CN1821394A - 利用罗非鱼内脏提取sod酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法，包括以下步骤：罗非鱼内脏和生理盐水以1∶5(w/v)比例混匀，在50－65℃水浴加热保温5－12min，用组织捣碎机匀浆破碎，离心，取上清液，用可截留分子量为50kD的膜超滤系统进行超滤，取超滤液，用硫酸铵或磷酸钠对超滤提取液进行分离纯化，静置2－4h后，离心，收集沉淀物；将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5－10kD的膜超滤系统进行超滤，脱盐、去除小分子物质，收集浓缩液；然后进行冷冻干燥，即得到高活性的SOD粗酶制品。该工艺简单，生产周期短，适合于工业化生产，有效解决罗非鱼加工废弃物的出路，使资源得到高效利用。

Description

利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法
技术领域
本发明涉及淡水鱼深加工利用的方法，特别是罗非鱼加工下脚料——内脏的综合利用加工方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内一类重要的自由基清除剂，能使自由基的形成和清除处于动态平衡，从而可抵御O2 -·的毒害作用，是一类生物重要保护酶类，具有增强机体抗逆能力和预防衰老等作用。近年来，国内外不断报道SOD可作为药用酶治疗人体的多种疾病，如炎症、肺水肿、自身免疫性疾病、氧中毒、抗肿瘤等，因此，SOD的研究和应用已受到广泛的重视。目前，国内外利用陆生动植物和微生物开发SOD酶的研究较多，特别是利用动物血液(猪、牛、羊、马)的血液中提取SOD酶，但由于疯牛病的影响，欧盟规定不准用牛血中提取的SOD酶作为食品和药物的添加剂；利用富含SOD的植物和微生物提取SOD酶的工艺往往采用多步盐析、有机溶剂法和层析法。从水产品如鱼虾等中开发SOD酶的研究尚少，特别是利用罗非鱼类加工废弃物(内脏)提取SOD的研究未见报道。
由于陆生动物血液中提取SOD酶在欧盟等发达国家的应用受阻，而SOD酶对人体健康具有重要的作用，所以从易得廉价的新资源中获取SOD酶并工业化是当前急需解决的问题。随着罗非鱼加工业的不断发展，加工下脚料中内脏占大部分，罗非鱼内脏中含有丰富的SOD酶，但至今还没有对其进行提取方法的研究。罗非鱼被称为二十一世纪“世界之鱼”，随着全球对这种鱼的需求量不断增加，罗非鱼的养殖加工量不断增长，而罗非鱼加工下脚料——内脏占整条鱼的一半，这部分废弃物被低廉处理为饲料，大部分被废弃。
发明内容
本发明的目的在于提供以罗非鱼内脏为原料，提取SOD酶的方法，从而使罗非鱼内脏得到高值化利用，为人类提供更好的生物酶制剂。
为实现上述目的，本发明是通过以下实施方案来实现的：
a.匀浆：罗非鱼内脏和生理盐水以1∶5(w/v)比例混匀，在50-65℃水浴加热保温5-12min，用组织捣碎机匀浆破碎，离心去除杂蛋白沉淀，取上清液。
b.超滤：取离心上清液，用可截留分子量为50kD的膜超滤系统进行超滤，取超滤液。
c.分离纯化：将超滤后所得的溶液调PH至6～9，采用硫酸铵或磷酸钠对超滤提取液进行分离纯化，静置2-4h后，用10000r/min的冷冻离心机进行离心15-20min，收集沉淀物。
d.二次超滤：将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5-10kD的膜超滤系统进行超滤，进行脱盐、去除小分子物质，收集浓缩液。到纯化SOD酶。
e.冷冻干燥：将浓缩液进行冷冻干燥，即得到高活性的SOD粗酶制品。
本发明利用SOD酶耐热的特点，在匀浆前先在50-65℃下保温后，再进行匀浆，这样将SOD酶的提取与不耐热杂蛋白质的去除有机结合起来，再通过膜超滤，去除大于50kD的大分子蛋白质。采用中性盐硫酸铵或磷酸钠进行分离纯化，然后用二次膜超滤去除小分子杂质、离子等，得到SOD酶。
本发明公开的方法改变了以往动物血液制备SOD酶时需要反复用化学试剂进行丙酮沉淀、透析和层析、缓冲溶液梯度洗脱的麻烦。根据罗非鱼内脏的特点，主要采用高温破碎细胞提取和二次超滤技术，提取的SOD酶活性高。经测定，本发明制备的SOD酶分子量为36kD。
该工艺简单，生产周期短，适合于工业化生产，可向医药、食品、日用化妆品等行业提供价格低廉、安全可靠的SOD酶产品。
本发明首次从水产品——罗非鱼中提取SOD酶，而且是从罗非鱼加工下脚料——内脏中提取生物酶制剂。有利于解决罗非鱼加工废弃物的出路，使资源得到高效利用，从而大大提高企业的经济效益，也为食品与医学领域提供SOD酶添加剂。
具体实施例
实例一
配制5000ml生理盐水，并加入6.5gCuCl2，搅匀作为抽提缓冲液，取冻罗非鱼加工下脚料——内脏1000g，解冻后加入上述缓冲液，搅均匀，在60℃的水浴下保温10min，于组织捣碎机中进行组织匀浆，匀浆后，用10000r/min的离心机进行离心15min，将上清液通过可以截留分子量为50kD的膜超滤系统，超滤后获得分子量为50kD以下的物质清液，用2mol/L NH4OH调pH至6.7，加入固体硫酸铵至35％饱和度，静置2h。离心，取上清液，再加入固体硫酸铵至70％饱和度，静置2-4h后，用10000r/min的冷冻离心机进行离心20min，收集沉淀物。将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5kD的膜超滤系统进行超滤，进行脱盐、去除小分子物质，收集浓缩液。将浓缩液置于-40℃的冷冻室进行急冻，冻透后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到SOD粗酶制品。
实例二
配制5000ml生理盐水，并加入6gCuCl2，搅匀作为抽提缓冲液，取冻罗非鱼加工下脚料——内脏1000g，解冻后加入上述缓冲液，搅均匀，在50℃的水浴下保温12min，于组织捣碎机中进行组织匀浆，匀浆后，用10000r/min的离心机进行离心15min，将上清液通过可以截留分子量为50kD的膜超滤系统，超滤后获得分子量为50kD以下的物质清液，调pH至7.2，逐渐加入饱和磷酸钠溶液，静置4h后，用10000r/min的冷冻离心机进行离心20min，收集沉淀物。将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5kD的膜超滤系统进行超滤，进行脱盐、去除小分子物质，收集浓缩液。将浓缩液置于-40℃的冷冻室进行急冻，冻透后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到SOD粗酶制品。

Claims (2)

1.一种利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法，其步骤包括：
a.匀浆：罗非鱼内脏和生理盐水以1∶5(w/v)比例混匀，在50-65℃水浴加热保温5-12min，用组织捣碎机匀浆破碎，离心去除杂蛋白沉淀，取上清液；
b.超滤：取离心上清液，用可截留分子量为50kD的膜超滤系统进行超滤，取超滤液；
c.分离纯化：将超滤后所得的溶液调PH至6～9，采用硫酸铵或磷酸钠对超滤提取液进行分离纯化，静置2-4h后，用10000r/min的冷冻离心机进行离心15-20min，收集沉淀物；
d.二次超滤：将沉淀物用蒸馏水溶解，用可截留分子量为5-10kD的膜超滤系统进行超滤，进行脱盐、去除小分子物质，收集浓缩液；
e.冷冻干燥：将浓缩液进行冷冻干燥，即得到高活性的SOD粗酶制品。
2.根据权利要求1中所述的利用罗非鱼内脏提取SOD酶的方法，其特征在于：
所述的步骤a中水浴温度为65℃，保温时间为10min。
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