CN110257439B

CN110257439B - 一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法

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Publication number: CN110257439B
Application number: CN201910571503.7A
Authority: CN
Inventors: 肖安风; 焦超; 杨秋明; 曾洁; 张永辉; 翁惠芬; 肖琼
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2039-06-28
Also published as: CN110257439A

Abstract

本发明公开了一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法。包括将含水率＜10％的海藻原料，粉碎过筛；加水后；进行高温高压蒸煮，过滤收集滤液；调pH至6.5‑8.5，加入硫酸酯酶反应得滤渣；再加水调pH至6.5‑8.5，同时加入多功能海藻多糖降解酶和果胶酶反应，离心收集上清液，并进行高温灭菌得到高温灭菌后的糖化液；再接入活化后的酵母厌氧发酵；发酵完的发酵液用纱布过滤，其上清液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇，浓缩，即可得体积分数90％以上的乙醇。本发明的方法得到的乙醇的收率高，同时更加简单、方便；原料资源丰富，适合大规模生产。

Description

一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法

技术领域

本发明涉及生物乙醇制备技术领域，具体涉及一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法。

背景技术

乙醇(英语：Ethanol，结构简式：CH₃CH₂OH)是醇类的一种，是酒的主要成份，所以又称酒精，具有易燃、而且燃烧后几乎没有污染物质排放的优势，被认为是最有发展前景的新型可持续染料。生物乙醇生物乙醇是指通过微生物的发酵将各种生物质转化为燃料酒精。它可以单独或与汽油混配制成乙醇汽油作为汽车燃料，是一种新型的生物质能源，鉴于其可再生性和环境友好性等特点，受到了各个国家的广泛关注，并被认为是可通过相应技术手段转变为高品质的现代能源之一。目前，工业化生产的燃料乙醇绝大多数是以粮食作物为原料的，从长远来看具有规模限制和不可持续性。

生物质海洋植物是海洋世界的能源库，而海洋藻类是海洋植物的主体，是一种分布极为广泛的海洋生物，可将水、光和二氧化碳转变成为藻类富含生产生物能源的基本原料—碳水化合物。海洋藻类资源含量丰富，包括红藻、绿藻、褐藻和蓝藻四类。当前的研究主要集中于海洋藻类(如红藻、褐藻等)的化学成分分析、海藻多糖的提取及海藻多糖生物活性方面的应用，而储量丰厚、种类繁多的海洋藻类多糖在能源方面的探索研究较少。而且目前有关于利用海藻原料发酵制备生物乙醇的方法，操作复杂，条件要求较高，对环境的污染较大，而且制得的乙醇浓度低，杂质较多。此外多种方法都采用很多酶的组合，往往需要四五种酶组合使用，提高了生产的成本，而且不同的酶需要的反应条件也不同，使操作更复杂。因此提供更有效的酶处理方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤，

原料预处理：将除去杂质的海藻原料在阳光下暴晒2-4d，再使用烘箱烘干残余水分，粉碎过筛；

高压蒸煮：将上述所得按质量比为1：(30-40)加水后；优选的，质量比为1:35；进行高温高压蒸煮，优选的，高压灭菌锅中110-120℃下蒸煮20-40min；更优选的，高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min；然后3-5层绢布过滤，收集滤液；蒸煮后的原料的多糖化学键会得到活化或者部分水解，使得接下来的酶处理更加的高效。实验验证，蒸煮过后可大幅度缩短后续的酶解时间。

硫酸酯酶酶解：调上述滤液的pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h得到滤渣；优选的硫酸酯酶的加入量为5-15U/ml:更优选的，所述硫酸酯酶加入量为10U/ml；由于海藻中广泛存在的高分子量的硫酸杂多糖，利用硫酸酯酶将硫酸基团除去，易于得到所需分子量范围的低聚糖，而且硫酸根的大量存在也会影响后续步骤中加入的酶的反应，特别是降解海藻多糖的酶本身活性中心对一些金属离子具有一定的依赖性，如Ca²⁺、Ba²⁺等，硫酸根的存在会影响这类酶的酶活，将硫酸基团去除可以使得产量更高。

多功能海藻多糖酶酶解：将上述得到的滤渣按1：(20-40)质量比加水；优选的，按1:30质量比加水，调其pH至6.5-8.5，同时加入多功能海藻多糖降解酶和果胶酶，反应6h-12h，即可得到发酵性还原糖糖化液；优选的，所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为3-8U/ml；所述果胶酶的加入量为0.1-0.3％；更优选的，所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml；所述果胶酶的加入量为0.1％；所述多功能海藻多糖降解酶为重组酶AlgL1281，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH为8.0，所述果胶酶的酶活力为4000U/ml。加入果胶酶主要目的是降解其他的一些海藻多糖降解酶无法分解的糖成分从分子内部无规则地截断α-1,4糖苷键，配合多功能海藻多糖降解酶得到可发酵性还原糖。

离心收集：将发酵性还原糖糖化液进行离心后，优选的，4000-6000r/min离心15-20min；收集上清液，并进行高温灭菌得到高温灭菌后的糖化液；优选的，115℃下高温灭菌0.5h-2h；

酵母发酵：将活化后的酵母按照7％-20％的体积比接入上述高温灭菌后的糖化液里，在28-45℃下厌氧发酵2-4天；活化后的酵母可以更快的适应改性琼脂的糖化液，使生物乙醇的制备效率得到提高。

乙醇的分离制备：将发酵完的发酵液经5-10层纱布过滤，优选八层纱布过滤；过滤后的上清液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇，将蒸馏出的乙醇再进行浓缩，即可得体积分数90％以上的乙醇。

进一步，所述海藻原料为红藻和褐藻。

进一步，所述海藻原料为石花菜，龙须菜，海带，鹿角菜或马尾藻中的至少一种。

经过实验验证：接种量在10％时，37℃下发酵50小时所得到的乙醇浓度最高。

本发明的原材料来源广泛，可以是提取琼脂的石花菜、龙须菜，可以是提取褐藻胶的海带、马尾藻，可以是提取卡拉胶的鹿角菜。

与现有的技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

(1)脱硫率高，可以达到约90％。

称取1g的琼脂粗多糖溶解于100ml的50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.5)的缓冲液中，加入重组硫酸酯酶50℃处理6h，加酶量达到120U后将琼脂粗多糖中的硫酸根基团几乎全部去除，脱硫率可以达到约90％，如表1所示：

表1硫酸酯酶Sulf1694去除琼脂粗多糖硫酸基团的研究表

由于海藻中广泛存在的高分子量的硫酸杂多糖，利用硫酸酯酶将硫酸基团除去，有利于后续加入海藻多糖降解酶得到所需分子量范围的低聚糖，而且硫酸根的大量存在也会影响后续步骤中加入的酶的反应，特别是降解海藻多糖的酶本身活性中心对一些金属离子具有一定的依赖性，如Ca²⁺、Ba²⁺等，硫酸根的存在会影响这类酶的酶活，将硫酸基团去除可以使得产量更高。

(2)经过前期脱硫处理的海藻多糖，使用简单的酶处理流程，即可得到发酵所需要的糖化液，相比其他的现有技术操作更加简单、方便。

(3)本发明的海藻多糖降解酶具有多功能降解特性，也可采用其他的特异性降解酶，而且原料资源丰富，技术工艺简单，适合大规模生产。

附图说明

图1是重组酶Sulf1694的蛋白质三维结构模型；

图2为重组酶Sulf1694重组表达纯化的SDS-PAGE图谱；

图3是重组酶AlgL1281的蛋白质三维结构模型；

图4为重组酶AlgL1281重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实验所用生物材料来源：Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5，中文名称为食鹿角菜假交替单胞菌，分离自厦门红树林土壤腐叶样品，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号23819。

硫酸酯酶为重组酶Sulf1694，其的最适反应温度为60℃，最适反应pH为7.5。其制备方法如下:

将Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种至人工海水培养基中，在25℃，180r/min的条件下，震荡培养至OD₆₀₀为1-1.5，取培养菌液1mL，利用东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)提取Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株基因组DNA。

上述人工海水培养基配置方法如下：

牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、蒸馏水250mL、人工海水750mL(NaCl 37.51g、KCl1.03g、CaCl₂ 1.61g、MgCl₂·6H₂O 6.4g、NaHCO₃ 0.15g、MgSO₄·7H₂O 4.67g、蒸馏水1000mL)。牛肉浸膏和胰蛋白胨溶解后调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后调pH至7.3，然后和人工海水混合，121℃灭菌20min。固体培养基再添加20g琼脂。

以得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如下：

正向引物：Sulf1694-F(SEQ ID NO：3)：

5’-CGCGGATCCAACTTTTACGCCGACTACGCAGCCA-3’；下划线标注的是限制性内切酶位点BamHI，

反向引物：Sulf1694-R(SEQ ID NO：4)：

5’-CCGCTCGAGTAGTTTTATTTCGCTTGGTGTTGTT-3’，下划线标注的是限制性内切酶XhoI位点。

所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应系统为：

基因组DNA(0.645mg/mL)：0.5μL；

dNTP：4μL；

Sulf1694-F(10μmol/L)：1μL；

(Sulf1694-R(10μmol/L)：1μL；

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS：0.5μL；

5xBuffer:10μL；

ddH2O：补齐50μL。

PCR条件为：95℃，5min；94℃，15s；56℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。

将PCR产物进行测序，序列如SEQ ID NO:1所示。共含有373个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。用ExPASy的protparam工具进行分析，显示蛋白质Sulf1694的理论分子量约为42kDa。信号肽分析结果显示，其N端有1-20个氨基酸为信号肽序列。硫酸酯酶Sulf1694的蛋白质三维结构模型，如图1所示。利用SWISS-MODEL对Sulf1694进行建模，模板为来自PDB数据库编号为5fgn.1.A的硫酸酯酶，相似度为42.55％。

SEQ ID NO：1如下所示：

GTGAACTTTTACGCCGACTACGCAGCCACTGGCCGTAATAATCGCATTTTGAAAAAAGAAATCATTCCATTTCAGTACCTCTCTAGCGGTTATAAATACATGCGCGATCAACTGCTATACACCAATATAAAGTTTAAAAATATAGATACAATACCCACTTTAATTGCGCCTACTACTACCAGCGTAACAGTTATAGTTGTTGGCGAAACCGCACGAGCAGACAATTTTGCTTACCAGGGTTATAAACGTAACACCAATCCTTATACACAAAAGCATAATGTAACGTATTTTAATAATGTGGCGTCTTGTGGCACAGCTACGGCTGTGTCTGTGCCGTGTATGTTTTCATTGCAAACACACGATAACTTTGATCGATTAGCAGCCGACAACCAACAAAACCTGATTGACCTAGCACAACAAGCTGGCAGTGATGTACTGTGGGTTGATAACAACAGCGGCTGTAAAAACGTATGCACCCGTGTTGTTAACATAAATATCCCAACCGCTGCATCAGCGCTTTGCGATGGGAAATATTGTTTTGATGAAGCACTTATTGCTCCACTTAAACGCAAACTCGCCAATTTAAGCCAAGCTAATACCGTTATCGTCCTACATATGATGGGCTCGCACGGACCAACCTACTTTAAACGCTACCCAGAAAAGTTTAAGCAATTTACGCCTACGTGCGACAGAAGCGACATTCAGAACTGCTCACTCGATGAATTAGTTAATACCTACGACAATACAATTGCGTACAGCGACTTTGTTAACGCCCAAGTAATTGATCAATTAAAAGCACTGCCGAACAACATAGATAAGCAGTTTTTATATGTCTCTGATCATGGTGAATCACTTGGCGAAGCCGGTGCTTACTTGCATGGCTTTCCGTATAGCTTTGCGCCTAGCACGCAAACACATGTTCCTCTTTATATGTGGGCCGATGAGCATAACCAACGCATTACCAATACCTGTTTAGCTAATTTAGACACACGAGCTGCACGCTCACACAACAACATTTTTCACACCCTTTTAAATTTAATTGGCATTAAAAGCAAAACGTATCAGGCATCCCTTGATTTACTTGCTCGCTGCCAAACAACACCAAGCGAAATAAAACTATGA。

SEQ ID NO：2如下所示：

MNFYADYAATGRNNRILKKEIIPFQYLSSGYKYMRDQLLYTNIKFKNIDTIPTLIAPTTTSVTVIVVGETARADNFAYQGYKRNTNPYTQKHNVTYFNNVASCGTATAVSVPCMFSLQTHDNFDRLAADNQQNLIDLAQQAGSDVLWVDNNSGCKNVCTRVVNINIPTAASALCDGKYCFDEALIAPLKRKLANLSQANTVIVLHMMGSHGPTYFKRYPEKFKQFTPTCDRSDIQNCSLDELVNTYDNTIAYSDFVNAQVIDQLKALPNNIDKQFLYVSDHGESLGEAGAYLHGFPYSFAPSTQTHVPLYMWADEHNQRITNTCLANLDTRAARSHNNIFHTLLNLIGIKSKTYQASLDLLARCQTTPSEIKL。

将上述所得的PCR产物及pET-28a质粒用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切，回收酶切后的产物片段。限制性内切酶XhoI和BamHI购自中国大连宝生物公司，酶切用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过XhoI和BamHI双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-28a(+)质粒载体，在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min，培养12h，用正向引物Sulf1694-F和反向引物Sulf1694-R进行菌液PCR验证。

接着将PCR验证正确的重组质粒pET-28a(+)-Sulf1694转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min,培养12h，用正向引物Sulf1694-F和反向引物Sulf1694-R进行菌液PCR验证，结果得到大小约为1100bp的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确。将重组质粒送至厦门铂瑞生物科技有限公司进行测序，结果表明，在pET-28a(+)的XhoI和BamHI酶切位点插入SEQ ID NO.1所示的基因Sulf1694，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET-28a(+)-Sulf1694。使用异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)进行重组硫酸酯酶的诱导表达。加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05mmol/L，16℃诱导20h后将菌液收集至200mL的离心管中，6000rpm离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的溶解缓冲液(溶解缓冲液配方为：0.3mol/LNaCl，15mmol/L咪唑，50mmol/LNaH₂PO₄，pH8.0)中，超声波破碎处理至菌液成半透明(参数设置为300w，超声时间5s，间歇时间5s，总工作时间15min)，11000rpm离心20min，上清与预先用溶解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀，4℃结合1小时，纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化后的蛋白经的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为42kDa，使用Bradford法测定蛋白浓度，得到浓度约为1.5mg/ml的重组硫酸酯酶Sulf1694也即重组酶Sulf1694(结果参见图2)。泳道M为蛋白Marker，泳道1为空载体pET-28a在E.coliBL21中的表达，泳道2为重组载体pET-28a(+)-Sulf1694在E.coliBL21中的未诱导表达，泳道3为重组载体pET-28a(+)-Sulf1694在E.coli BL21中的诱导表达，泳道4、5为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白Sulf1694(42kDa)。可以看出来，目的蛋白Sulf1694得到了诱导表达，同时得到了纯化，有效去除了杂质。

所用多功能海藻多糖降解酶为重组酶AlgL1281，其的最适反应温度为50℃，最适反应pH为8.0，其制备方法如下:

人工海水培养基：牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、蒸馏水250mL、人工海水750mL(NaCl37.51g、KCl 1.03g、CaCl₂ 1.61g、MgCl₂·6H₂O 6.4g、NaHCO₃ 0.15g、MgSO₄·7H₂O4.67g、蒸馏水1000mL)。牛肉浸膏和胰蛋白胨在蒸馏水中溶解后用NaOH调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后再次加NaOH调pH至7.3，然后和人工海水混合，121℃灭菌20min。固体培养基再添加20g琼脂。

以得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如下：

正向引物AlgL1281-F(SEQ ID NO：7)：

5’-CGCGGATCCAATACTAAACTTGAAAATAA-3’；下划线标注的是限制性内切酶位点BamHI；

反向引物AlgL1281-R(SEQ ID NO：8)：

5’-CCGGAATTCCGGCTTAGTTGATGGGCTTA-3’；下划线标注的是限制性内切酶EcoR I位点。

PCR反应系统为：

基因组DNA(0.679mg/ml)：0.5μL；

dNTP：4μL；

AlgL1281-F(10μmol/L)：1μL；

AlgL1281-R(10μmol/L)：1μL；

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS：0.5μL；

5xBuffer:10μL；

ddH₂O：补齐50μL。

PCR条件为：95℃，5min；94℃，15s；52℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。

将PCR产物进行测序，序列如SEQ ID NO:1所示。共含有362个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。用ExPASy的protparam工具进行分析，显示蛋白质AlgL1281的理论分子量约为40kDa，理论等电点为9.06。信号肽分析结果显示，其N端有1-27个氨基酸为信号肽序列。海藻多糖裂解酶AlgL1281的蛋白质三维结构模型，如图3所示，利用SWISS-MODEL对AlgL1281进行建模，模板为来自PDB数据库编号为4be3.1.A的PL7褐藻胶裂解酶，相似度为42.55％。

SEQ ID NO:5如下所示：

ATGAAAAATCTAACATCTACTTTTAAACTCACAGCACTGGCTGCTGTTACTCCTTTATTATTTATGGGCTGCGCTAGTACAAATACTAAACTTGAAAATAATGCAGCAGTCCCTGCATCAAAATTTGATTTATCAAACTGGAAAATTAACGTACCTGTCGATTTAAACAACGACGGAAAAATTGATACAGTAGACGTTAAAGAAATTCAAACTTACGCGCACCCTGATTTTTTCTACTTGGATGATCAGGGTTATATGGTATTTGCCTCGCCAAATAAAGCACTTACCAGCGCAAACTCAACCAATACCCGTAGTGAATTACGACAAATGATCCGCGGAACAAACACTAAAATAAAAACTAAAAATTCAAAAAACAATTTTGCACTTGCTGTGCACCCGCTATCGGAGCGTTTTGGCTCAGTAGGCGGAAAAATGGAAGCCACGCTCAAAGTTGATCATGTAGCCCTGCGTGCAAACGATCCGAGTAAAAAAGCCGCTTATTCTGTGGTGGTAGGGCAAATTCACGCAGGTAAAGATCAGGCACTTATAGACACTAAGCTGGGTTTTGGCTGGGGTAACGAACCACTTAAAATTTATTACAAAAAATGGCCAGGGCATAAAACCGGATCGGTATTTTGGAACTACGAGCGTAACTTACCAAAAAAAGATCCTAACCGAACCGACATTACTTACCCTGTATGGGGCAACACCTGGGAAAACCCAGATGACCCAGCGGCTAACGGTATTGCACTAGGTGACGAGTTTAGCTACACCGTGAACGTACATAAAAATGTTATGCACCTTACATTTAGTGCTCAAGGCAAAAAAGACGTTAACTACTCTATTAACTTAGGTAATAACGTAGATGCTTATGGCAAAGTAGATGATAAAGATCATCCTAATGGCTACGCTGCCGATTGGCATTACTTTAAAGCGGGTGCGTATAACCAATGTAGTACCAAAAGCGCTAAAGGAATTTGGTACCCAGGTTGTTTAGGTACGGGTGATTGGGCTACAGACAAGCAAAATGGCGATTACGCGCAAGTAAGCTTTAAAAAATTAGTATTAAGCCCATCAACTAAGCCGTAA。

SEQ ID NO:6如下所示：

MKNLTSTFKLTALAAVTPLLFMGCASTNTKLENNAAVPASKFDLSNWKINVPVDLNNDGKIDTVDVKEIQTYAHPDFFYLDDQGYMVFASPNKALTSANSTNTRSELRQMIRGTNTKIKTKNSKNNFALAVHPLSERFGSVGGKMEATLKVDHVALRANDPSKKAAYSVVVGQIHAGKDQALIDTKLGFGWGNEPLKIYYKKWPGHKTGSVFWNYERNLPKKDPNRTDITYPVWGNTWENPDDPAANGIALGDEFSYTVNVHKNVMHLTFSAQGKKDVNYSINLGNNVDAYGKVDDKDHPNGYAADWHYFKAGAYNQCSTKSAKGIWYPGCLGTGDWATDKQNGDYAQVSFKKLVLSPSTKP。

将所得的PCR产物及pET-28a质粒用限制性内切酶EcoR I和BamHI双酶切，回收酶切后的产物片段。限制性内切酶EcoR I和BamHI购自中国大连宝生物公司，酶切用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过EcoR I和BamHI双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-28a质粒载体，在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min，培养12h，用正向引物AlgL1281-F和反向引物AlgL1281-R进行菌液PCR验证。

将PCR验证正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min,培养12h，用正向引物AlgL1281-F和反向引物AlgL1281-R进行菌液PCR验证，结果得到大小约为1100bp的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确。将重组质粒送至厦门铂瑞生物科技有限公司进行测序，结果表明，在pET-28a的EcoR I和BamHI酶切位点插入SEQ ID NO.1所示的基因AlgL1281，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET-28a-AlgL1281。

使用异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)进行重组海藻多糖裂解酶的诱导表达。加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05mmol/L，16℃诱导20h后将菌液收集至200mL的离心管中，6000rpm离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的溶解缓冲液(溶解缓冲液配方为：0.3mol/LNaCl，15mmol/L咪唑，50mmol/LNaH₂PO₄，pH8.0)中，超声波破碎处理至菌液成半透明(参数设置为300w，超声时间5s，间歇时间5s，总工作时间15min)，11000rpm离心20min，上清与预先用溶解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀，4℃结合1小时，纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化后的蛋白经的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为40kDa，使用Bradford法测定蛋白浓度，得到浓度约为1.0mg/ml的重组海藻多糖裂解酶AlgL1281也即重组酶AlgL1281(结果参见图4)。其中泳道M为蛋白Marker，泳道1为空载体pET-28a在E.coliBL21中的表达，泳道2为重组载体pET-28a-AlgL128在E.coli BL21中的诱导表达，泳道3为重组载体pET-28a-AlgL128在E.coli BL21中的未诱导表达，泳道4为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白AlgL128(40kDa)。可以看出来，目的蛋白AlgL128得到了诱导表达，同时得到了纯化，有效去除了杂质。

所述果胶酶可商购得到，比如可以通过山东康地恩生物有限公司购买得到。

所用活化后的酵母的制备：将冰箱保存的种子(BY4741酿酒酵母菌)接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，在32℃，120r/min的摇床中振荡培养24h。

所述马铃薯葡萄糖液体培养基配方为：马铃薯提取物10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。本发明利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法包括如下步骤：

原料预处理：除去原料中的杂质，然后在阳光下暴晒2-4d，然后使用烘箱烘干残余水分，粉碎过筛。

高压蒸煮：将过筛后的原料按质量比为1:35加水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

硫酸酯酶酶解：调上述滤液的pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h得到滤渣。所述硫酸酯酶加入量为10U/ml。

多功能海藻多糖酶酶解：将上述得到的滤渣按1:30质量比加水，调其pH至6.5-8.5，同时加入多功能海藻多糖降解酶1和果胶酶，反应6h-12h，即可得到发酵性还原糖糖化液。所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％。

离心收集：将发酵性还原糖糖化液进行离心(4000-6000r/min离心15-20min)后，收集上清液，并进行高温灭菌(115℃下高温灭菌0.5h-2h)得到高温灭菌后的糖化液。

酵母发酵：将活化后的酵母按照7％-20％的体积比接入上述高温灭菌后的糖化液里，在28-45℃下厌氧发酵2-4天。

乙醇的分离制备：

将发酵完的发酵液经八层纱布过滤后的上清液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇，将蒸馏出的乙醇再进行浓缩，即可得体积分数90％以上的乙醇。

经过实验验证：酿酒酵母接种量在10％时，37℃下发酵50小时所得到的乙醇浓度最高。

以下实施例均通过常用酸或常用碱来调节pH值。

实施例1：

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

调滤液的pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶(重组酶Sulf1694，以下均同此)，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为10U/ml(滤液体积)。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。再将得到的滤渣按1:30的质量比加水，调pH至6.5-8.5后，再加入多功能海藻多糖降解酶AlgL1281和果胶酶。所述多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml，所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％(体积比)。

(3)乙醇的制备

步骤(2)得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。再按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为20.18％(乙醇产率％＝蒸馏后乙醇的体积/发酵酶解液的体积×100％)。

实施例2

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮20min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

调滤液的pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为10U/ml。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。再将得到的滤渣按1:30的质量比加水，调pH至6.5-8.5后，再加入多功能海藻多糖降解酶AlgL1281和果胶酶，反应6h-12h，所述多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为16.84％。

实施例3

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮40min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为19.87％。

实施例4

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

(2)酶解转化

调滤液的pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为5U/ml。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。再将得到的滤渣按1:30的质量比加水，调pH至6.5-8.5后，再加入多功能海藻多糖降解酶AlgL1281和果胶酶，反应6h-12h，所述多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为15.29％。

实施例5

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

(2)酶解转化

调滤液的pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为15U/ml。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。再将得到的滤渣按1:30的质量比加水，调pH至6.5-8.5后，再加入多功能海藻多糖降解酶AlgL1281和果胶酶，反应6h-12h，所述多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为20.09％。

实施例6

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:30加入600g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为18.71％。

实施例7

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:40加入800g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为19.03％。

实施例8

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的海带粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为19.23％。

实施例9

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的鹿角菜粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

调液体pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为10U/ml。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。将上述中得到的滤渣按1:30的质量比再次加水，调液体pH至6.5-8.5后，再加入多功能海藻多糖降解酶AlgL1281和果胶酶，反应6h-12h，所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为18.86％。

实施例10

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的龙须菜粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

调液体pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为10U/ml。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。将上述中得到的滤渣按1:30的质量比再次加水，调液体pH至6.5-8.5，同时加入多功能海藻多糖降解酶AlgL1281和果胶酶，反应6h-12h，所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为15.81％。

实施例11

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的石花菜粉末(含水率＜10％)，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。蒸煮完成后用三层绢布过滤，收集滤液。

(2)酶解转化

调液体pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为10U/ml。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。将上述中得到的滤渣按1:30质量比再次加水，调pH至6.5-8.5，同时加入多功能海藻多糖降解酶AlgL1281和果胶酶，反应6h-12h，所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为14.63％。

对比例1

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水后，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。

(2)酶解转化

同时加入多功能海藻多糖降解酶(AlgL1281)和果胶酶，反应6h-12h，所述的多功能海藻多糖降解酶的的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％(体积比)。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为9.56％。

对比例2

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水。

(2)酶解转化

调液体pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h。所述硫酸酯酶的加入量为10U/ml。反应完成后用八层纱布过滤，滤渣用蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次。将上述中得到的滤渣按1:30质量比再次加水，调pH至6.5-8.5，同时加入多功能海藻多糖降解酶(AlgL1281)和果胶酶，反应6h-12h，所述的多功能海藻多糖降解酶的的加入量为5U/ml。所述果胶酶的酶活力为4000U/ml，加入量为0.1％(体积比)。

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按10ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为12.59％。

对比例3

由下述步骤组成：

(1)原料预处理：

称取20g干燥后的马尾藻粉末，过40目筛。倒入1L的圆底烧瓶中按质量比为1:35加入700g的水，放入高压灭菌锅中115℃下蒸煮30min。

(2)酶解转化

(3)乙醇的制备

得到的反应液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。按5ml/100ml的接种量接入活化后的酵母(BY4741酿酒酵母菌，OD值达到1.5-2.5)，37℃下，发酵50h，减压蒸馏蒸出乙醇使乙醇的浓度达到90％以上，得到乙醇产率为16.59％。

从以上结果来看，对比例1没有加硫酸酯酶，其的乙醇产率仅为9.56％，对比例2没有蒸煮步骤，其的乙醇产率为12.59％，对比例3，其的乙醇产率为16.59％；实施例1-5添加了硫酸酯酶，所得到的乙醇产率为14.63-20.18％，远远大于对比例1-3的乙醇产率。对比例1可以看出，是否脱硫对酶解的影响较大，对乙醇含量的提升至关重要。实施例1与对比例2相比，蒸煮大大影响了乙醇的产率，主要是蒸煮有利于多糖的溶出，增强酶解效果。另外实施例1与对比例3相比较来看，接种量对乙醇的产率也是有影响的。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法

<130> JMDXL-19032-CNI

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1122

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 1

gtgaactttt acgccgacta cgcagccact ggccgtaata atcgcatttt gaaaaaagaa 60

atcattccat ttcagtacct ctctagcggt tataaataca tgcgcgatca actgctatac 120

accaatataa agtttaaaaa tatagataca atacccactt taattgcgcc tactactacc 180

agcgtaacag ttatagttgt tggcgaaacc gcacgagcag acaattttgc ttaccagggt 240

tataaacgta acaccaatcc ttatacacaa aagcataatg taacgtattt taataatgtg 300

gcgtcttgtg gcacagctac ggctgtgtct gtgccgtgta tgttttcatt gcaaacacac 360

gataactttg atcgattagc agccgacaac caacaaaacc tgattgacct agcacaacaa 420

gctggcagtg atgtactgtg ggttgataac aacagcggct gtaaaaacgt atgcacccgt 480

gttgttaaca taaatatccc aaccgctgca tcagcgcttt gcgatgggaa atattgtttt 540

gatgaagcac ttattgctcc acttaaacgc aaactcgcca atttaagcca agctaatacc 600

gttatcgtcc tacatatgat gggctcgcac ggaccaacct actttaaacg ctacccagaa 660

aagtttaagc aatttacgcc tacgtgcgac agaagcgaca ttcagaactg ctcactcgat 720

gaattagtta atacctacga caatacaatt gcgtacagcg actttgttaa cgcccaagta 780

attgatcaat taaaagcact gccgaacaac atagataagc agtttttata tgtctctgat 840

catggtgaat cacttggcga agccggtgct tacttgcatg gctttccgta tagctttgcg 900

cctagcacgc aaacacatgt tcctctttat atgtgggccg atgagcataa ccaacgcatt 960

accaatacct gtttagctaa tttagacaca cgagctgcac gctcacacaa caacattttt 1020

cacacccttt taaatttaat tggcattaaa agcaaaacgt atcaggcatc ccttgattta 1080

cttgctcgct gccaaacaac accaagcgaa ataaaactat ga 1122

<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 2

Met Asn Phe Tyr Ala Asp Tyr Ala Ala Thr Gly Arg Asn Asn Arg Ile

Leu Lys Lys Glu Ile Ile Pro Phe Gln Tyr Leu Ser Ser Gly Tyr Lys

Tyr Met Arg Asp Gln Leu Leu Tyr Thr Asn Ile Lys Phe Lys Asn Ile

Asp Thr Ile Pro Thr Leu Ile Ala Pro Thr Thr Thr Ser Val Thr Val

Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Arg Ala Asp Asn Phe Ala Tyr Gln Gly

Tyr Lys Arg Asn Thr Asn Pro Tyr Thr Gln Lys His Asn Val Thr Tyr

Phe Asn Asn Val Ala Ser Cys Gly Thr Ala Thr Ala Val Ser Val Pro

Cys Met Phe Ser Leu Gln Thr His Asp Asn Phe Asp Arg Leu Ala Ala

Asp Asn Gln Gln Asn Leu Ile Asp Leu Ala Gln Gln Ala Gly Ser Asp

Val Leu Trp Val Asp Asn Asn Ser Gly Cys Lys Asn Val Cys Thr Arg

Val Val Asn Ile Asn Ile Pro Thr Ala Ala Ser Ala Leu Cys Asp Gly

Lys Tyr Cys Phe Asp Glu Ala Leu Ile Ala Pro Leu Lys Arg Lys Leu

Ala Asn Leu Ser Gln Ala Asn Thr Val Ile Val Leu His Met Met Gly

Ser His Gly Pro Thr Tyr Phe Lys Arg Tyr Pro Glu Lys Phe Lys Gln

Phe Thr Pro Thr Cys Asp Arg Ser Asp Ile Gln Asn Cys Ser Leu Asp

Glu Leu Val Asn Thr Tyr Asp Asn Thr Ile Ala Tyr Ser Asp Phe Val

Asn Ala Gln Val Ile Asp Gln Leu Lys Ala Leu Pro Asn Asn Ile Asp

Lys Gln Phe Leu Tyr Val Ser Asp His Gly Glu Ser Leu Gly Glu Ala

Gly Ala Tyr Leu His Gly Phe Pro Tyr Ser Phe Ala Pro Ser Thr Gln

Thr His Val Pro Leu Tyr Met Trp Ala Asp Glu His Asn Gln Arg Ile

Thr Asn Thr Cys Leu Ala Asn Leu Asp Thr Arg Ala Ala Arg Ser His

Asn Asn Ile Phe His Thr Leu Leu Asn Leu Ile Gly Ile Lys Ser Lys

Thr Tyr Gln Ala Ser Leu Asp Leu Leu Ala Arg Cys Gln Thr Thr Pro

Ser Glu Ile Lys Leu

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgcggatcca acttttacgc cgactacgca gcca 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccgctcgagt agttttattt cgcttggtgt tgtt 34

<210> 5

<211> 1089

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 5

atgaaaaatc taacatctac ttttaaactc acagcactgg ctgctgttac tcctttatta 60

tttatgggct gcgctagtac aaatactaaa cttgaaaata atgcagcagt ccctgcatca 120

aaatttgatt tatcaaactg gaaaattaac gtacctgtcg atttaaacaa cgacggaaaa 180

attgatacag tagacgttaa agaaattcaa acttacgcgc accctgattt tttctacttg 240

gatgatcagg gttatatggt atttgcctcg ccaaataaag cacttaccag cgcaaactca 300

accaataccc gtagtgaatt acgacaaatg atccgcggaa caaacactaa aataaaaact 360

aaaaattcaa aaaacaattt tgcacttgct gtgcacccgc tatcggagcg ttttggctca 420

gtaggcggaa aaatggaagc cacgctcaaa gttgatcatg tagccctgcg tgcaaacgat 480

ccgagtaaaa aagccgctta ttctgtggtg gtagggcaaa ttcacgcagg taaagatcag 540

gcacttatag acactaagct gggttttggc tggggtaacg aaccacttaa aatttattac 600

aaaaaatggc cagggcataa aaccggatcg gtattttgga actacgagcg taacttacca 660

aaaaaagatc ctaaccgaac cgacattact taccctgtat ggggcaacac ctgggaaaac 720

ccagatgacc cagcggctaa cggtattgca ctaggtgacg agtttagcta caccgtgaac 780

gtacataaaa atgttatgca ccttacattt agtgctcaag gcaaaaaaga cgttaactac 840

tctattaact taggtaataa cgtagatgct tatggcaaag tagatgataa agatcatcct 900

aatggctacg ctgccgattg gcattacttt aaagcgggtg cgtataacca atgtagtacc 960

aaaagcgcta aaggaatttg gtacccaggt tgtttaggta cgggtgattg ggctacagac 1020

aagcaaaatg gcgattacgc gcaagtaagc tttaaaaaat tagtattaag cccatcaact 1080

aagccgtaa 1089

<210> 6

<211> 362

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 6

Met Lys Asn Leu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr Ala Leu Ala Ala Val

Thr Pro Leu Leu Phe Met Gly Cys Ala Ser Thr Asn Thr Lys Leu Glu

Asn Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Lys Phe Asp Leu Ser Asn Trp Lys

Ile Asn Val Pro Val Asp Leu Asn Asn Asp Gly Lys Ile Asp Thr Val

Asp Val Lys Glu Ile Gln Thr Tyr Ala His Pro Asp Phe Phe Tyr Leu

Asp Asp Gln Gly Tyr Met Val Phe Ala Ser Pro Asn Lys Ala Leu Thr

Ser Ala Asn Ser Thr Asn Thr Arg Ser Glu Leu Arg Gln Met Ile Arg

Gly Thr Asn Thr Lys Ile Lys Thr Lys Asn Ser Lys Asn Asn Phe Ala

Leu Ala Val His Pro Leu Ser Glu Arg Phe Gly Ser Val Gly Gly Lys

Met Glu Ala Thr Leu Lys Val Asp His Val Ala Leu Arg Ala Asn Asp

Pro Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Ser Val Val Val Gly Gln Ile His Ala

Gly Lys Asp Gln Ala Leu Ile Asp Thr Lys Leu Gly Phe Gly Trp Gly

Asn Glu Pro Leu Lys Ile Tyr Tyr Lys Lys Trp Pro Gly His Lys Thr

Gly Ser Val Phe Trp Asn Tyr Glu Arg Asn Leu Pro Lys Lys Asp Pro

Asn Arg Thr Asp Ile Thr Tyr Pro Val Trp Gly Asn Thr Trp Glu Asn

Pro Asp Asp Pro Ala Ala Asn Gly Ile Ala Leu Gly Asp Glu Phe Ser

Tyr Thr Val Asn Val His Lys Asn Val Met His Leu Thr Phe Ser Ala

Gln Gly Lys Lys Asp Val Asn Tyr Ser Ile Asn Leu Gly Asn Asn Val

Asp Ala Tyr Gly Lys Val Asp Asp Lys Asp His Pro Asn Gly Tyr Ala

Ala Asp Trp His Tyr Phe Lys Ala Gly Ala Tyr Asn Gln Cys Ser Thr

Lys Ser Ala Lys Gly Ile Trp Tyr Pro Gly Cys Leu Gly Thr Gly Asp

Trp Ala Thr Asp Lys Gln Asn Gly Asp Tyr Ala Gln Val Ser Phe Lys

Lys Leu Val Leu Ser Pro Ser Thr Lys Pro

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgcggatcca atactaaact tgaaaataa 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccggaattcc ggcttagttg atgggctta 29

Claims

1.一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤，

高压蒸煮：将上述所得按质量比为1：（30-40）加水后；进行高温高压蒸煮；然后3-5层绢布过滤，收集滤液；所述高温高压蒸煮为高压灭菌锅中110-120℃下蒸煮20-40min；

硫酸酯酶酶解：调上述滤液的pH至6.5-8.5，加入硫酸酯酶，反应6-12h得到滤渣；所述硫酸酯酶的加入量为5-15U/ml；其中硫酸酯酶为重组酶Sulf1694；所述重组酶Sulf1694的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；

多功能海藻多糖酶酶解：将上述得到的滤渣按1：（20-40）质量比加水；调其pH至6.5-8.5，同时加入多功能海藻多糖降解酶和果胶酶，反应6h-12h，即可得到发酵性还原糖糖化液；其中多功能海藻多糖降解酶为重组酶AlgL1281；所述重组酶AlgL1281的氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示；

离心收集：将发酵性还原糖糖化液进行离心后；收集上清液，并进行高温灭菌得到高温灭菌后的糖化液；

酵母发酵：将活化后的酵母按照7%-20%的体积比接入上述高温灭菌后的糖化液里，在28-45℃下厌氧发酵2-4天；

乙醇的分离制备：将发酵完的发酵液经5-10层纱布过滤；过滤后的上清液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇，将蒸馏出的乙醇再进行浓缩，即可得体积分数90％以上的乙醇。

2.如权利要求1所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述海藻原料为红藻和褐藻。

3.如权利要求1所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述海藻原料为石花菜，龙须菜，海带，鹿角菜或马尾藻中的至少一种。

4.如权利要求1所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述高压蒸煮中，将上述所得按质量比为1：35加水后；于110-120℃下进行高温高压蒸煮20-40min，然后3-5层绢布过滤，收集滤液。

5.如权利要求4所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，于115℃下进行高温高压蒸煮30min。

6.如权利要求1所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述硫酸酯酶酶解中，硫酸酯酶加入量为10U/ml。

7.如权利要求1所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述多功能海藻多糖酶酶解中，将上述得到的滤渣按1:30质量比加水；所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为3-8U/ml；所述果胶酶的加入量为0.1-0.3%，果胶酶的酶活为4000U/ml。

8.如权利要求7所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述的多功能海藻多糖降解酶的加入量为5U/ml；所述果胶酶的加入量为0.1%。

9.如权利要求1所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述离心收集中，所述离心的条件为4000-6000r/min离心15-20min；所述高温灭菌的条件为115℃下高温灭菌0.5h-2h。

10.如权利要求1所述利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法，其特征在于，所述乙醇的分离制备中，将发酵完的发酵液经八层纱布过滤。