CN109913504A - 一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物乙醇制备技术领域，具体涉及一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法。将乙醇溶液加入琼脂粉，调节pH，加入H2O2，再调节pH，加热搅拌反应后过滤，滤渣加水常温下搅拌，再过滤，洗涤得到琼脂液体，向液体中加入HCl调节pH，加入琼胶酶和纤维二糖酶，酶解；再次加入HCl调节pH，加入果胶酶酶解得到改性琼脂的糖化液，将糖化液进行离心后，收集上清液，并进行高温灭菌，将活化后的酿酒酵母菌株接入所得到的上清液中，发酵完的发酵液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇。该方法简单易行，方便操作，可行性高。
Description
技术领域
本发明属于生物乙醇制备技术领域，具体涉及一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法。
背景技术
随着石油储备的逐渐减少和其消耗所带来的诸多环境问题，发展可循环利用的清洁能源己经成为世界各国的重中之重。纤维素和半纤维素作为地球上最丰富、廉价的可再生的能源，仅陆生植物即可到达600亿吨纤维素年产量，通过生物技术将其转化为生物乙醇，可降低对石油燃料的依赖。生物乙醇是一种新型的生物质能源，鉴于其可再生性和环境友好性等特点，受到了各个国家的广泛关注，并被认为是可通过相应技术手段转变为高品质的现代能源之一。目前，工业化生产的燃料乙醇绝大多数是以粮食作物为原料的，从长远来看具有规模限制和不可持续性，为了缓解这一问题，能源多元化和开发新型的可再生能源迫在眉睫。
生物质海洋植物是海洋世界的能源库，而海洋藻类是海洋植物的主体，是一种分布极为广泛的海洋生物，可将水、光和二氧化碳转变成为藻类富含生产生物能源的基本原料—碳水化合物。海洋占地面积达71%，其中海洋藻类资源含量丰富，包括红藻、绿藻、褐藻和蓝藻四类，红藻及绿藻等一般经济藻类可为生物能源产业化提供取之不尽、用之不竭的物质来源。然而，当前的研究主要集中于海洋藻类(如红藻、褐藻等)的化学成分分析、海藻多糖的提取及海藻多糖生物活性方面的应用，而储量丰厚、种类繁多的海洋藻类多糖在能源方面的探索研究较少。
乙醇（英语：Ethanol，结构简式：CH3CH2OH）是醇类的一种，是酒的主要成份，所以又称酒精，具有易燃、而且燃烧后几乎没有污染物质排放的优势，被认为是最有发展前景的新型可持续染料。琼脂(Agar)又称琼胶，俗称洋菜、冻粉或冻胶，就是由红海藻纲中提取的亲水性胶体。利用琼脂制备生物乙醇不仅能够引入新的能源原料刺激经济发展，甚至对全球气候变暖也有一定的影响。
发明内容
为了解决现有技术中生物乙醇制备方法的不足之处，本发明提供了一种利用改性琼脂和多种酶结合制备生物乙醇的方法。该方法简单易行，方便操作，可行性高。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
（1）原料预处理：称取25g的琼脂粉于1L的烧杯中，配制一定浓度的乙醇溶液加入，加入H2O2，调节pH，加热至30℃搅拌反应2h后过滤，滤渣加水常温下搅拌10min，然后再过滤，反复洗涤数次，得到低硫酸根高品质琼脂液体。
（2）改性琼脂的糖化：向液体中加入HCl调节pH至6-8，加入琼胶酶和纤维二糖酶，30-50℃酶解12-15h；再次加入HCl调节pH至4-6，加入果胶酶40-60℃酶解50-70h即可得到改性琼脂的糖化液。
（3）将糖化液进行离心后，收集上清液，并进行高温灭菌。
（4）将活化后的酿酒酵母菌株接入步骤（3）中所得到的上清液中，进行厌氧发酵，发酵完的发酵液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇。
其中，步骤（1） 的乙醇浓度为45%（v/v）；加入H2O2，调pH为9；搅拌时间为10min。
步骤（2）中加入的琼胶酶的酶活力为100U/g，纤维二糖酶的酶活力为250U/g以上，所述果胶酶的酶活力为4000U/ml。
所述琼胶酶、维二糖酶和果胶酶相对于低硫酸根琼脂液体加入量：琼胶酶的加入量为1%（w/v），纤维二糖酶的加入量为0.1%（w/v），果胶酶的加入量为0.1%（v/v）。
步骤（3）中离心的条件为：4000-6000r/min离心15-20min。
步骤（4）中所选用的酿酒酵母菌株，在接种发酵前，要进行菌种的活化，活化的条件：将冰箱保存的种子接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃，120r/min的摇床中振荡培养24h。
马铃薯葡萄糖液体培养基配方为：马铃薯提取物10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
步骤（4）中将得到的活化酵母按2%-10%的体积比接入糖化液，在28-45℃下厌氧发酵2-4天。
与现有的技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
（1）在本发明条件下反应硫酸根除去非常多，原琼脂为0.79%（硫酸根所占琼脂的质量分数w/w），改性后为0.21%（w/w），减少了73.4%（w/w），说明本发明可以除去大量的硫酸基团，并且本发明对水解硫酸根的起主要作用的是通过直接加入的一定量的过氧化氢，而不像其他的文献中添加的甲醇进行脱硫，添加甲醇进行脱硫的过程中酸催化糖苷键断裂及糖环链断开，容易造成糖醛酸、半乳糖等组分的破坏，从而使产生的脱硫琼脂不能被琼胶酶降解。而本发明中则不存在上述问题，这是之前未见报道过的。
（2）经过前期脱硫处理的琼脂，简化了后续操作的加酶的处理流程，使操作更加简单、方便。
（3）本发明的原料资源丰富，技术工艺简单，适合大规模生产。
附图说明
图1调节不同pH对琼脂处理后的硫酸根含量变化。
图2添加酶的不同组合方式得到的还原糖含量（以只加入果胶酶的得到的还原糖含量为100%）。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种以琼脂为原料制备生物乙醇的方法。
本发明的具体方法包括下述步骤：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%（v/v）的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；加H2O2，调pH：加11mL的H2O2，调节pH为9；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的样品备用。
琼胶的预处理的主要目的是为了脱去硫酸根，加入过氧化氢脱硫是本发明的后续酶解过程的基础，通过加入过氧化氢脱硫可以极大的脱去琼脂中的硫酸根，方便之后的酶解，这是之前未见报道的。过氧化氢脱硫的机理是：添加过氧化氢之后，H2O2分解产生氧化性很强的羟基自由基(OH·和HO2·)，而且寿命很短的自由基容易在碳表面通过共轭而稳定，从而有效氧化有机含硫化合物。琼胶二糖的前体结构如下：，添加过氧化氢还会发生如下反应H2O2+SO3 2-→SO4 2-+H2O生成SO4 2-，SO4 2-易于被洗涤过滤掉，从而有效达到脱硫的效果，而且不会导致糖苷键断裂及糖环链断开，有利于后续的酶解过程。
（2）琼胶酶的酶解
本发明直接加入的一定量的过氧化氢进行改性，不会导致糖苷键断裂及糖环链断开，从而可以直接加入琼胶酶进行降解，向备用样品中加入HCl调节pH至6-8，加入琼胶酶，30-50℃酶解12-15h。
琼胶酶可以将琼脂降解为寡糖的酶，按照裂解琼脂糖的糖苷键分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。一般来源于微生物。目前报道的琼胶酶中β-琼胶酶占绝大多数。 α-琼胶酶:裂解琼胶糖的α-1,3糖苷键，生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3,6-内醚-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖，文献报道的α-琼胶酶只有两例。β-琼胶酶:裂解琼胶糖的β-1,4糖苷键，生成以β-D-半乳糖为还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖得到的产物的最基本单元是琼二糖和新琼二糖。本发明中使用的琼胶酶为β-琼胶酶，酶活力为100U/g.
纤维二糖酶又称β-葡萄糖苷酶，包括内切型和外切型，可将二糖切为单糖，所以对琼胶酶处理后的脱硫琼脂水解效果较好。此反应证明了脱硫琼脂水解为可发酵性还原糖的可行性。本发明中使用的纤维二糖酶酶活力为250U/g以上。
（3）果胶酶的酶解
将上述的酶解产物再次加入HCl调节pH至4-6，加入果胶酶40-60℃酶解50-70h即可得到改性琼脂的糖化液。糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。因为果胶酶是一种内切酶，可从分子内部无规则地截断α-1,4糖苷键，所以对预处理后脱硫琼胶糖化效果较好。本发明中使用的果胶酶酶活力为4000U/ml。
所述的琼胶酶、纤维二糖酶、果胶酶都可以通过商业途径购买得到，其中琼胶酶通过上海阳光生物科技有限公司购买得到，纤维二糖酶通过Sigma公司购买得到，果胶酶通过山东康地恩生物有限公司购买得到。
虽然在添加了琼胶酶和纤维二糖酶之后，已经可以得到一定数量的发酵性还原糖，但是酶解不彻底，可发酵性的还原糖含量并不是很高，而当再次添加果胶酶之后，可以最大限度的发挥三种酶的作用，使得改性琼脂最大程度的转化为可发酵性还原糖。对于几种酶的加入量，综合成本和酶解效率来考虑，琼胶酶、维二糖酶和果胶酶相对于低硫酸根琼脂液体加入量：琼胶酶的加入量为1%（w/v），纤维二糖酶的加入量为0.1%（w/v），果胶酶的加入量为0.1%（v/v）。可以看出加入的酶的量较少，但是效果却很显著。酶解液还原糖含量的测定，还原糖含量的测定采用DNS法GB/T 5009.7-2003 0。如图2所示。还原糖含量的测定公式:还原糖百分含量(%)=（酶解液中还原糖的含量/酶解液的质量）×100。
(4) 发酵制备生物乙醇
BY4741酿酒酵母菌是一种常用的酿酒酵母菌种，甘油菌，使用甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，保存在-20℃。
首先进行酵母的活化：将冰箱保存的种子接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，在32℃，120r/min的摇床中振荡培养24h。活化后的酵母可以更快的适应改性琼脂的糖化液，使生物乙醇的制备效率得到提高。将得到的活化后的酵母按照2%-10%的体积比接入步骤（3）的高温灭菌后的糖化液里，在28-45℃下厌氧发酵2-4天。
马铃薯葡萄糖液体培养基配方为：马铃薯提取物10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
（5）乙醇的分离制备
将发酵完的发酵液经八层纱布过滤，将上清液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇，将 蒸馏出的乙醇再进行浓缩，即可得体积分数90％以上的乙醇。
经过实验验证：接种量在5%时，35℃下发酵48小时所得到的乙醇浓度最高。
在具体实施过程中，具体有以下的对比例和实施例，以便于本技术领域的人员更方便了解本发明的技术方案：
本发明实施例中，以每100mL发酵培养基计。
实施例1
由下述步骤组成：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%（v/v）的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；加H2O2，调pH：加11mL的H2O2，调节pH为7；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的样品备用。
（2）改性琼脂的糖化
向液体中加入HCl调节pH至6，加入琼胶酶25mg和纤维二糖酶2.5mg，40℃酶解14h；再次加入HCl调节pH至5，加入果胶酶2.5mg，50℃酶解60h得到改性琼脂的糖化液。
（3）乙醇的制备
糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。活化后的酵母按15ml/100ml的接种量接入酵母，35℃下，发酵48h，减压蒸馏蒸出乙醇，得到乙醇产率为13.49％。
实施例2
由下述步骤组成：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%（v/v）的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；加H2O2，调pH：加11mL的H2O2，调节pH为9；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的琼脂液体备用。
（2）改性琼脂的糖化
向液体中加入HCl调节pH至6，加入琼胶酶25mg和纤维二糖酶2.5mg，40℃酶解14h；再次加入HCl调节pH至5，加入果胶酶2.5mg ，50℃酶解60h得到改性琼脂的糖化液。
（3）乙醇的制备
糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。活化后的酵母按15ml/100ml的接种量接入酵母，35℃下，发酵48h，减压蒸馏蒸出乙醇，得到乙醇产率为16.72％。
实施例3
由下述步骤组成：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%（v/v）的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；加H2O2，调pH：加11mL的H2O2，调节pH为11；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的琼脂液体备用。
（2）改性琼脂的糖化
向液体中加入HCl调节pH至6，加入琼胶酶25mg和纤维二糖酶2.5mg，40℃酶解14h；再次加入HCl调节pH至5，加入果胶酶50℃酶解60h得到改性琼脂的糖化液。
（3）乙醇的制备
糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。活化后的酵母按15ml/100ml的接种量接入酵母，35℃下，发酵48h，减压蒸馏蒸出乙醇，得到乙醇产率为11.58％。
对比例1
由下述步骤组成：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的样品备用。（不加入H2O2）
（2）改性琼脂的糖化
向液体中加入HCl调节pH至6，加入琼胶酶和纤维二糖酶，40℃酶解14h；再次加入HCl调节pH至5，加入果胶酶50℃酶解60h得到改性琼脂的糖化液。
（3）乙醇的制备
糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。活化后的酵母按15ml/100ml的接种量接入酵母，35℃下，发酵48h，减压蒸馏蒸出乙醇，得到乙醇产率为6.52％。
对比例2
由下述步骤组成：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%（v/v）的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；加H2O2，调pH：加11mL的H2O2，调节pH为9；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的样品备用。
（2）改性琼脂的糖化
向液体中加入HCl调节pH至6，加入琼胶酶25mg，40℃酶解14h。
（3）乙醇的制备
糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。活化后的酵母按15ml/100ml的接种量接入酵母，35℃下，发酵48h，减压蒸馏蒸出乙醇，得到乙醇产率为5.32％。
对比例3
由下述步骤组成：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%（v/v）的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；加H2O2，调pH：加11mL的H2O2，调节pH为9；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的琼脂液体备用。
（2）改性琼脂的糖化
向液体中加入HCl调节pH至6，加入琼胶酶25mg和纤维二糖酶2.5mg，40℃酶解14h。
（3）乙醇的制备
糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。活化后的酵母按15ml/100ml的接种量接入酵母，35℃下，发酵48h，减压蒸馏蒸出乙醇，得到乙醇产率为10.36％。
对比例4
由下述步骤组成：
（1）琼脂的预处理
配制浓度45%的乙醇溶液，每25g的琼脂粉于1L的烧杯中；加H2O2，调pH：加11mL的 H2O2，调节pH为9；控温反应：控制温度为30℃，在磁力搅拌器上加热搅拌反应2h；过滤、洗涤：反应完成后用纱布过滤，滤渣用1L蒸馏水在磁力搅拌器上搅拌10min，然后过滤，反复洗涤五次；得到的琼脂液体备用。
（2）改性琼脂的糖化
向液体中加入HCl调节pH至6，加入琼胶酶25mg，40℃酶解14h。再次加入HCl调节pH至5，加入果胶酶50℃酶解60h得到改性琼脂的糖化液。
（3）乙醇的制备
糖化液进行4000-6000r/min离心15-20min。离心之后收集上清液，然后将上清液在105℃下高温灭菌0.5h-2h。活化后的酵母按15ml/100ml的接种量接入酵母，35℃下，发酵48h，减压蒸馏蒸出乙醇，得到乙醇产率为11.02％。
从以上结果来看，脱硫效果对对乙醇的发酵具有很大影响，硫酸根的存在会极大的抑制酵母的生长，不进行脱硫的情况下乙醇的产量非常有限，纤维二糖酶和果胶酶的添加对酶解过程至关重要，从而也会对乙醇的产量造成影响。
从图1中可以看出，本发明改性琼脂的硫酸根比原琼脂的少，加入过氧化氢调节pH9后改性获得琼脂的硫酸根（0.21%）(w/w)最少，比原琼脂硫酸根(0.79%）(w/w)降低了73.4%。从图2（以只加入果胶酶的得到的还原糖含量为100%）可以看出，纤维二糖酶和果胶酶的添加与否对酶解效果影响较大，加入纤维二糖酶和果胶酶可以使得还原糖的含量提升2倍。
Claims (10)
1.一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）原料预处理：称取25g的琼脂粉于1L的烧杯中，配制一定浓度的乙醇溶液加入，加入H2O2，调节pH，加热搅拌反应一段时间后过滤，滤渣加水常温下搅拌30min，然后再过滤，反复洗涤，得到低硫酸根琼脂液体；
（2）改性琼脂的糖化：向琼脂液体中加入HCl调节pH至6-8，加入琼胶酶和纤维二糖酶，酶解；再次加入HCl调节pH至4-6，加入果胶酶酶解得到改性琼脂的糖化液；
（3）将糖化液进行离心后，收集上清液，并进行高温灭菌；
（4）将活化后的酿酒酵母菌株接入步骤（3）中所得到的上清液中，进行厌氧发酵，发酵完的发酵液采用减压蒸馏的方法蒸出乙醇。
2.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：步骤（1） 的乙醇浓度为45%（v/v）。
3.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：步骤（1）加入H2O2，调pH为9；加热温度为30摄氏度，加热搅拌时间为2h。
4.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：步骤（2）中加入的琼胶酶的酶活力为100U/g，纤维二糖酶的酶活力为250U/g以上，所述果胶酶的酶活力为4000U/ml。
5.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：所述琼胶酶、纤维二糖酶和果胶酶相对于低硫酸根琼脂液体的加入量：琼胶酶的加入量为1%（w/v），纤维二糖酶的加入量为0.1%（w/v），果胶酶的加入量为0.1%（v/v）。
6.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：琼胶酶和纤维二糖酶的酶解条件为：30-50℃酶解12-15h；果胶酶的的酶解条件为：40-60℃酶解50-70h。
7.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：步骤（3）中离心的条件为：4000-6000r/min离心15-20min。
8.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：步骤（4）中所选用的酿酒酵母菌株，在接种发酵前，要进行菌种的活化，活化的条件：将冰箱保存的种子接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃，120r/min的摇床中振荡培养24h。
9.根据权利要求8所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：马铃薯葡萄糖液体培养基配方为：马铃薯提取物10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
10.根据权利要求1所述的一种利用改性琼脂制备生物乙醇的方法，其特征在于：步骤（4）中将得到的活化酵母按2%-10%的体积比接入步骤中（3）所得到的上清液中，在28-45℃下厌氧发酵2-4天。
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| CN106414728A (zh) * | 2013-10-14 | 2017-02-15 | 高丽大学校产学协力团 | 琼胶寡糖水解酶及通过使用该琼胶寡糖水解酶从琼脂糖中生成3,6-脱水-l-半乳糖和半乳糖的方法 |
| WO2017057823A1 (ko) * | 2015-10-02 | 2017-04-06 | 주식회사 레모넥스 | 수용성 고분자가 결합된 나노물질을 포함하는 소광제 및 이의 용도 |
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2019
- 2019-04-23 CN CN201910330249.1A patent/CN109913504B/zh active Active
Patent Citations (4)
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| CN110257439A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-20 | 集美大学 | 一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法 |
| CN110257439B (zh) * | 2019-06-28 | 2021-08-03 | 集美大学 | 一种利用酶处理海藻多糖制备生物乙醇的方法 |
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