CN103352057B - 一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于包括以下步骤：1）预处理：将竹笋加工剩余物风干后机械粉碎过筛，稀碱液处理，水洗至中性，过滤、烘干；2）酶水解：按固液比为1:10在滤渣中加入柠檬酸钠缓冲溶液及纤维素酶和半纤维素酶在35-45℃下反应45-60h，得还原性糖液；3）脱毒处理：在还原性糖液中添加2%的活性炭进行脱毒处理；4）发酵：调节脱毒后的糖液总糖浓度为，pH，接种酵母菌株，发酵制得燃料乙醇。本发明方法制备燃料乙醇，在保证燃料乙醇得率的情况下，工艺简单、降低生产成本、便于实现工业化生产；同时减少环境污染，变废为宝。
Description
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法。
背景技术
随着全球经济的迅速发展，能源和环境问题已经成为共同关注的焦点。传统的化石燃料日趋减少，终将枯竭，只有开发新的可替代能源才能实现人类的可持续发展。目前，以玉米、甘蔗、小麦、甜菜、陈化粮等为原料生产的燃料乙醇的生产工艺相当成熟，并已经投入生产。但这些农作物来源带有明显季节性，不能常年取材使用，存在与民争粮的弊端，不宜作为能源生产原材料。
我国竹类资源非常丰富，现有竹林面积600多万公顷，大约占全球竹林面积近四分之一。竹子生长迅速、生物量大、适应性极强，能充分利用边际土地，不与民争粮争地，采伐周期短，一次种植可持续利用时间长，采后对竹林结构、生态、景观等功能不会造成明显影响。竹子富含纤维素、半纤维等糖类化合物，其总纤维含量70%以上，这些含量丰富的多糖高聚物可通过水解、发酵等技术处理后转化成燃料乙醇。因此，对竹类植物开展能源化培育、开发和利用前景广阔。我国丰富的竹子资源使得竹笋、材加工企业众多，产生了大量废弃物。据不完全统计，仅笋及笋蒲头等竹笋加工剩余物年产量约160万t，如果直接扔掉，既浪费资源，又污染环境。若能将这些资源加以开发利用，其经济效益、生态效益及社会效益都将非常显著。
目前，已有利用竹材进行制备燃料乙醇的方法，例如由中国林业科学研究院亚热带林业研究所的张金萍等人发明公开了一种由竹材纤维制备燃料乙醇的方法(专利申请号200810080614)。该发明以竹材加工废弃物为原料，技术方案如下：以毛竹下脚料(也适用于其它非木材生物质)为原材料，将其截断、烘干、粉碎、过80目筛，分为竹细粉和竹粗粉；将竹粗粉加入蒸煮器中，用甲酸、乙酸和水的混合液蒸煮2h。将蒸煮浓缩后得戊糖浓缩液，所得固体残渣为纤维素成分用甲酸和盐酸水解，甲酸减压蒸馏回收后得到还原糖；将竹细粉加入水解反应器中，加入甲酸和盐酸水解，将甲酸和盐酸水解后得到还原糖；将上述还原糖混合后，经脱毒处理，用酿酒酵母和休哈塔假丝酵母发酵，最终乙醇产率为0.4g/g。该制备方法以毛竹下脚料为原料，原材料经过截断、烘干、粉碎等物理预处理，分为竹粗粉和竹细粉，进行分级预处理过程比较多，工作量较大；发酵过程中使用酿酒酵母和休哈塔假丝酵母分别利用葡萄糖和木糖发酵产乙醇，不利于生产成本控制。由农业部沼气科学研究所何明雄等人公开了一种竹子生物质废弃物生产燃料乙醇的工艺(专利申请号 201010187061)。该工艺技术路线如下：将竹子生物质废弃物(主要是笋壳和竹叶)在50℃下H3PO4溶液中，固液比为1:8，在90rpm转速下处理0.5-1h，然后加入2.5倍H3PO4溶液体积的预冷丙酮，搅拌混合均匀，再固液分离；将固体残渣用5倍H3PO4溶液体积的丙酮洗涤，固液分离收集沉淀，水洗得到纤维素组分。收集上清液得到半纤维素溶液；将预处理后的纤维素组分加入pH4.8、0.1M柠檬酸钠缓冲溶液中，再加入2.0%-4.0%的纤维素酶在50℃，120rpm的条件下处理6-12h；将水解液在30℃下采用运动发酵单细胞菌ATCC29191发酵24h制得燃料乙醇。该制备方法选用竹叶和笋壳作为原材料，但在实际原料收集方面，笋壳和竹叶一般是作为废弃物直接扔在竹林地，如果大量生产，需要一定的人力进行收集转运，劳动量过大，不能大量生产，限制了其推广应用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明目的在于在提供一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）预处理：将竹笋加工剩余物风干后机械粉碎过20目筛得粉碎物，将粉碎物用浓度为1%的NaOH溶液在灭菌锅121℃下处理30min，水洗至中性，过滤收集固体滤渣，该预处理步骤可去除粉碎物中的木质素；
2）酶水解：将步骤1）预处理后的固体滤渣中加入pH4.0-5.5柠檬酸钠缓冲溶液中，固液比为1:10，再添加固体滤渣总量的8-16%的纤维素酶和半纤维素酶在35-45℃下反应45-60h，过滤得还原性糖液，酶解过滤的残渣经烘干后可以用来燃烧发电继续利用；
3）脱毒处理：在步骤2）制得的还原性糖液中添加2%的活性炭进行脱毒处理；
4）发酵：将经过脱毒处理后的还原性糖液调节总糖浓度为50-70g/L，pH5.5，按5-8%（v/v）接种酵母菌株，在30-35℃下发酵60h制得燃料乙醇。
所述的一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于所述竹笋加工剩余物为主要为笋蒲头，也可有少量的笋壳。
所述的一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于所述步骤1）中粉碎物与NaOH溶液的固液比为1:12。
所述的一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于所述步骤2)中纤维素酶和半纤维素酶的比例为1:1，两种酶的活性均为8000u/g-12000u/g。
所述的一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于所述步骤3）中脱毒处理温度为70℃，脱毒处理时间为2h。
所述的一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于所述步骤4）所述的酵母菌株为休哈塔假丝经人工驯化，其驯化方法为：
a）购买以木糖作为发酵对象的休哈塔假丝酵母菌株；
b）酵母活化和增值培养基（g/L）：木糖15.0，蛋白胨10.0，酵母浸膏5.0；
c）发酵菌种筛选培养基（g/L）：采用木糖30、葡萄糖30两种混合作为碳源，硫酸铵5.0，磷酸二氢钾3.0，硫酸镁0.5作为氮源，再用无菌的柠檬酸缓冲液调节pH5.0-6.0，在32℃下培养，人工筛选24-48h内存活的酵母菌，扩繁增值后配制成酵母液，即得到经驯化的休哈塔假丝酵母菌株。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1. 原材料选取竹笋加工剩余物，纤维素和半纤维素含量比较高，相比于竹子，竹笋中木质素含量很低，所需要的预处理条件比较温和，更有利于水解、发酵反应的进行。
2. 竹笋加工剩余物一般比较集中，便于收集，很多笋制品加工企业会产生大量的废弃物，如果加以利用，既可以解决企业废弃物的处理难题，还可以变废为宝重新利用，提升价值。
3. 竹笋中的纤维素和半纤维素可以利用纤维素酶和半纤维素酶进行水解，得到木糖和葡萄糖，可以进行发酵产乙醇。
4. 休哈塔假丝酵母可以利用葡萄糖和木糖进行发酵产乙醇，通过对该菌种进行人工驯化选育，得到可以同时利用木糖和葡萄糖发酵的菌株，有利于简化生产工艺，降低乙醇生产成本，便于实现工业化生产。
附图说明
图1为竹笋加工剩余物制备燃料乙醇流程示意图；
图2为不同浓度NaOH处理后干重；
图3为不同浓度NaOH处理后酶解液单糖含量；
图4为不同比例混合酶水解单糖含量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
将竹笋加工剩余物主要是笋蒲头及少量的笋壳，风干后机械粉碎过20目筛得粉碎物，准确称取粉碎物15g，按固液比1:12添加浓度为1%的NaOH溶液进行预处理，去除木质素，在121℃下反应处理30min，水洗至中性，过滤收集滤渣，烘干得剩余干重试样13.9g。
准确称取经过预处理的干重试样4g于150mL锥形瓶中，往锥形瓶中添加pH4.4柠檬酸钠缓冲溶液40mL，再添加0.64g纤维素酶和0.64g半纤维素酶在40℃下反应48h，过滤得还原性糖液，利用DNS法测量还原性糖液中单糖的含量，最后测得单糖含量为3.49g, 酶解转化率87.4%,在制得的还原性糖液中添加2%的活性炭在70℃下进行脱毒处理2h；取100mL经过脱毒处理后的还原性糖液总糖浓度调节为60 g/L，pH5.5，按6%（v/v）接种酵母菌株，摇床转速140r/min，在32℃下发酵60h制得燃料乙醇1.23g。计算后可知由竹粉为生物质原料制备燃料乙醇产率为1kg竹粉可以生产得到165g乙醇，得率16.5%。
实施例2
准确称取实施例1中经过预处理的干重试样4g于150mL锥形瓶中，往锥形瓶中添加pH4.0柠檬酸钠缓冲溶液40mL，再添加0.16g纤维素酶和0.16g半纤维素酶在35℃下反应60h，过滤得还原性糖液，利用DNS法测量还原性糖液中单糖的含量，最后测得单糖含量为2.84g, 酶解转化率71%,在制得的还原性糖液中添加2%的活性炭在70℃下进行脱毒处理2h；取100mL经过脱毒处理后的还原性糖液总糖浓度调节为50g/L，pH4.5，按5%（v/v）接种酵母菌株，摇床转速140r/min，在35℃下发酵60h制得燃料乙醇1.08g。即由竹粉为生物质原料制备燃料乙醇产率为1kg竹粉可以生产得到142g乙醇，得率14.2%。
实施例3
准确称取实施例1中经过预处理的干重试样4g于150mL锥形瓶中，往锥形瓶中添加pH5.5柠檬酸钠缓冲溶液40mL，再添加0.32g纤维素酶和0.32g半纤维素酶在35℃下反应60h，过滤得还原性糖液，利用DNS法测量还原性糖液中单糖的含量，最后测得单糖含量为2.98g, 酶解转化率74.5%,在制得的还原性糖液中添加2%的活性炭在70℃下进行脱毒处理2h；取100mL经过脱毒处理后的还原性糖液总糖浓度调节为70g/L，pH6.0，按8%（v/v）接种酵母菌株，摇床转速140r/min，在30℃下发酵60h制得燃料乙醇1.14g。即由竹粉为生物质原料制备燃料乙醇产率为1kg竹粉可以生产得到112g乙醇，得率11.2%。
上述实施例中，酵母菌株为休哈塔假丝经人工驯化，驯化方法为：a）购买以木糖作为发酵对象的休哈塔假丝酵母菌株；b）酵母活化和增值培养基（g/L）：木糖15.0，蛋白胨10.0，酵母浸膏5.0；c）发酵菌种筛选培养基（g/L）：采用木糖30、葡萄糖30两种混合作为碳源，硫酸铵5.0，磷酸二氢钾3.0，硫酸镁0.5作为氮源，再用无菌的柠檬酸缓冲液调节pH5.0-6.0，在32℃下培养24-48h，进行人工筛选存活的酵母菌，扩繁增值后配制成酵母液, 即得到经驯化的休哈塔假丝酵母菌株。
上述制备方法中竹笋加工剩余物由杭州康鑫食品有限公司提供，纤维素酶(阿拉丁试剂，10000u/g)；半纤维素酶(上海如吉生物科技，10000u/g)；葡萄糖(高级纯，阿拉丁试剂)，氢氧化钠(AR，天津永大化学试剂有限公司)。休哈塔假丝酵母，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供，经浙江农林大学森林培育国家重点实验室驯化后保藏。
实验1：稀碱预处理
NaOH处理竹粉可以破坏除去原料中大部分的木质素，以及少量纤维素和半纤维素。为了确定预处理过程中适宜的碱浓度，本实验设置碱浓度梯度为0、1%、3%、6%、9%、12%的NaOH溶液进行单因素实验。取6支250mL锥形瓶，编号0、1、2、3、4、5，每瓶称取15.0g竹粉，分别加入蒸馏水、1%、3%、6%、9%、12%的NaOH溶液各150mL，固液比1:10，在121℃下反应30min，取出冷却后水洗至中性，过滤，65℃烘干称重，比较经不同浓度处理后的原料干重。所得数据作图，见图2。结果表明，随着碱浓度的增加，处理后竹粉的质量损失随之增多，而质量损失趋势逐渐变小。蒸馏水处理后减少的质量主要为少量可溶性杂质。当NaOH溶液浓度增加到12%时，处理后竹粉质量损失高达54.0%，原料损失超过一半。
实验2：不同浓度稀碱预处理单糖得率比较
稀碱处理后的原料与未处理或者只有经过单一物理机械粉碎处理的原料，进行酶解，探索何种浓度的碱溶液处理后更有利于酶解反应，产生更多的单糖以及更高的原料利用率。
分别准确称取经实验16中不同碱浓度预处理后的竹粉4g于150mL锥形瓶中，固液比1:10，对应编号0、1、2、3、4、5，各加入40mL pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、0.5g纤维素酶、0.5g半纤维素酶，温度45℃下振荡反应，摇床转速140r/min。用DNS法每隔12h取样检测还原糖含量，与标准曲线比较，计算水解单糖产量。每组实验重复三次，取平均值，所得数据作图，得到单糖含量与时间曲线图，见图3。
经过NaOH溶液预处理后的竹粉，其酶解反应活性得到明显提高，图3表明，随着NaOH溶液浓度的增加，相同反应时间内酶解液中单糖含量随之增加，但增加的幅度逐渐趋于平缓。结合图2与图3分析，高浓度的碱溶液处理竹粉伴随着大量原料的损失，当NaOH溶液浓度由1%增加到12%时，质量损失由7.5%增加到54%之多，酶解36h后单糖含量从34.5mg/mL增加到56.5mg/mL，而糖得率却从32%下降至25%。另一方面，高浓度碱对设备腐蚀非常严重，最终选择以1%NaOH溶液进行预处理。
实验3：混合酶添加量的确定
测定购买的纤维素酶活性。剪取4g定量滤纸于150mL锥形瓶中，固液比1:10，加入pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液40mL，摇床转速140r/min，在50℃水浴摇床中振荡反应30min后检测反应液中单糖含量。根据水解糖得率计算得到纤维素酶滤纸酶活FPA=8.4×10-6kat(在25℃，pH值4.8条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化成产物所需要的酶量，定义为1个滤纸纤维素酶活性单位，以kat表示)。
由于纯半纤维素不易获得，单独购买成本较高，本实验不对其做活性测定，而是按照不同的混合酶比例进行实验，找出纤维素酶与半纤维素酶的添加量的最佳比值。实验中设置纤维素酶与半纤维素酶添加比值分别为6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4，混合酶总质量为1g，根据酶解结果探索最佳的纤维素酶和半纤维素酶添加比例。
由图4可以看出，随着纤维素酶与半纤维素酶混合比例不断增加为1:1时，反应液中总糖含量最高。显然，竹粉成分中半纤维素的含量不到纤维素含量的一半，而酶解过程中半纤维素酶的添加量与纤维素酶相同，导致这一结果的原因很可能是购买的半纤维素酶活性比纤维素酶活性差所引起的。因此，最终选择纤维素酶与半纤维素酶添加比例为1:1。
Claims (3)
1.一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）预处理：将竹笋加工剩余物风干后机械粉碎过20目筛得粉碎物，将粉碎物用浓度为1%的NaOH溶液在121℃下处理30min，水洗至中性，过滤收集固体滤渣，烘干；
2）酶水解：将步骤1）预处理后的固体滤渣中加入pH4.0-5.5柠檬酸钠缓冲溶液中，固液比为1:10，再添加固体滤渣总量的8-16%的纤维素酶和半纤维素酶在35-45℃下反应45-60h，过滤得还原性糖液；
3）脱毒处理：在步骤2）制得的还原性糖液中添加2%的活性炭进行脱毒处理；
4）发酵：将经过脱毒处理后的还原性糖液调节总糖浓度为50-70g/L，pH4.5-6.0，按5-8%（v/v）接种经驯化的休哈塔假丝菌株，在30-35℃下发酵60h制得燃料乙醇；
其中，步骤1）中粉碎物与NaOH溶液的固液比为1:12；
步骤2)中纤维素酶和半纤维素酶的比例为1:1，两种酶的活性均为8000u/g-12000u/g；
步骤4）所述的休哈塔假丝经人工驯化，其驯化方法为：a）购买以木糖作为发酵对象的休哈塔假丝酵母菌株；b）酵母活化和增值培养基（g/L）：木糖15.0，蛋白胨10.0，酵母浸膏5.0；c）发酵菌种筛选培养基（g/L）：木糖30、葡萄糖30，硫酸铵5.0，磷酸二氢钾3.0，硫酸镁0.5，再用无菌的柠檬酸缓冲液调节pH5.0-6.0，在32℃下培养，人工筛选培养24-48h内存活的酵母菌，扩繁增值后配制成酵母液，即得到经驯化的休哈塔假丝酵母菌株。
2.根据权利要求1所述的一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于所述竹笋加工剩余物为笋蒲头。
3.根据权利要求1所述的一种以竹笋加工剩余物为原料制备燃料乙醇的方法，其特征在于所述步骤3）中脱毒处理温度为70℃，脱毒处理时间为2h。
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