CN116042730A - 一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于燃料乙醇生产的技术领域，具体涉及一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法。以玉米淀粉生产工业剩余物——玉米纤维为原料，开发了一种高效生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，选择C6/C5共发酵酵母LF1，与步骤（1）的玉米纤维水解液进行半同步糖化发酵；并根据不同浓度的水解液，提供了不同的脱毒策略，妥善的解决了水解液中抑制物对菌株发酵的毒害作用，大幅度的提升了发酵效率，并最终通过发酵体积放大及优化形成了玉米纤维原料高效生物转化生产燃料乙醇的整体工艺流程，为下一步中试示范生产奠定了基础。

Description

一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法

技术领域

本发明属于燃料乙醇生产的技术领域，具体涉及一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法。

背景技术

发展生物质能源技术是世界范围内新能源格局的重要部分。燃料乙醇因具有高辛烷值、燃烧清洁等优点被认为是新能源发展的理想目标之一，其可持续发展的根本措施是实现以木质纤维素类生物质为原料的纤维素乙醇生产，这对替代石化资源等不可再生能源以及对大气雾霾污染、水土资源污染控制具有重要的战略意义。木质纤维素类生物质是地球上最丰富的可再生资源，兼具来源广、种类多和价格低等特点，以其为原料生产纤维素乙醇（也称为第二代燃料乙醇）是未来燃料乙醇发展的主流方向。目前纤维素乙醇生产原料的研究多以秸秆类农业剩余物居多，而对其他原料的研究较少，且因转化过程中成本居高不下严重阻碍了工业化进程。因此，拓展生产原料利用范围，实现原料利用多元化，对加速纤维素乙醇的工业化生产具有重要的意义。玉米纤维是玉米深加工过程产生的剩余物，全国年均生成量约300万吨，除部分用于饲料或膳食纤维行业外，更大宗地利用渠道尚在探索中。玉米纤维富含纤维素和半纤维素（约占65%），还含有一定比例的淀粉（13%）和粗蛋白（11%），且木质素含量极低（仅约2%），木质素是导致植物致密的结构和坚韧的刚性的主要原因，在以秸秆类为代表的木质纤维素原料利用的过程中，脱除木质素是提高原料水解效率的重要步骤，这无疑增加了应用成本。而玉米纤维低木质素的特性很好的避开了上述问题，不仅无需进行木质素脱除步骤，而且还预示玉米纤维结构松散，存在易于处理的潜在特点。总之，玉米纤维具有高含糖量、低木质素、富含氮源、物理结构松散易于处理，以及容易收、储、运等特点，这充分说它是一种纤维素乙醇生产的优良原料，具备纤维乙醇工业化应用的重要潜力，将其合理有效的高值转化，不仅可增加相关企业的收入亦可对环境产生有利的影响，并且对带动当地经济发展以及加快可再生能源的工业化进程具有重要意义。

发明内容

针对目前纤维素乙醇生产原料的部分局限性，以及实现对工业生产剩余物玉米纤维的高效高值转化，因此亟需开发对于非典型的、地域性的木质纤维素原料的燃料乙醇生产工艺。本发明以玉米淀粉生产工业剩余物——玉米纤维为原料，开发了一种高效生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，选择C6/C5共发酵酵母LF1，与步骤（1）的玉米纤维水解液进行发酵；并根据不同浓度的水解液，提供了不同的脱毒策略，妥善的解决了水解液中抑制物对菌株发酵的毒害作用，大幅度的提升了发酵效率，并最终通过发酵体积放大及优化形成了玉米纤维原料高效生物转化生产燃料乙醇的整体工艺流程，为下一步中试示范生产奠定了基础。

本发明的技术方案如下：

一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，包括以下步骤：

（1）玉米纤维发酵水解液的制备，采用稀酸预处理、纤维素酶酶解，离心除去固态物质，补充酵母粉、蛋白胨，即得；

（2）发酵，选择C6/C5共发酵酵母LF1，与步骤（1）的玉米纤维水解液进行半同步糖化发酵；所述的发酵酵母LF1为酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCC No .11331。

优选地，还包括将水解液规模放大发酵，生产高浓度乙醇。

优选地，步骤（1）稀酸预处理条件为10%干重、0.5%-1% (w/v) H₂SO₄、115±2℃、120±5 min；纤维素酶酶解条件为：使用CaO或Ca(OH)₂调节pH至4.8-5.0，添加10 FPU/g干重的赛诺纤维素酶进行酶解。

优选地，步骤（2）的具体过程为：对步骤（1）获得的水解液进行离心，保留上清液，补加1%酵母粉和2%的蛋白胨配制成发酵液，并按照OD600 3.5±0.2接种发酵菌株LF1，进行发酵。

优选地，不同浓度的玉米纤维水解液采用不同的脱毒策略用以缓解抑制物对发酵菌株的毒害作用，提升发酵效率；

对干重10-20%的玉米纤维水解液，在发酵过程12~18 h添加5~10 mM的Na₂SO₃或Na₂S₂O₃进行原位脱毒，降低抑制物的毒害作用；

对干重＞20%的玉米纤维水解液，发酵前使用732型强酸苯乙烯阳离子交换树脂脱毒，解决了高浓度抑制物存在对菌株的毒害作用。

优选地，步骤（2）发酵的控制条件为30±2 ℃，200 rpm，初始pH4.8-5.0，发酵前6h以最低刻度0.6 L/min通气，其余时间关闭通气；在发酵初始添加消泡剂，后续视发酵情况进行添加。

优选地，所述的消泡剂为：格雷特生物发酵消泡剂GPE。

本发明的另一目的保护采用上述方法转化得到的燃料乙醇，燃料乙醇浓度可达33.35 g/L。

本发明提供了一种兼具多种优势的半同步糖化发酵策略，即利用水解液中抑制物的毒害作用以及发酵菌株的优异性能，对酶解后的水解液仅进行离心（4000 rpm, 10 min）保留上清，不对水解液进行灭菌（高温）处理，使溶解在水解液中的纤维素酶可继续发挥作用，并且降低了操作成本，发酵菌株LF1具有一定的鲁棒性，可以在水解液中保持较优的生长并且不染杂菌。在10%干重比例的水解液中，发酵菌株LF1的生长和葡萄糖代谢较优，但是在木糖利用中后期受水解液中抑制物存在的影响代谢较缓慢，本发明通过在发酵过程中原位添加化学还原剂，解决了抑制物对菌株代谢的抑制作用，明显提升了菌株的发酵性能。为了增加发酵终点乙醇浓度，将原料预处理时的干重比例提升至20%（原料经过干粉碎），使水解液中的葡萄糖和木糖浓度分别提高到了52.13 g/L和37.19 g/L，此时使用（3）中的还原剂脱毒策略已不能改善菌株的发酵性能，证实了还原剂脱毒方法的作用范围局限性。

本发明的有益效果

采用本申请的方案，可使原料的葡萄糖和木糖得率分别达到理论值的90.19%和94.95%，在该水解液中添加Na₂SO₃的基础上进行乙醇发酵，可使发酵周期缩短了12 h，木糖利用速率提升了75%，糖醇转化率由原来0.46 g g^-1提高到了0.48 g g^-1，达到理论值的94.12%。在提升浓度的水解液中（20%干重比例），使用732型强酸苯乙烯阳离子交换树脂脱毒的策略解决了Na₂SO₃脱毒的局限性，在50L发酵罐发酵时菌株的木糖利用速率提升了约67%，几乎在36 h便可结束发酵，乙醇浓度达到了33.35 g/L。

本发明还解决了高糖浓度水解液抑制物对菌株生长代谢的毒害作用，并在50L发酵罐中进行放大实验，使菌株的发酵效率进一步提升，获得了优良的发酵效果。

本发明开发了一种低温低酸的高效解聚技术使原料的糖分释放率保持在高水平并且保持较低的抑制物水平，同时根据不同浓度的水解液，提供了不同的脱毒策略，妥善的解决了水解液中抑制物对菌株发酵的毒害作用，大幅度的提升了发酵效率，并最终通过发酵体积放大及优化形成了玉米纤维原料高效生物转化生产燃料乙醇的整体工艺流程，为下一步中试示范生产奠定了基础。

附图说明

图1 玉米纤维预处理条件优化结果；图1A 不同物理状态原料直接酶解；图1B 不同预处理酸浓度；图1C 不同预处理时间；图1D 不同干物质比例；

图2 玉米纤维酶解条件优化结果；图2A α-淀粉酶；图2B 赛诺纤维素酶；图2C 尤特尔纤维素酶；

图3 不同脱毒策略对玉米纤维水解液（10%干重）发酵性能的影响；未脱毒水解液（图3A）；CaO过中和（图3B）；

图4 不同脱毒策略对玉米纤维水解液（10%干重）发酵性能的影响；还原剂添加时间为12 h（图4A）和18 h（图4B）；

图5 不同脱毒策略对玉米纤维水解液（10%干重）发酵性能的影响；添加时间为18h（图5A）和18 h（图5B）；

图6 不同时间添加5 mM Na₂SO₃对高糖浓度原料水解液发酵性能的影响；图6A 未添加Na₂SO₃；图6B 5 mM Na₂SO₃添加时间分别为12 h和24 h；图6C 5 mM Na₂SO₃添加时间分别36 h和48 h；

图7 不同时间添加10 mM Na₂SO₃对高糖浓度原料水解液发酵性能的影响；图7A 未添加Na₂SO₃；图7B 10 mM Na₂SO₃添加时间分别为12 h和24 h；图7C 10 mM Na₂SO₃添加时间分别36 h和48 h；

图8 不同类型树脂脱毒策略对高糖浓度原料水解液发酵性能的影响；（图8A）732型离子交换树脂脱毒后的高糖水解液发酵结果；（图8B）D301型吸附树脂脱毒后的高糖水解液发酵结果；

图9 高糖浓度原料水解液5 L（图9A）和50 L（图9B）发酵性能测试。

具体实施方式

实施例1 微生物培养基及基础培养条件

（1）酿酒酵母培养基

①酿酒酵母YPD/X培养基

酵母粉和蛋白胨的添浓度分别为10 g/L和20 g/L，并分别与400 g/L的葡萄糖或木糖母液进行分开灭菌，灭菌后将YP中加入计算后的葡萄糖或木糖母液，使葡萄糖或木糖的浓度为20 g/L。YPD/X固体培养基的配制只需再YP灭菌时加入2%（w/v）的琼脂即可。

②预处理液抑菌实验固体培养基

将不同条件预处理液离心(4000 rpm、5 min)，收集上清液备用。分别称取1 g酵母粉、2 g蛋白胨和2 g琼脂于250 mL三角瓶中，进行灭菌（115 ℃、20 min），将预处理上清液置于带棉塞的三角瓶中，100 ℃的水浴15 min，然后自然冷却至室温并过夜，重复上述操作三次获得无菌的预处理上清液。在无菌条件下量取100 mL菌的预处理上清液倒入已灭菌的上述三角瓶中，在微波炉中低火加热溶解培养基固体组分并混匀，冷却后即得预处理液固体培养基。

③发酵水解液YP培养基

将水解液离心(4000 rpm、5 min)，收集上清液，取适量加入1%（w/v）的酵母粉和2%（w/v）的蛋白胨，无需灭菌，直接进行菌株发酵。

（2）酿酒酵母培养条件

本发明提供的菌株是实验室前期工作中获得一株葡萄糖和木糖共利用酿酒酵母菌株LF1（菌株保藏号：CGMCC No.11331）

①菌株活化

挑取发酵菌株单菌落接种到YPX液体培养基，30℃，200 rpm培养24小时，再次转接至新鲜YPX液体培养基二次活化12小时，将活化好的菌株生长测试或发酵。

②摇瓶发酵条件

恒温摇床条件为30℃、200 rpm，于150 mL限氧瓶中装入30 mL发酵液，封口用橡胶塞并插上注射器针头控制限氧条件，接种OD₆₀₀3.5，每菌株作三个平行实验，采用实施例2所述HPLC方法检测糖组分和发酵产物的变化。

③抑菌实验

取适量活化好的菌液到间歇灭菌处理后的预处理液中，调节菌体OD₆₀₀值为1，30℃条件下震荡培养2 h，重新调节菌液OD₆₀₀为1（1 OD₆₀₀约为5×10⁶个细胞/mL），并进行十倍稀释，得到OD₆₀₀为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的梯度菌液，然后吸取100 µL 10^-4和再次稀释一倍后的100 µL 10^-4菌液均匀涂布到预处理液固体培养基中，以糖含量相同的YPDX固体培养基平板为对照，每组作三个平行，置于30 ℃培养箱约培养3天，待菌落长出计数，考察原料预处理液对菌体的抑制效果。

实施例2 玉米纤维组分测定及发酵产物检测

（1）玉米纤维成分测定

①玉米纤维原料中的含水量、纤维素、半纤维素、木质素、脂肪和灰分组分含量参照美国可再生能源实验室（National Renewable Energy Laboratory, NREL）中的方法进行测定和计算，主要计算公式如下：

纤维素（%）= C_G* (1-E) * 87 * 10- 3 * 0.90/ m₀* 100%

半纤维素（%）= (C_G+C_X) * (1-E) * 87 * 10- 3 * 0.88/ m₀* 100%

式中，87：为酸解时体积（mL）；E：为抽出物（%）；C_G和C_X分别为酸解时的葡萄糖和木糖浓度（g/L）；0.90和0.88分别为纤维素和半纤维素转化为六碳糖和五碳糖的系数；m₀：为酸解时称样量

木质素（%）=AIL(%) + ASL(%)

AIL（%）= (m₀- m₁) / m0 * (1-E) * 100%;

ASL（%）= A * 87 * 10- 3/ 30/ m₀* (1-E) * 100%

式中，AIL和ASL分别为：酸不溶木质素和酸溶木质素；m₁：为酸解后所剩固体烘干后质量（g）；A：为酸解上清液在320 mm处吸光值；30：测量波长320 nm下的吸光系数（L g^{- 1}cm^-1）

②粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定。在红外智能消化炉中将原料进行充分消化，再利用凯氏定氮仪测定总含氮量，含氮量乘以系数6.25得到粗蛋白含量。

③淀粉含量采用BOXBIO淀粉含量试剂盒测定，其主要原理以特异性的溶剂除去影响淀粉酶解的物质，然后用特异性溶剂溶出淀粉，最后根据酶解和标准曲线测定淀粉含量。

④原料中的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的可释放总量通过NREL中两步酸解法进行测定，简要过程如下：将经过谁-乙醇抽提后的玉米纤维进行烘干，准确称取0.3 g，首先加入3mL质量分数为72%的H₂SO₄，30 ℃水浴60 min，再加入83 mL蒸馏水在灭菌锅中121 ℃保持60min，冷却后调pH至中性，取上清进行糖含量测定，根据结果计算得出原料中每种单糖的最大含量，计算公式如下：

葡萄糖（g/g）= C_G* V/ 0.3；

木糖（g/g）= C_X* V/ 0.3；

阿拉伯糖（g/g）= C_A* V/ 0.3

C_G、C_X和C_A：分别为两步酸解后液体中的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度（g/L）；V：为反应体系；0.3：为初始称样量

⑤本发明中的赛诺纤维素酶由山东大学微生物技术国家重点实验室刘国栋/曲音波教授课题组赠送，尤特尔纤维素酶由合作企业山东寿光巨能金玉米开发有限公司提供，纤维素酶添加量为10 FPU/g或20 FPU/g干重原料，在50℃，pH 4.8进行酶解。

（2）发酵产物检测

通过高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）测定预处理液、水解液以及发酵过程中的物质浓度。取1 mL样品，高速离心（13000 r/min、5min），取上清液用0.22 µm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪系统Waters e2695测定其成分含量。色谱条件：①葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乙酸和乙醇使用HPX-87H离子排阻色谱柱（Bio-Rad Aminex）进行分析，该色谱柱在45°C下以5 mM H₂SO₄作为流动相，使用Waters 2414 RI示差折光检测器；②糠醛和5-HMF 使用WondaSil C18色谱柱（GL Sciences）在40°C下使用40％甲醇作为流动相，使用Waters 2998 PDA紫外检测器。预处理液中总酚的含量通过福林试剂法检测，以香草醛为标准品，与Folin—Ciocalteu试剂反应，于725 nm检测吸收值。

实施例3 本发明提供的玉米纤维预处理和酶解条件

（1）玉米纤维成分分析

将玉米纤维按照实施例2中所述的测定方法进行成分分析，测定结果如表1所示。

表1 玉米纤维的成分分析

（2）玉米纤维预处理条件优化

根据玉米纤维成分半纤维素成分高木质素低的特性，对其选择了低温115℃进行预处理，对预处理中的其他条件进行单因素实验，ⅠH₂SO₄浓度优化。设置H₂SO₄梯度为0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%（w/v），当酸浓度从0.25%上升到1%，原料的糖释放率趋势先上升再下降，到0.5% H₂SO₄浓度时再增加酸浓度原料的糖释放率不增加反而降低（图1 B），因此，选择0.5%为预处理酸浓度；Ⅱ预处理时间优化。设置时间梯度为90 min、120 min、150 min，随着预处理时间的增加原料的糖释放逐渐增加，到达120 min时，原料的糖分释放最高，相比于90 min时原料的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的糖释放率分别提升了15.45%、17.03%和9.10% ，当再次提升预处理时间到150 min时，原料的糖释放率没有增加的趋势反而部分降低（图1C），因此，选择120 min为预处理时间；Ⅲ原料干重添加比例优化。设置干重添加梯度为10%和15%，在上述获得的优化条件即115 ℃，120 min，0.5% (w/v) H₂SO₄浓度进行实验，当原料的干重比例提升至15%后，原料的糖释放率降低明显，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的释放率分别仅为28.59%、67.00%和55.81%（图1 D），并且在预处理过程中因其流动性极差导致实验操作不便，因此，选择10%干重比例为预处理添加量。经过上述优化条件即原料不粉碎、0.5%(w/v) H₂SO₄浓度、115 ℃、预处理120 min获得的预处理液糖浓度最高，其成分如表2所示，并对预处理优化过程中获得的较优水解液进行抑菌实验，结果显示，在上述条件下的菌株存活率最高（表3），亦表明了该条件下的抑制物成分对菌株的毒害作用最小，后续选择该条件对玉米纤维进行预处理。

表2 玉米纤维预处理液成分分析

表3 不同条件的原料预处理液抑菌实验

酶解条件优化

首先将预处理液进行淀粉酶酶解实验，测定预处理过程中淀粉成分是否水解完全，将预处理液用NaOH调节pH至5.0，分别添加50U/g干重和100U/g干重的中温α-淀粉酶在50℃下酶解，预处理液中并无葡萄糖浓度的变化（图2 A），证实淀粉已在预处理过程中完全水解，后续无需再添加淀粉酶。预处理液呈强酸性，而纤维素酶水解的最适pH为4.8，分别选择NaOH、CaO 两种试剂进行pH的调节，分别添加赛诺和尤特尔两种纤维素酶进行酶解，酶活添加量为10 FPU/g干重，实验证实CaO调节更有益于酶解，且赛诺纤维素酶也更有益于原料糖分的释放（图2 B），此时获得的水解液成分如表4所示。

表4 玉米纤维水解液（10%干重）成分分析

实施例3 本发明提供的不同浓度水解液的脱毒策略选择

（1）脱毒方法

①化学还原剂脱毒

该策略采用原位脱毒方式，在菌株的发酵过程中的不同阶段即延滞期、指数期或平稳期，向发酵中的水解液中分别添加一次5 mM或10 mM的Na₂SO₃或Na₂S₂O₃，即完成脱毒。

②过量碱处理

将完成酶解后的水解液，用CaO调节pH至10.0，在室温下放置1 h，随后用H₂SO₄将pH调回至4.8，即完成脱毒。

③树脂脱毒

732型强酸苯乙烯阳离子交换树脂的活化，取适量体积的树脂用去离子水进行泡洗，洗至水为澄清，随后转入塑料烧杯中，并向烧杯中加入树脂体积4倍的1 M的HCl浸泡12h，水洗至pH为7.0左右，再加入树脂体积4倍的1 M的NaOH浸泡12 h，再次水洗至pH为7.0左右，再加入树脂体积4倍的1 M的HCl浸泡12 h，最后再水洗至pH为7.0左右，即可完成该树脂的活化。D301树脂的活化为在其体积4倍的95%乙醇中进行24 h的浸泡，随后用去离子水浸洗至无乙醇，即可完成该树脂的活化。将两种活化好的树脂分别填装到外径60 mm *长400mm的层析柱中，填充体积为其体积的90%，装入后进行适当摇匀，除去其中的气泡，脱毒时控制下方阀门，使水解液流出速度约为6 mL/min，过柱子后的水解液即是完成脱毒后的水解液，将脱毒后的水解液用CaO调节pH至4.8左右，即完成脱毒。

（2）原位脱毒策略提升玉米纤维水解液（10%干重）发酵性能

将本发明制备的玉米纤维水解液（10%干重），按照实施例（1）中的方法配制成发酵水解液，将活化后的菌株LF1接种进行发酵。在未脱毒的水解液中LF1的木糖代谢受到了明显抑制（图3 A），尤其在木糖利用中后期抑制更为严重，整体木糖速率仅为0.36 g L^-1h^-1。随后采用本发明实施例3中提供的脱毒方法，将发酵过程中的玉米纤维水解液进行原位添加还原剂的方式脱毒，并与常规过量碱脱毒处理的水解液进行对比实验，其他操作条件与上述相同。

采用本发明所述方法，在乙醇发酵过程中添加化学还原剂，可明显使得乙醇发酵过程更高效的进行（图4A、图4B、图5A、图5B），相比于常规的CaO过中和脱毒（图3 B），该方法可以获得更高的乙醇得率和发酵效率，尤其是在12 h（木糖利用阶段中期）添加5 mMNa₂SO₃，木糖利用速率达到了0.63 g L^-1h^-1，提高了75%，且具有更高的乙醇得率，为0.48 gg^-1（CaO过中和脱毒的水解液中仅为0.37 g g^-1），达到了理论值的93.53%，此时乙醇浓度为22.50 g/L。该方法明显提升了菌株在玉米纤维水解液（10%干重）中的适应性，有效缓解了抑制物存在对菌株的毒害作用。

（3）改变脱毒策略提升玉米纤维高糖水解液（20%干重）发酵性能

①高糖浓度水解液制备

预处理前将玉米纤维在鼓风干燥箱中以60 ℃进行烘干，将烘干后的玉米纤维在粉碎机中进行粉碎，约粉碎2 min，并在40目的筛网中过筛，不同批次粉碎的物料中，其过目率均在99%以上，预处理时提升干重添加比例至20%，其他预处理和酶解条件与10%干重比例水解液的制备相同，由于原料干重增加，各糖浓度增加，我们称为高糖浓度水解液，成分如表5所示。将制备的水解液均经4000 rpm离心5 min，得到上清液用于后续的发酵实验。

表5 玉米纤维水解液（20%干重）成分分析

②树脂脱毒提升玉米纤维高糖水解液（20%干重）发酵性能

本发明为了提升发酵终点的乙醇浓度，接近工业上低成本酒精蒸馏的浓度要求4%（w/v），制备了高糖水解液，首先对高糖水解液进行了添加还原剂的方式脱毒，因为水解液各成分浓度升高，木糖利用周期长，因此设置了多个时间点进行Na₂SO₃的添加，分别在12 h、24 h、36 h和48 h添加5 mM或10 mM的Na₂SO₃进行脱毒，实验结果表明，该策略并不能继续对菌株的生长和木糖代谢起到促进作用（图6、7），因其作用范围的限制已不适合该浓度水平的水解液脱毒。

本发明为了解决高糖水解液中高浓度抑制物存在对菌株的毒害作用，提供了一种树脂脱毒的方法，如实施例3中所述树脂脱毒方法，对高糖水解液进行了两种不同类型树脂的脱毒发酵测试对比，经过该方法脱毒后，菌株的发酵性能提升明显（图8），尤其是经过732型强酸苯乙烯阳离子交换树脂脱毒后（图8A），提升幅度最大，几乎在30 h便可结束发酵，木糖利用速率达到了1.10 g L^-1h^-1，实现了较大的突破，与未脱毒的高糖水解液发酵相比提升了124.49%，乙醇浓度达到了33.35 g/L，该方法有效的解决了高浓度抑制物存在的毒害作用，提升了发酵效率，为工业化生产发酵高糖浓度水解液提供了可能。

实施例4 玉米纤维高糖水解液发酵规模放大

（1）发酵罐发酵条件

发酵条件为30 ℃，200 rpm，初始pH4.8，接种OD₆₀₀3.5，发酵前6 h以最低刻度0.6L/min通气，其余时间关闭通气；发酵时发酵罐填充体积为总体积的75%；在发酵初始添加适量消泡剂，后续视发酵情况进行添加；发酵过程中未调节pH。

（2）高糖水解液的制备

高糖水解液的制备条件如实施例3中所述相同，仅改变反应仪器，于15-L反应釜中115 ℃、120 min进行制备。

（3）玉米纤维高糖水解液发酵放大

本发明为了评估玉米纤维水解液发酵产乙醇的工业应用潜力，进行了“30 mL-5L-50 L”发酵规模的放大测试，高糖水解液的制备按照本实施例（2）中所述方法并经过实施例3中732型树脂脱毒方法获得。在5 L发酵罐中进行发酵时，菌株LF1依然表现出良好的生长和较高的糖代谢速率，发酵罐中严格的发酵条件控制进一步提高了菌株发酵性能，36 h即可消耗完49.87 g/L葡萄糖和32.97 g/L木糖，菌株的乙醇得率为0.46 g g^-1，达到理论值的90%以上，乙醇浓度也达到37.20 g/L（图9A）。随后，采用相同的发酵条件对高糖玉米纤维水解液进行了50 L规模的发酵性能测试，结果显示发酵体积的进一步放大并没有影响菌株的发酵性能，菌株的糖醇转化率为0.47 g g^-1，达到了理论值的92.17%（图9B），处于较高水平。实验证实了本发明提供的50-L发酵规模高效乙醇发酵的集成工艺，具有极高的工业生产的潜力，相关实验数据也为中试放大提供了技术支持。

Claims (6)

1.一种生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）玉米纤维发酵水解液的制备，采用稀酸预处理、纤维素酶酶解，离心除去固态物质，补充酵母粉、蛋白胨，即得；

（2）发酵，选择C6/C5共发酵酵母LF1，与步骤（1）的玉米纤维水解液进行发酵；所述的发酵酵母LF1为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，保藏编号为CGMCC No .11331；

步骤（2）的具体过程为：对步骤（1）获得的水解液进行离心，保留上清液，补加酵母粉和蛋白胨配制成发酵液，并按照OD₆₀₀ 3.5±0.2接种发酵菌株LF1，进行发酵。

2.根据权利要求1所述的生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，其特征在于，还包括将水解液规模放大发酵，生产高浓度乙醇。

3.根据权利要求1所述的生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，其特征在于，步骤（1）稀酸预处理条件为10%干重玉米纤维、0.5%-1% (w/v) H₂SO₄、115±2℃、120±5 min；步骤（1）纤维素酶酶解条件为：使用CaO或Ca(OH)₂调节pH至4.8-5.0，添加10 FPU/g干重的赛诺纤维素酶进行酶解。

4.根据权利要求1-3任一所述的生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，其特征在于，不同浓度的玉米纤维水解液采用不同的脱毒策略，提升发酵效率；

对干重10-20%的玉米纤维水解液，在发酵过程12~18 h添加5~10 mM的Na₂SO₃或Na₂S₂O₃进行原位脱毒；

对干重＞20%的玉米纤维水解液，发酵前使用732型强酸苯乙烯阳离子交换树脂脱毒。

5.根据权利要求1所述的生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，其特征在于，步骤（2）发酵的控制条件为30±2 ℃，200 rpm，初始pH4.8-5.0，发酵前6 h以最低刻度0.6 L/min通气，其余时间关闭通气；在发酵初始添加消泡剂，后续视发酵情况进行添加。

6.根据权利要求6所述的生物转化玉米纤维生产燃料乙醇的方法，其特征在于，所述的消泡剂为：格雷特生物发酵消泡剂GPE。

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