CN102660584A - 一种利用海洋脱硫酸基卡拉胶进行乙醇转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种海洋脱硫酸基卡拉胶的乙醇转化方法。本发明提供的乙醇发酵原料蕴藏丰富，成本较低，通过该方法为充分酶解与转化为乙醇发酵提供可靠、稳定的可酵解性糖，降解产物对后期乙醇转化无抑制作用，相比传统的乙醇转化方法效率有显著提高。该方法首先以醇解改性后得到的脱硫酸基卡拉胶溶液为底物，加水制备成一定浓度的底物溶液，并调节体系至适当的pH值，控制体系温度，加入果胶酶于50℃条件下制备可酵解性糖；反应结束将得到的酶解糖化液浓缩至一定的糖化液浓度，并调节体系至适当的pH值，在补充必要性无机盐后向反应液中接入酵母菌，控制体系温度，进行厌氧发酵制备乙醇。通过上述工艺，最终海洋脱硫酸基卡拉胶经糖化发酵实现乙醇转化。

Description

一种利用海洋脱硫酸基卡拉胶进行乙醇转化方法
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体是涉及一种海洋脱硫酸基卡拉胶的乙醇转化方法。 
背景技术
随着世界经济的迅猛发展，化石能源的枯竭及环境污染问题日益凸显，实施能源多元化及开发新型可再生能源迫在眉睫。生物乙醇由于其可再生性和环境友好性等特点，受到了各个国家的空前关注，并被认为是可通过技术转变为高品质的现代能源之一。现行生物乙醇主要是利用农作物(玉米、甘蔗、薯类、植物纤维素秸秆、农业加工副产品及灌木能源林纤维素)作为原料进行生产，很大程度上影响了世界人口的粮食安全。为摆脱与人争粮、争地的尴尬局面，利用海洋藻类这一潜在的新型生物质进行乙醇转化，将是未来乙醇转化发展的新方向。 
海洋植物是海洋世界的能源库，而海洋藻类是海洋植物的主体，是一种分布极为广泛的海洋生物，可将水、光和二氧化碳转变成为藻类富含生产生物能源的基本原料——碳水化合物。海洋占地球面积约70％，海洋藻类资源极为丰富，蓝藻、红藻、褐藻、绿藻等一般经济藻类可为生物能源产业化提供取之不尽、用之不竭的物质来源。其中，卡拉胶是海洋三大藻类之一红藻的提取物，属于聚阴离子的细胞壁多糖，是一种由半乳糖及半乳糖衍生物构成的硫酸半乳聚糖。目前，卡拉胶主要应用于医药行业，通过控制酸的浓度、时间和温度获得不同分子量大小的降解产物，被用于抗病毒活性方面。例如，牟海津等通过控制不同pH值和温度，用酸或酶降解κ-卡拉胶，制备了不同分子量的κ-卡拉四糖、六糖。但鉴于卡拉胶降解的研究成果仅局限于寡糖制备而非得到可发酵性还原糖，故研究至今，海洋藻类多糖(卡拉胶多糖)为原料开发生物乙醇的方法尚未有报道，因此以海洋生物质能的研究开发将具有较为广阔的前景。 
本发明涉及经化学修饰法得到的海洋脱硫酸基卡拉胶生产乙醇的技术，通过适当的海洋多糖专一性降解酶系的定向酶解，得到可被酵母利用进行乙醇转化的可发酵性还原糖。相比传统的乙醇转化方法，该方法实现了阴离子型海洋藻类多糖向可酵解性糖基的转化，为今后进行乙醇转化，提供了一种新型的海洋生物质来源。 
发明内容
本发明的目的是提供一种利用化学改性的海洋脱硫酸基卡拉胶进行乙醇转化的方法。 
该方法是以海洋硫酸多糖——卡拉胶为原料，利用化学改性制备脱硫酸基中性卡拉胶多糖，经适当的糖化及发酵工艺进行乙醇转化的方法。该方法主要体现在：富含硫酸基的卡拉胶多糖经基团改性得到中性脱硫酸基卡拉胶，可进一步通过酶解进行糖链降解及乙醇发酵。其特征在于选择基团改性后的中性糖链，调节体系至适当的pH值，加入酶系进行糖化酶解；经过序列降解后，将糖化液调制适当的底物浓度，并调节体系至适当的pH值，补充必须的营养盐。控制体系温度，然后接种高温酿酒酵母，以达到短时、高 效地实现对脱硫酸基卡拉胶的乙醇转化。 
为了实现本发明的目的，本发明提供的海洋脱硫酸基卡拉胶的乙醇转化方法，具体步骤如下： 
(1)海洋脱硫酸基卡拉胶的制备：利用改进的醇解法对卡拉胶进行硫酸基脱除，经反应后得到总糖产率为90％、脱硫酸基效果达92％的底物样品； 
(2)将步骤(1)所得的样品液投入到酶解装置，并加水制成一定浓度的底物溶液至0.1-5％； 
(3)向步骤(2)中的酶解体系添加适量的酸或碱，调节体系pH至3.5-6.0； 
(4)向步骤(3)中添加一定量的酶制剂溶液； 
(5)控制步骤(4)中的体系温度，糖化酶解48-72小时； 
(6)酶解液的预处理：对步骤(4)得到的酶解糖化液进行浓缩，至还原糖浓度为1-10％糖化液，并投入到发酵装置；
(7)将步骤(6)所得的酶解糖化液进行高效液相色谱分析； 
(8)高温酿酒酵母菌种子液的制备：向已灭菌的液体种子培养基中接取一环高温酿酒酵母菌，30℃振荡培养24小时即得到高温酿酒酵母菌种子液； 
(9)向步骤(6)中的体系添加适量的酸或碱，调节体系pH至4.0-5.5； 
(10)向步骤(9)中的体系添加营养盐； 
(11)向步骤(10)中的体系添加一定体积的步骤(8)所得的高温酿酒酵母菌种子液； 
(12)控制步骤(11)中的发酵体系温度，厌氧发酵24-72小时； 
所述的用于调节体系pH的酸可以是硫酸、盐酸或磷酸；碱可以是氢氧化钾或氢氧化钠。 
所述的降解酶溶液为0.1-1mL果胶酶酶液，分别按0.1-100u/mg底物加入至体系。 
所述的果胶酶购自sigma公司。 
所述的营养盐，组成分别为：向每1L反应液中添加的硫酸铵1-10g，七水合硫酸镁0.1-1.0g，磷酸氢二钾0.5-5g。 
所述的高温酿酒酵母菌购自于市场上常见的安琪高温酿酒酵母。 
所述的发酵体系温度为32-45℃。 
本发明的特点是：(1)该反应体系采用经改性脱硫酸基的卡拉胶糖链为原料，制备出可酵解性糖基，拓宽了燃料乙醇的生物质的来源。(2)该反应体系经过底物专一性的选择性优化，得到最优的针对该种原料的高效卡拉胶糖链降解酶系。实现的对底物的专一性序列降解，并使得体系酶解产生的可酵解性糖基能够及时并充分的被酵母菌所利用，从而使得酶解液维持较高的酶切速率。(3)该方法兼具有操作快速、方法简便、生产成本低的特点。 
附图说明
图1：标准糖液相色谱分析结果。 
图2：酶解后的可发酵性还原糖组分分析结果。 
具体实施方式
(1)底物溶液的配制：对卡拉胶多糖进行化学改性获得的脱硫酸基卡拉胶作为底物样品，60℃旋蒸30min，3000r/min离心10min去除沉淀物，得到样品溶液；通过苯酚硫酸法测定多糖溶液的浓度，并将样品溶液投入到酶解装置中，加水配制成底物浓度为0.5％的脱硫酸基卡拉胶溶液； 
(2)向脱硫酸基卡拉胶溶液中添加0.2M HCl或0.2M NaCl溶液，调节底物溶液体系的pH至4.0； 
(3)酶解体系：向底物溶液中添加40u/mg底物的果胶酶溶液，振荡摇匀，控制温度至50℃，水浴72h进行糖化酶解，还原糖得率达70％； 
具体计算公式： 
Figure BSA00000701667400031
(4)酶解体系的后处理：将糖化酶解后得到的糖化液，60℃旋蒸30min，3000r/min离心10min，通过DNS法测定浓缩糖化液的还原糖，浓缩终点至还原糖为2％的糖化液，并投入到发酵装置中。 
(5)将步骤(4)所得的糖化液进行高效液相色谱分析，得出酶解液的组分主要为半乳糖； 
(6)高温酿酒酵母菌种子液的制备：配置液体种子培养基。马铃薯去皮，取100g切成块煮沸15min，然后用纱布过滤，再加入10g蔗糖搅拌混匀后补水制500ml，分装三角瓶封口至于115℃，30min灭菌。灭菌后用接种环向液体种子培养基中接取一环高温酿酒酵母菌，30℃振荡培养24小时即得到高温酿酒酵母菌种子液； 
(7)向发酵体系中添加0.2MNaOH溶液，调节体系的pH至4.5； 
(8)向发酵体系中添加营养盐，0.04％的七水硫酸镁，0.9％的硫酸铵，0.05％的磷酸氢二钾； 
(9)向发酵体系中接种10％的高温酿酒酵母菌种子液； 
(10)控制恒定反应体系温度36℃，发酵72小时，乙醇得率为0.7％； 
(11)中性海藻多糖经糖化发酵实现乙醇转化率为0.25g/g(海洋脱硫酸基卡拉胶)。 
具体计算公式： 
Figure BSA00000701667400032
如图1所示，标准糖液相色谱分析结果。 
由图中可知，标准品包括甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、内标乳糖、半乳糖和木糖。如2所示，酶解后的可发酵性还原糖组分分析结果。与图1的标准品比对，图2中的样品主要由半乳糖组成，百分量为65.15％； 还包括其他组分：甘露糖为5.15％，木糖为5.60％，鼠李糖为8.80％，葡萄糖为15.31％。 
在大量试验的基础上，并通过响应面分析，优化酶解制备可酵解性糖的工艺参数为：果胶酶加酶量为40u/mg底物，酶解时间72h、底物浓度0.5％、pH4.0、温度为50℃，还原糖得率为70％。海洋脱硫酸基卡拉胶糖化液进一步乙醇发酵的条件为：底物浓度2％，pH4.5，发酵时间72h，接种量10％，温度36℃，乙醇得率为0.25g/g卡拉胶。利用该反应体系实现了利用海洋藻类多糖卡拉胶糖链为原料，制备可酵解性糖基，并通过优化酶解发酵参数，拓宽了生物乙醇的转化途径。 

Claims (2)

1.一种利用海洋脱硫酸基卡拉胶进行乙醇转化的方法，其特征在于：以卡拉胶为原料，利用经甲醇解改性后得到的脱硫酸基卡拉胶糖链，经过旋蒸、低速离心、加水制备成0.1-10％(质量体积比)的海洋脱硫酸基卡拉胶底物溶液，通过加HCl或NaOH调节酶解糖化体系的pH值至3.5-6.0的范围，并向该体系加入0.1-100u/mg底物的果胶酶溶液，将该糖链酶解体系进行振荡摇匀，控制酶解温度至40-60℃，水浴12-72h进行糖化酶解；将得到的酶解糖化液浓缩至还原糖浓度为1-10％糖化液，调节发酵体系的pH值至4.0-6.0的范围，并向体系中补充必须的营养盐：0.01-0.1％的七水硫酸镁，0.1-2.0％的硫酸铵，0.01-1％的磷酸氢二钾；然后向体系中接入其体积百分比为2-20％的高温酿酒酵母菌种子液，将得到的该发酵体系，控制温度为32-45℃，发酵周期为12-72h，得乙醇发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种利用海洋脱硫酸基卡拉胶进行乙醇转化的方法，其特征在于：所述的酶解体系，脱硫酸基卡拉胶底物浓度为0.5％，酶解pH为4.0，果胶酶加酶量为40u/mg底物，酶解温度50℃；所述的发酵体系为，发酵液还原糖底物浓度为2％，pH为4.5，发酵温度为42℃。 
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