液进行冷冻干燥,即得到高活性的SOD粗酶制品。
本发明利用SOD酶耐热的特点,在匀浆前先在50-65℃下保温后,再进行匀浆,这样将SOD酶的提取与不耐热杂蛋白质的去除有机结合起来,再通过膜超滤,去除大于50kD的大分子蛋白质。采用中性盐硫酸铵或磷酸钠进行分离纯化,然后用二次膜超滤去除小分子杂质、离子等,得到SOD酶。
本发明公开的方法改变了以往动物血液制备SOD酶时需要反复用化学试剂进行丙酮沉淀、透析和层析、缓冲溶液梯度洗脱的麻烦。根据罗非鱼内脏的特点,主要采用高温破碎细胞提取和二次超滤技术,提取的SOD酶活性高。经测定,本发明制备的SOD酶分子量为36kD。
该工艺简单,生产周期短,适合于工业化生产,可向医药、食品、日用化妆品等行业提供价格低廉、安全可靠的SOD酶产品。
本发明首次从水产品——罗非鱼中提取SOD酶,而且是从罗非鱼加工下脚料——内脏中提取生物酶制剂。有利于解决罗非鱼加工废弃物的出路,使资源得到高效利用,从而大大提高企业的经济效益,也为食品与医学领域提供SOD酶添加剂。
具体实施例
实例一
配制5000ml生理盐水,并加入6.5gCuCl2,搅匀作为抽提缓冲液,取冻罗非鱼加工下脚料——内脏1000g,解冻后加入上述缓冲液,搅均匀,在60℃的水浴下保温10min,于组织捣碎机中进行组织匀浆,匀浆后,用10000r/min的离心机进行离心15min,将上清液通过可以截留分子量为50kD的膜超滤系统,超滤后获得分子量为50kD以下的物质清液,用2mol/L NH4OH调pH至6.7,加入固体硫酸铵至35%饱和度,静置2h。离心,取上清液,再加入固体硫酸铵至70%饱和度,静置2-4h后,用10000r/min的冷冻离心机进行离心20min,收集沉淀物。将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5kD的膜超滤系统进行超滤,进行脱盐、去除小分子物质,收集浓缩液。将浓缩液置于-40℃的冷冻室进行急冻,冻透后用冷冻干燥机进行冷冻干燥,得到SOD粗酶制品。
实例二
配制5000ml生理盐水,并加入6gCuCl2,搅匀作为抽提缓冲液,取冻罗非鱼加工下脚料——内脏1000g,解冻后加入上述缓冲液,搅均匀,在50℃的水浴下保温12min,于组织捣碎机中进行组织匀浆,匀浆后,用10000r/min的离心机进行离心15min,将上清液通过可以截留分子量为50kD的膜超滤系统,超滤后获得分子量为50kD以下的物质清液,调pH至7.2,逐渐加入饱和磷酸钠溶液,静置4h后,用10000r/min的冷冻离心机进行离心20min,收集沉淀物。将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5kD的膜超滤系统进行超滤,进行脱盐、去除小分子物质,收集浓缩液。将浓缩液置于-40℃的冷冻室进行急冻,冻透后用冷冻干燥机进行冷冻干燥,得到SOD粗酶制品。

Claims (2)

1.一种利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法,其步骤包括:
a.匀浆:罗非鱼内脏和加有1.2g/L氯化铜的生理盐水以重量体积比为1∶5的比例混匀,在50-65℃水浴加热保温5-12min,用组织捣碎机匀浆破碎,离心去除杂蛋白沉淀,取上清液;
b.超滤:取离心上清液,用可截留分子量为50kD的膜超滤系统进行超滤,取超滤液;
c.分离纯化:将超滤后所得的溶液调PH至6~9,采用硫酸铵或磷酸钠对超滤提取液进行分离纯化,静置2-4h后,用10000r/min的冷冻离心机进行离心15-20min,收集沉淀物;
d.二次超滤:将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5-10kD的膜超滤系统进行超滤,进行脱盐、去除小分子物质,收集浓缩液;
e.冷冻干燥:将浓缩液进行冷冻干燥,即得到高活性的SOD粗酶制品。
2.根据权利要求1中所述的利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法,其特征在于:
所述的步骤a中水浴温度为65℃,保温时间为10min。
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黄鳝内脏铁型超氧化物歧化酶的纯化. 沈洪国等.水产科学,第24卷第2期. 2005
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