CN101932715A - 使用海藻生产生物燃料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生产生物燃料的方法，更具体地，包括以下步骤的生产生物燃料的方法：通过用水解酶和/或水解催化剂处理海藻或从海藻中提取出来的多糖来生成单糖；和使用微生物发酵该单糖来生产生物燃料。本发明的生产生物燃料的方法解决了原料供应的问题，因为其使用海藻作为生物质的原料，并通过排除使用木基原料的常规方法所需的木质素消除过程降低了生产成本，产生了经济和环境优势。
Description
发明领域
本发明涉及一种生产生物燃料的方法，更确切地说，一种使用海藻生产生物燃料的方法。
相关领域的描述
一般将生物燃料定义为通过直接燃烧、乙醇发酵和甲烷发酵等从生物质获得的能量。生物质，生物燃料的原料，尤其是对于生物醇，可以归类为糖基(甘蔗、甜菜等)、淀粉基(玉米、马铃薯、红薯等)和木基(废木材、稻草、废纸等)。糖基生物质可以在比较简单的预处理过程后容易地并且直接地转化成生物乙醇。而淀粉-或木-基生物质需要适当的预处理过程和糖化过程来产生生物乙醇。废木材，一种城市废物，或森林周围分散的森林副产物，也可以用作木基生物质。此外，因为它们不具有作为食物的可用性，可以稳定地保证原料需求。然而，对于待用作生物燃料的木基生物质，必须进行消除木质素的预处理，这增加了生产成本，并且由于纤维素的结晶氢键键合结构，糖化效率变得非常低。
对于在运输上经济可行的可替换燃料，生物燃料的价格必须与汽油相竞争。通常，原料与加工的成本比很大程度上取决于所用生物质的种类。例如，在糖基，如甘蔗和甜菜的情况中，原料与加工的成本比大约为75∶25。同时，在淀粉-基，如玉米、马铃薯和木薯的情况中，比例为约50∶50，在木基的情况中，比例大约为25∶75。
迄今为止用于生物乙醇生产的最常用生物质是糖基和淀粉基的。然而，它们还可以用作食物，因此，如果食物需求快速增长，这些原料需求应当会受到影响，使得生产成本在经济上是不可行的。此外，发现作物如玉米的栽培需要大量农药和氮肥，导致环境问题，如土壤 侵蚀和污染。
全世界的生物乙醇生产在2006年达到大约51.3×109升。使用糖基的生物燃料的生产，尤其是生物乙醇，大约是18.7×109升(在2006年)，并且主要的生产国家是巴西、印度和台湾，特别是巴西领导着生产(17.8×109升)(Global Bioenergy Partnership(GBEP)，2006)。巴西使用大量的甘蔗作为原料积极地生产用于运输的生物乙醇，并且因此提供了各种类型的称为酒精-汽油混合燃料的生物乙醇混合汽油。在2003年，用可变的生物乙醇/汽油比例运行的FFV(灵活燃料型汽车)开始销售，并且在2005年5月，FFV销售占据全部汽车销售的大约50％。
全世界使用玉米的生物乙醇生产大约是19.8×109升(在2006年)。并且主要的生产国家是美国、欧洲和中国，并且特别地，美国是领导国家，其生产18.5×109升生物乙醇(参见表1)。就在石油危机打击该国家后，美国在1978年颁布了能源税法，通过将联邦税降低4$/加仑，将这种含有生物乙醇的石油供应增加高达10％。美国通过利用广阔的耕地和大量的原料玉米积极地生产生物乙醇，作为有助于脱离对石油依赖的新&可再生发展的努力。作为可替换能量的生物乙醇生产的努力已经是美国的主要策略之一，尤其是，玉米基生物乙醇生产政策的发展变得越来越强大和越来越广泛。
在使用木基生物质生产生物燃料中不存在可预测的工业趋势，因为它离商业化仍然很远。但是，加拿大的Iogen已经在积极地研发使用木基生物质来生产生物燃料的技术，并且美国政府将从2007年的预算中持续增加1.5×109美元的资金，直至2012年，以使用下一代生物质如农业废物和木质纤维原料来促进生物乙醇生产技术的利用，使得能够用生物乙醇替代30％的总运输燃料。
[表1]
根据原料的生物乙醇的经济价值的比较(源自DOE、EPA、Worldwatch Institute)
| 玉米基乙醇 | 糖基乙醇 | 木质纤维乙醇 | |
| 全世界产量(l) | 19.8×109(2006) | 18.7×109(2006) | 0 |
| 产量/单位面积 (l/ha) | 2,500 | 5,700-7,600 | 5,500(柳枝稷) |
| 生产成本($/l) (2007) | 0.29-0.33 | 0.19-0.23 | R&D阶段 |
| 零售价格($/l) | 汽油：0.80 E85∶0.69 E85∶0.981) | E25∶1.30 E100∶0.77 E100∶1.03 | R&D阶段 |
| 能量平衡2) | 1∶1.3 | 1∶8 | 1∶2-36(脱离生产 方法) |
| 温室气体排放(g/l) (汽油：2437.8) | 1935.9(减少 22％) | 1075.5(减少 56％) | 227.05(减少 91％) |
1)对应于1升汽油的能量的成本
2)生物燃料产量与用于生物燃料生产的供应的化石燃料相比
同时，海藻分为大藻类和微藻类。大藻类包括红藻、褐藻和绿藻，而微藻类包括小球藻和螺旋藻等。全世界每年海藻产量大约为14×106吨，并预期在2020年增加超过22×106吨。该产量对应于约23％的海洋养殖总产量。特别地，褐藻，如裙带菜和海带，以及红藻，如紫菜、石花菜和sea string占至少90％的总海藻产量。韩国的海藻产量目前达到大约500,000吨/年，这在90年代中期略有下降(大约700,000吨)，但是养殖的总面积在90年代中期从60,000ha增至70,000ha。
与其他类型的陆地生物质相比，海藻生长非常快(在亚热带地区可以收获4-6次/年)，并且易于使用广阔的海洋耕地来养殖，而不需要使用高价的材料，如灌溉水、陆地、肥料等。使用海藻可以采用简 单的生物燃料生产方法，因为其不含有必须要消除的木质素。此外，海藻每年的CO2吸收能力的量为36.7吨/ha，这高于木基的5-7倍。因此，如果使用E20(含有20％生物乙醇的汽油)，每年的温室其他减少率将大约是27％，如果将其转化成货币价值，这将减少大约300×109韩元的碳税(表2)
[表2]
陆地植物和海洋植物的特点
因为海藻主要用于精细化工和医疗材料中，如电泳试剂、肥料、乳化剂、抗癌剂等，或用于健康食品中，作为食品或药物，但迄今为止还没有关于研发海藻作为生物质用于生物燃料生产的报道或研究。
发明概述
为了克服常规生物燃料生产方法中的问题，设计并应用本发明。确切地，本发明的目的是提供使用海洋生物质作为新原料来生产生物燃料的方法，以通过使用海藻替代常规生物质如糖-、淀粉-或木-基原料来解决原料需求和供应的不稳定性/不平衡以及低糖化效率的问题。
优选实施方案的详述
本发明使用海藻生产生物燃料的方法包括以下步骤：使用水解酶和/或水解催化剂处理海藻或从海藻中提取出来的多糖来产生单糖；使用微生物来发酵单糖。
在本发明中，生物燃料包括C1-C4醇或C2-C4酮，并且优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或丙酮，但不限于此。在此的多糖包括琼脂、淀粉、纤维蛋白、卡拉胶、藻酸等，但不限于此。
本发明生产生物燃料的方法中所用的海藻没有限制，并且可以使用选自大藻类和微藻类的任何一种藻。大藻类包括红藻、褐藻和绿藻，而微藻类包括小球藻和螺旋藻等。红藻例举石花菜(Gelidiumamansii)、紫菜、Cottonii、Grateloupia lanceolata、圆紫菜(Porphyrasuborbiculata)、鸡毛藻(Pterocladia tenuis)、Acanthopeltis japonica、鹿角海萝(Gloiopeltis tenax)、真江篱(Gracilaria verrucosa)、角叉菜(Chondrus ocelatus)、厚膜藻(Pachymeniopsis elliptica)、长枝沙菜(Hypnea charoides)、三叉仙菜(Ceramium kondoi)、波登仙菜(Ceramium boydenii)、线形杉藻(Gigartina tenella)、钩凝草(Campylaephora hypnaeoides)、繁枝蜈蚣藻(Grateloupia filicina)等，但不限于此。在这些中间，优选石花菜。在红藻中，石花菜具有最多的品种并且呈现出高生长率。其含有大约15-25％的纤维，一种纤维素成分，和大约50-70％的琼脂，其主要由半乳聚糖组成，并另外含有低于15％的蛋白质和低于7％的脂质，基于总的干重。褐藻例举裙带菜(Undaria pinnatifida)、海带(Laminaria japonica)、Analipusjaponicus、长松藻(Chordaria flagelliformis)、铁钉菜(Ishigeokamurai)、Scytosiphon lomentaria、鹅肠菜(Endarachnebinghamiae)、Ecklonia cava、Ecklonia stolonifera、Eisenia bicyclis、Costaria costata、Sargassum fulvellum、铜藻(Sargassum horneri)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、羊栖菜(Hitzikia fusiformis)等，但不限于此。褐藻是藻类家族中的多细胞生物体并且得到充分分化。 绿藻例举石莼(ulva lactuca)、水绵属、浒苔属、刺松藻(Codiumfragile)、Codium minus、Caulerpa okamurai、Nostoc commune等，但不限于此。绿藻含有叶绿素，使得它们通过光合作用产生淀粉基。对于褐藻和绿藻的成分，褐藻含有大约30-40％的藻酸和5-6％的纤维蛋白，而绿藻含有大约40-50％的淀粉和低于5％的纤维蛋白。
琼脂含有半乳聚糖，其由作为主要成分的半乳糖聚合物组成。半乳聚糖通过适当的解聚作用可以转化成单糖，如半乳糖和3，6-脱水半乳糖。纤维蛋白由纤维素组成，其占据大约15-25％的石花菜总成分。使用适当的酶或酸催化剂，通过糖化，纤维素转化成葡萄糖(一种单糖)。半乳糖和葡萄糖可以用作生物燃料的底物，其通过发酵可以转化成生物燃料。
通常将淀粉称为糊精，其是通过光合作用在植物的叶绿体中合成并存储在其中的碳水化合物。淀粉是由葡萄糖组成的多糖，使用适当的酶或酸催化剂，通过糖化，其可以转化成葡萄糖(一种单糖)。
从海藻提取多糖如琼脂、纤维蛋白、淀粉、卡拉胶、藻酸等的方法不受限制，并且可以接受本领域技术人员已知的任何一种方法。在本发明的优选实施方案中，将海藻在碱水溶液中浸泡一会儿，用水清洗，然后浸泡在含有酸试剂的提取缓冲液中，接着从其提取琼脂、卡拉胶和藻酸。然后，收集剩余的纤维蛋白和淀粉。提取温度不受限制，但优选80-150℃。在此所用的酸试剂选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4(高氯酸)、H3PO4(磷酸)、PTSA(对-甲苯磺酸)和常用的固体酸，但不限于此。碱水溶液选自氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙和氨水溶液，但不限于此。
通过用适当的水解酶和/或水解催化剂处理这些多糖，通过多糖如琼脂、淀粉、纤维蛋白、卡拉胶和藻酸的糖化可以获得单糖。在此的单糖是半乳糖、3，6-脱水半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、鼠李糖、木糖和甘露糖等，但不限于此。
在此的糖化过程可以是直接糖化或间接糖化。在下文中，将详细描述这两种糖化方法和使用由此获得的水解产物发酵生产生物燃料的 方法。
首先是间接糖化的实例，其使用琼脂作为起始原料。琼脂含有半乳聚糖(半乳糖聚合物)作为主要成分。半乳聚糖转化成单糖，如半乳糖和3，6-脱水半乳糖，其可以通过适当的发酵过程来发酵。同时，用于糖化的方法是酸水解或酶水解。酸水解是使用酸水解催化剂将半乳聚糖转化成低分子的方法。在此的催化剂选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用的固体酸。可以调节所用酸的浓度以及温度和反应时间来最大化半乳糖的生产效率，并且同时优选没有过度水解新产生的半乳糖。使用酶糖化琼脂的方法没有和酸水解一样有效，但是一旦选择了最佳的半乳糖苷酶组，可以提高转化产量。能够水解半乳聚糖的酶是β-琼脂水解酶或β-半乳糖苷酶，但不限于此。β-琼脂水解酶可以获自大西洋假单胞菌(Pseudomonas atlantica)或大肠杆菌，而β-半乳糖苷酶可以获自米曲霉(Aspergillus oryzae)或牛的睾丸。在本发明的优选实施方案中，对于琼脂，使用0.05-30％浓度的水解催化剂，如H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4或PTSA，通过在60-200℃进行水解0-6小时，从琼脂获得单糖。
在此是使用纤维蛋白作为起始原料的另一种间接糖化。纤维由纤维素组成，其可以通过使用水解酶和/或酸水解催化剂的水解转化成葡萄糖。已知大约有52种不同的商业酶用于水解纤维素，并且在这些中，优选商业的β-半乳糖苷酶(生长株：海栖热袍菌(Thermotogamaritima)和内-1，4-β-葡聚糖酶(生产株：黑曲霉(Aspergillus niger)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)，但不限于此。在此的催化剂可以选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用的固体酸。可以调节所用酸的浓度以及温度和反应时间来最大化葡萄糖的生产效率，并且同时优选没有过度水解新产生的葡萄糖。在本发明的优选实施方案，对于纤维，使用0.05-50％浓度的水 解催化剂，如H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4或PTSA，通过在80-300℃进行水解0-6小时，从纤维获得单糖。在本发明的另一个优选实施方案中，通过水解酶介导的反应0-144小时从纤维蛋白获得单糖。
间接糖化的另一个实例是使用淀粉作为起始原料。淀粉由葡萄糖组成，因此可以使用水解酶和/或酸水解催化剂通过水解容易地转化成葡萄糖。水解淀粉的商业酶例举淀粉酶，但不限于此。淀粉酶是水解多糖的酶，其主要作用于由α-连接的葡萄糖组成的多糖，如糊精(淀粉酶和支链淀粉)或糖原。根据工作原理，将酶分成三类，如α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡糖淀粉酶。可以产生淀粉酶的微生物例举米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉、米根霉(Rhizopus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，但不限于此。能够水解淀粉的催化剂选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用固体酸。可以调节所用酸的浓度以及温度和反应时间来最大化葡萄糖的生产效率，并且同时优选没有过度水解新产生的葡萄糖。
同时，直接糖化包括水解直接来自作为起始原料的含有纤维蛋白和/或琼脂和卡拉胶的海藻或含有淀粉和/或藻酸和纤维的海藻的程序。当时，可以使用酶水解或酸水解。对于酶水解，重要的是选择合适的酶用于有效的水解，因为海藻的主要底物是半乳聚糖和纤维蛋白；或卡拉胶和纤维蛋白；或藻酸和纤维；或淀粉和纤维蛋白，并且将该成分转化成葡萄糖的酶机理可能不同于将原料转化成半乳糖和3，6-脱水半乳糖的酶机理。可以同时使用两种或多种酶。例如，绿藻含有两种不同的多糖，如淀粉和纤维蛋白，使得优选使用含有能够水解淀粉的一种酶和能够水解纤维的另一种酶的酶组。对于酸水解，酸水解催化剂不受限制并且可以使用如上所述的间接糖化中所用的任何水解催化剂。可以调节所用酸的浓度以及温度和反应时间来最大化葡萄糖和 半乳糖的生产效率，并且同时重要的是没有过度水解新产生的单糖。对于使用原始海藻作为起始原料的糖化，优选将海藻清洗以除去杂质，然后通过热空气或天然空气干燥来彻底干燥。通过使用生料磨将干燥的海藻粉碎，以获得细粉。在本发明的优选实施方案中，对于海藻，使用0.05-50％浓度的水解催化剂，如H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4或PTSA，通过在60-300℃进行水解0-6小时，从原始海藻获得单糖。在本发明的另一个优选实施方案中，通过多步糖化从原始海藻中获得单糖，其中对于海藻，使用0.05-50％浓度的选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用固体酸的水解催化剂在60-300℃进行0-6小时的第一次水解，然后在如上的相同条件下用剩余的纤维或淀粉进行第二次和第三次糖化。
可以使用用于生物燃料发酵的微生物如酵母将含有所产生的半乳糖、3，6-脱水半乳糖、葡萄糖或其糖混合物的水解产物转化成生物-乙醇。可以用于本发明中的用于发酵的酵母是丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostriduim aurantibutylicum)和假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)等，但不限于此，并且它们优选用于丁醇或丙酮发酵。还可以使用酵母，如酿酒酵母(saccharomycesserevisiae)、胃八叠菌(Sarcina ventriculi)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、Zygomomonas mobilis、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)IMB3和卡斯特酒香酵母(Brettanomyces custersii)等，并且这些酵母特别优选用于乙醇发酵。
在许多生物燃料中，生物丁醇具有与汽油相似的特征，其满足能量密度、挥发性、高辛烷值和低杂质率等。含有约10％生物丁醇的混合燃料证明了与汽油相似的能力。并且，生物丁醇的能量密度非常接近无铅汽油的。与生物-乙醇不同，生物-丁醇甚至在水存在下也没有相分离，并且具有低氧含量，提供了高浓度的生物-丁醇混合物，这有助于高浓度的生物-丁醇与汽油的结合。
附图简述
图1是水解装置的示意图。(a)间歇反应器，(b)取样气门，(c)压力计，(d)氮气调节器，(e)氮气弹，(f)控制箱，(g)氮储气瓶。
图2是显示琼脂糖结合结构的化学式。
图3是显示使用琼脂作为底物时反应温度对半乳糖产量影响的图。实验条件：底物10g，1％H2SO4 400ml 30分钟。
图4是显示使用琼脂作为底物时取样温度对半乳糖产量影响的图。实验条件：底物10g，在达到相应温度点时1％H2SO4 400ml。
图5是显示使用纤维素作为底物时H2SO4浓度对葡萄糖产量影响的图。实验条件：底物20g，200℃。
图6是显示使用石花菜作为底物时反应温度和反应时间对单糖产量影响的图。(A)葡萄糖产量，(B)半乳糖产量，(C)葡萄糖+半乳糖产量。实验条件：底物22g，1％H2SO4 400ml。
图7是显示使用石花菜作为底物时反应温度和反应时间对单糖产量影响的图。(A)葡萄糖产量，(B)半乳糖产量，(C)葡萄糖+半乳糖产量。实验条件：底物40g，1％H2SO4 400ml。
图8是显示使用石花菜作为底物时反应温度和反应时间对单糖产量影响的图。(A)葡萄糖产量，(B)半乳糖产量，(C)葡萄糖+半乳糖产量。实验条件：底物60g，1％H2SO4 400ml。
图9是使用石花菜作为底物时S/L比例对半乳糖产量影响的图。实验条件：1％H2SO4 400ml，120℃，4h。
图10时显示使用石花菜作为底物时H2SO4浓度对单糖产量影响的图。(A)葡萄糖产量，(B)半乳糖产量，(C)葡萄糖+半乳糖产量。实验条件：底物60g，150℃，4h。
图11是显示使用石花菜作为底物时酸类型对单糖产量影响的图。(A)葡萄糖产量，(B)半乳糖产量，(C)葡萄糖+半乳糖产量。实验条件：底物7.5g，1％H2SO4，200ml，121℃，15分钟。
图12是显示使用石花菜作为底物时水解数目对单糖产量影响的图。实验条件：1％H2SO4，121℃，15分钟。
图13是显示在各种葡萄糖浓度下酿酒酵母生长曲线的图。(A)1.0％，(B)2.0％，(C)5.0％。
图14是显示在各种半乳糖浓度下酿酒酵母生长曲线的图。(A)1.0％，(B)2.0％，(C)5.0％。
图15是显示在各种葡萄糖浓度下卡斯酒香酵母生长曲线的图。(A)1.0％，(B)2.0％，(C)5.0％。
图16是显示在各种半乳糖浓度下卡斯酒香酵母生长曲线的图。(A)1.0％，(B)2.0％，(C)5.0％。
图17是显示使用混合糖通过酿酒酵母的乙醇生产的图。
图18是显示使用混合糖通过卡斯酒香酵母的乙醇生产的图。
图19是显示使用水解产物通过酿酒酵母的乙醇生产的图。
图20是显示使用水解产物通过卡斯酒香酵母的乙醇生产的图。
实施例
如以下实施例中所示的，说明了本发明的实际的和目前优选的实施方案。
然而，应当知道鉴于该公开内容，本领域技术人员可以在本发明的精神和范围内进行改变和改进。
在本发明中，使用如下的糖化装置、材料和分析方法来进行实验。
1.糖化装置
图1中描述了用于糖化实验的装备有反应器和控制箱的糖化系统。反应器设计为具有500ml体积的圆柱形反应器(有效体积：400ml)，并具有12.5cm的内部高度和7cm的内部直径。温度夹套与其连接，以将反应温度调节至指定的温度。将热电偶装备在其上，以测量反应器的内部温度。为了防止过热，设计冷却水来反应器外部循环。为了在反应过程中易于取样，从反应器外部注入高压N2气体，为 此，将N2气体罐和取样气门装备在其上。同时，将控制箱装备上RPM计、数字温度调节器和压力计。
2.材料
2.1.底物
在实施例中，将来自摩洛哥的石花菜，来自济洲岛的石花菜，marine string和Cottonii用作红藻，而将刺松藻用作绿藻。此外，将海带用作褐藻。
在实施例中，通过两种不同的方法来进行实验；一种是使用石花菜作为原料的直接糖化，而另一种是使用从石花菜分离/提取的纤维和琼脂作为原料的间接糖化。对于直接糖化，用蒸馏水洗涤石花菜，在40℃干燥，接着粉碎，并用106或300目筛网过滤。对于间接糖化，从石花菜中提取出琼脂，将石花菜浸泡在KOH水溶液中一会，并用蒸馏水洗涤，接着使用蒸馏水或乙醇或甲醇提取出琼脂，在40℃干燥并粉碎。提取琼脂后，用O3将剩余的纤维漂白两次(1小时/升次漂白)，然后用CIO2在60℃再漂白两次(1.5小时/升次漂白)，然后用H2O2在80℃再漂白两次(1小时/升次漂白)，以获得分离的纤维。
2.2.菌株和培养基
在实施例中，使用酿酒酵母DKIC413和卡斯特酒香酵母H1-39(韩国微生物培养中心，KCCM 11490)，并选择YEPD(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)作为培养基。将培养基在高压灭菌器(Woosung Scientific Co.，韩国)中在121℃下灭菌15分钟。
2.3.酶
实施例中所用的酶是可购得的，并购自Biosys Co.，韩国。通过浓缩里氏木霉培养液制备的Celluclast是一种将纤维素水解成葡萄糖和纤维二糖的纤维素酶。通过浓缩刺孢曲霉培养液制备的Viscozyme是含有纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶的酶复合物。 Spirizyme和AMG(Amylo Glucosidase)是产自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶，其是通过α-淀粉酶和异淀粉酶将转化自淀粉的麦芽糖寡聚物水解成葡萄糖。通过浓缩脆壁克鲁维酵母培养液制备的Lactozyme是一种将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的乳糖酶。每种酶的功能和水解条件示于表3中。
[表3]
酶特性和水解条件
| 酶 | 特性 | 水解条件 | 活性 | 目的 |
| Celluclast | 纤维素水解 | pH：4.5-6.0， 温度：50-60℃ | 700EGU1)/g | 纤维素水解 |
| Viscozyme | 纤维素、木聚糖、 半纤维素水解 | pH：3.3-5.5， 温度：25-55℃ | 100FBG2)/g | 琼脂水解 |
| Spirizyme | 淀粉、麦芽糖水解 | pH：4.2-4.5， 温度：60-63℃ | 400AG3)/g | 琼脂水解 |
| AMG | 淀粉、麦芽糖水解 | pH：4.5， 温度：60℃ | 300AG/g | 琼脂水解 |
| Lactozym | 乳糖水解 | pH：6.5， 温度：37℃ | 3000LAU4)/ml | 琼脂水解 |
1)EGU：内-葡聚糖酶单位
2)FBG：真菌葡聚糖酶单位
3)AG：1μmol麦芽糖/分钟
4)LAU：1mmol麦芽糖/分钟
3.分析方法
3.1.糖分析
用装备检流器的HPLC(ICS-3000，Dionex Co.，USA)分析水解产物。同时，将Carbopac PA 1(4250mm，Dionex Co.，USA)和Carbopac PA 1(450mm，Dionex Co.，USA)用作柱子。作为移动相，使用16mM NaOH溶液。流速为1ml/分钟，并且柱温为30℃。使用标准材料的校正曲线来定量葡萄糖和半乳糖的浓度。根据式1来计算 葡萄糖和半乳糖的产量，表示所产生的葡萄糖和半乳糖与原料总干重的比例。
[式1]
产量(％)＝C×V/S×100
C＝葡萄糖或半乳糖的浓度(g/l)
V＝用于糖化的溶剂总量(l)
S＝用于糖化的底物(蛋白质、纤维、葡聚糖等)总量(g)
3.2.蛋白质分析(半-微Kjeldahl方法)
为了分析蛋白质样品，将0.5g蛋白质样品置于蛋白质分解管中，向其中加入20ml硫酸和5g蛋白水解促进剂(K2SO4∶CuSO4·5H2O＝9∶1)，接着分解蛋白。完成分解时，向其中加入70ml蒸馏水。将75ml 32％的NaOH加入蒸馏器中，接着使用蛋白质蒸馏装置来蒸馏。用100ml 3％硼酸收集通过蒸馏产生的氨，并用0.1N HCl滴定。通过式2计算总氮含量。
[式2]
蛋白质含量(％)＝0.0014×(V1-V0)×f×N/S ×100
V0＝空白样品的0.1N HCl消耗(ml)
V1＝样品的0.1N HCl消耗(ml)
f＝0.1N HCl系数
N＝氮系数
s＝样品量(mg)
0.0014：对应于1ml 0.1N HCl的氮量(g)
3.3.灰分分析(干灰化方法)
将坩锅在550℃炉子中加热，直至其达到恒重，接着在干燥器重冷却并测量。将2g样品置于测量的坩锅中，接着在550℃炉子中灰化，直至其转变成白色或灰色的灰分。然后将灰分在200℃的炉子中冷却， 然后转移至干燥器中，接着在室温中再次冷却。通过式3计算灰分含量(％)。
[式3]
灰分(％)＝(W0-W1)/S×100
W1＝坩锅的恒重(g)
W0＝灰化后的坩锅+灰分的重量(g)
S＝样品重量(g)
3.4.细胞浓度的测量
使用分光光度计(Genesys 10-S，Thermo electron corp.，USA)在600nm测量细胞浓度。随着时间进行培养液的取样，接着使用离心机(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韩国)在3,500rpm离心10分钟。用蒸馏水洗涤沉淀物，并再次离心。将沉淀物在50℃干燥24小时，接着测量干燥样品的重量。通过以下等式计算酿酒酵母的干细胞重：干细胞重＝0.3135OD+0.1811(校正系数＝0.994)，而通过以下等式计算卡斯酒香酵母的干细胞重：干细胞重＝0.1292OD+0.8554(校正系数＝0.999)。
3.5.乙醇分析
通过装备有RI检测器的HPLC(Breeze HPLC系统，Waters Co.，USA)测量发酵培养液中的乙醇浓度。同时，将Aminex HPX-87H(3007.8mm，Bio-rad)用作柱子。将5mM硫酸水溶液用作移动相，并且流速为0.6ml/分钟，并将柱子和RI检测器的温度设定在50℃。使用标准材料的校正曲线来定量乙醇含量。
实施例1：不同海藻中纤维蛋白和半乳聚糖组成的分析
将0.3g海藻(来自摩洛哥的石花菜，来自济洲岛的石花菜，marinestring，Cottonii，刺松藻，裙带菜或紫菜)和3ml 72％硫酸溶液加入 玻璃管中，接着在30℃反应2小时(第一次水解)。反应完成时，将反应混合物置于250ml瓶中，向其中加入84ml蒸馏水，接着在高压灭菌器(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韩国)中121℃下水解1小时(第二次水解)。第二次水解完成时，当内部温度50℃时，取出瓶子，然后冷却至室温。从瓶中取出1ml反应混合物，并用CaCO3中和，接着使用离心机(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韩国)在8,000rpm离心10分钟来除去CaSO4。计算纤维和半乳聚糖的组成。
如表4中所示，尽管它们是相同的海藻种，但发现根据生长位置，其组成是不同的。确切地，石花菜(来自摩洛哥或济洲岛，韩国)中的碳水化合物含量最高，为70-80％，而群带菜中最低(40％)。非碳水化合物(蛋白质、脂质等)的含量在裙带菜中最高(59％)，而在石花菜(来自摩洛哥或济洲岛，韩国)中最低，为20-28％，这表明石花菜(红藻中的一种)具有作为乙醇生产的良好原料的最高潜能。因此，该实验后，选择来自摩洛哥的具有相对高碳水化合物含量的石花菜作为糖化/发酵的底物。
[表4]
海藻的化学组成
实施例2：糖化实验
<2-1>通过酸水解的糖化
将75g底物和1％硫酸水溶液加入4l锥形烧瓶中，接着在121℃反应15分钟。然后，将温度降至室温，并用CaCO3中和水解产物。在分开的实验中，使用离心机(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韩国)在8,000rpm进行离心10分钟来除去CaSO4。根据S/L比将底物(5.5-15.0％)和硫酸水溶液(0.5-4.0％)加入高压反应器中，接着在指定的温度(80-200℃)糖化所需的时间(0-4小时)。在每个特定的时间和完成反应时取出样品用于分析，将反应器的温度降至室温，接着取样用于分析。用CaCO3中和所有样品，接种离心来除去CaSO4。使用离心机(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韩国)在8,000rpm进行离心10分钟。结果如下。
<2-1-1>使用琼脂(石花菜)的糖化
将干燥的琼脂用作底物，并在反应完成时，将根据不同反应温度的糖化产量相互比较。因为底物是琼脂，可生产的单糖是半乳糖和3，6-脱水半乳糖(3，6-AHG)(图2)。但是，只选择容易发酵的单糖(其是半乳糖)来计算产量。将10g底物和400ml硫酸水溶液加入500ml反应器中，接着在80-120℃反应30分钟。反应完成时，将温度降至室温，并中和水解产物，用HLPC(ICS-3000，Dionex Co.，USA)分析。图3说明了在不同反应温度下从琼脂产生的半乳糖产量。随着反应温度从80℃升至120℃，半乳糖产量增加。但是，在150℃时产量下降，这表明即使半乳糖产量随着反应温度升高而增加，但一旦温度超过上限，所产生的糖随着时间变成分解的，导致产量下降。因此，在温度达到150℃之前，需要取出样品来检测反应过程中的产量。并且温度达到120，140和150℃时，进行取样。
图4说明了在120，140和150℃的温度下从琼脂产生的半乳糖产量。随着反应温度的升高，半乳糖产量增加，并且当温度达到150℃ 时，产量最高(37.1％，基于半乳糖：74.2％)。反应温度降至室温后，产量下降(32.8％)，表明产生的糖在冷却过程中分解了。
<2-1-2>使用纤维蛋白的糖化
在更严格的条件下水解纤维蛋白。通常，甚至应当在200-240℃下水解纤维的晶体结构。在该实施例中，鉴于以上所述的，将反应温度设定为200℃，并且将0.5-4.0％硫酸用作催化剂来比较随着催化浓度的糖产量。将20g底物和400ml硫酸水溶液加入反应器中，接着糖化1小时。图5是说明了随着催化剂浓度从纤维产生的葡萄糖产量的图，在200℃的反应温度下测量。
如图5中所示的，产量随着硫酸浓度的增大而降低。特别地，使用4.0％时，产量仅为0.1％。使用2.0％硫酸的产量为2.6％，使用1.0％硫酸水溶液的产量为12.3％，而发现使用0.5％硫酸的产量为15.8％。
<2-2>酶促水解
将底物(琼脂：1.1g，纤维：2.5g)和100ml蒸馏水在250ml锥形烧瓶中混合。根据选定的酶来调节pH。加入1ml每种酶后，在适于选定的每种酶的反应条件下通过在100rpm混合来进行糖化。在反应过程中以规律的时间间隔取出样品，并使用离心机(VS-150FN，Vision Science Co.，LTD.，韩国)在3,000rpm将样品离心5分钟，并分析所获得的上清液。
使用纤维蛋白作为底物进行糖化，使用2.5％的最初底物浓度，持续144小时。如表5中所示的，从糖化得到的葡萄糖浓度为11.6g/l，表明大约46％的纤维蛋白转化成葡萄糖。快速诱发糖化持续头3个小时，然后反应变慢，但恒定。鉴于纤维蛋白通过酸水解成葡萄糖的最大转化率为15％(图7)，认为通过纤维素酶的糖化是非常有效的。
含有至少1％琼脂的溶液非常粘。因此，使用1.1％最初底物浓度进行使用琼脂作为底物的糖化，持续144小时。作为水解酶，考虑到经济效益，使用了淀粉分解酶、麦芽糖酶和乳糖酶的商业化混合物。 因此，如表6中所示的，发现包括淀粉酶的淀粉水解酶在琼脂水解中是无效的，并且认为在早期反应阶段中检测到的半乳糖是从琼脂组合物分离过程中分离出来的游离半乳糖单体。
[表5]
通过酶糖化来自作为底物的纤维蛋白的葡萄糖浓度
[表6]
通过酶糖化来自作为底物的琼脂的半乳糖浓度
<2-3>直接糖化
<2-3-1>温度和时间的影响
<2-3-1-1>S/L比例5.5％
将22g来自摩洛哥的石花菜(底物)与400ml 1％硫酸水溶液混合，接着在120-150℃糖化4小时。使用5.5％的S/L比例，观察随着反应温度和时间的葡萄糖、半乳糖和葡萄糖+半乳糖(单糖)产量。结果，如图6中所示的，葡萄糖和半乳糖在140℃呈现出最高的产量(葡萄糖：4.8％，半乳糖：33.7％，单糖：38.5％)，并且在120℃下产量随着反应时间而增加。在150℃下，反应15分钟后，半乳糖的产量快速下降。
<2-3-1-2>S/L比例10.0％
将40g来自摩洛哥的石花菜(底物)与400ml 1％硫酸水溶液混合，接着在120-150℃糖化4小时。图7是说明了在10.0％的S/L比例下随着反应时间和温度的葡萄糖、半乳糖和葡萄糖+半乳糖(单糖)产量的图。在150℃下，葡萄糖和半乳糖的产量都是最高的，并且发现产生最高产量的反应时间为15分钟(葡萄糖：4.7％，半乳糖：29.8％，单糖：34.5％)。
<2-3-1-3>S/L比例15.0％
图8是说明了使用15.0％的S/L比例(底物：60g，1％硫酸水溶液：400ml)随着反应时间和温度的葡萄糖、半乳糖和葡萄糖+半乳糖(单糖)产量的图。在15.0％的S/L比例，最高产量的反应温度和时间是150℃和0-15分钟(葡萄糖：4.0％，半乳糖：22.0％，单糖：26.0％)。在120-140℃30分钟后，水解几乎没有下降，这S/L比例为10.0％时的结果相一致。
<2-3-2>S/L比例的影响
图9说明了在不同的S/L比例下在120℃糖化4小时得到的半乳糖产量。为了最小化S/L比例和反应温度影响产量的因素，比较了最低反应温度(120℃)的结果。因为葡萄糖的产量太低，以致未考虑，图9中只显示了半乳糖产量，表明5.5％的S/L比例显示出最高的半乳糖产量。那些在10.0％和15.0％的S/L比例具有相似的产量(11～13％)。
<2-3-3>酸浓度的影响
为了比较使用石花菜作为底物时根据催化剂浓度的单糖产量，将60g底物与400ml 0.5-1.25％硫酸溶液混合，接着在150℃糖化4小时。如图10中所示的，用1.0％硫酸溶液进行糖化0-15分钟时，葡萄糖的 产量为4.0％，而半乳糖的产量为22.3％，这是最高的，但15分钟后，产量下降。用0.75-1.25％硫酸溶液进行糖化时，一个小时后产量开始下降。使用0.5％硫酸溶液时，产量随着时间没有太多不同。使用0.75％或1.25％硫酸溶液时，两者之间的产量几乎相同，并且使用0.5％硫酸溶液时，产量最低。
<2-3-4>酸种类的影响
为了比较根据酸种类的所产生的单糖产量，将7.5g来自摩洛哥的石花菜和200ml 1％的硫酸、盐酸、硝酸和醋酸水溶液放入250ml锥形烧瓶中，接着在高压灭菌器中在121℃下糖化15分钟。图11显示了使用上述催化剂的葡萄糖、半乳糖和葡萄糖+半乳糖(单糖)的产量。特别地，将醋酸用作催化剂时，没有诱发水解，这表明醋酸对于酸水解不是合适的催化剂。而将硫酸用作催化剂时，半乳糖和葡萄糖的产量都高。
<2-4>多步骤糖化
在之前的实验中，证实了发现用于产生半乳糖和葡萄糖的水解条件是彼此不同的。特别地，用于水解琼脂产生半乳糖的条件与用于纤维产生葡萄糖的条件相比要温和得多。还证实了使用分离自石花菜的纤维和琼脂诱发的糖化时比用石花菜直接诱发时，所产生单糖的产量要高得多。因此，如果通过改进方法来最大化糖化效率，将最大化乙醇的产量。
在该实施例中，将7.5g来自摩洛哥的石花菜与200ml 1％硫酸水溶液在250ml锥形烧瓶中混合，接着在高压灭菌器中在121℃下糖化15分钟，并且逐步进行反应，如第一次、第二次、第三次和第四次糖化。研究随着步骤的葡萄糖提取率以及葡萄糖和半乳糖的产率。因此，如表7和图21中所示的，第一次糖化后的提取率为78.0％(石花菜中的纤维蛋白含量：17％，鉴于纤维蛋白含量来计算产率，并且呈现为与原料总量的比例)。第二次糖化后的半乳糖产率为29.6％，当没有 考虑原料的总量而是只考虑可水解成半乳糖的成分(28％，表4)时，产率升至105.7％(为什么产率超过100％的原因：一些3，6-AHG转化成半乳糖)。几乎提取了石花菜的所有半乳糖。通过此后重复的糖化没有提高第一次糖化后的葡萄糖产率，表明没有再诱使纤维蛋白的水解。在上述反应条件下直至第二次糖化，继续有效地进行着琼脂糖化至半乳糖以及从石花菜中分离纤维蛋白的过程。如果通过酸水解或酶水解可以提高来自分离纤维蛋白的葡萄糖产率，多步骤糖化可以有效地用作能够最大化单糖产量的最佳方法。
[表7]
使用石花菜作为底物时水解次数对单糖产量的影响(条件：1％H2SO4，121℃，15分钟)
| 水解次数 | 实体残余物(g) | 减少率(％) | 葡萄糖产率(％) | 半乳糖产率(％) |
| 0 | 2.9670 | - | - | - |
| 第一次 | 0.6397 | 78.4 | 3.5 | 25.1 |
| 第二次 | 0.4752 | 5.5 | 未检出 | 4.5 |
| 第三次 | 0.4207 | 1.8 | 未检出 | 未检出 |
| 第四次 | 0.4128 | 0.3 | 未检出 | 未捡出 |
实施例3：乙醇产生菌株培养物
<3-1>菌株的特征
<3-1-1>酿酒酵母
为了研究乙醇产生酵母(酿酒酵母)的生长模式和糖吸收，将葡萄糖和半乳糖用作培养物的碳源。同时，用1％、2％和5％的不同碳源浓度来进行培养。图13说明了在1％、2％和5％的不同浓度下使用葡萄糖时，酿酒酵母的生长曲线和糖。图14说明了在1％、2％和5％的不同浓度下添加半乳糖时，酿酒酵母的生长曲线和糖吸收。随着碳源浓度的提高，细胞浓度提高。在最高的碳源浓度(5％)下，酵母的生长率低于所预期的。与碳源浓度无关，在24小时内消耗了所有葡萄 糖，而在48小时内消耗了所有半乳糖。葡萄糖的消耗比半乳糖的消耗快，但是将半乳糖用作碳源时，酵母的生长使用葡萄糖时的高。
<3-1-2>卡斯酒香酵母
使用与用于酿酒酵母培养的相同碳源和浓度研究了另一种产乙醇酵母卡斯酒香酵母的生长模式和糖吸收。结果，如图15和图16中所示的，菌株的浓度随着碳源浓度的升高而升高，并且将半乳糖用作碳源时，发现使用5％半乳糖时，酵母的菌丝体浓度最高。该结果与酿酒酵母的相一致。还一致的是在卡斯酒香酵母的情况中，与碳源浓度无关，葡萄糖消耗快于半乳糖消耗，确切地，在12小时内消耗了所有葡萄糖，而在18小时内消耗了所有半乳糖，表明糖吸收速度是酿酒酵母的两倍。菌株的生长速率也比酿酒酵母的快。
<3-2>乙醇发酵
酿酒酵母和卡斯酒香酵母，是保存在固体培养基中的酵母，使用接种环将其接种于含有100ml YEPD的250ml锥形瓶中，接着分别在37℃或30℃下在150rpm预培养24小时。在将25％的预培养物溶液接种于150ml(如果接种于发酵罐中，体积为2.5l)含有混合糖或水解产物(1-20％)和蛋白胨15％，酵母提取物15％和硫酸镁0.5％的培养基中后，在37℃或30℃下在初始pH5.0-5.5下进行主培养48小时。
<3-2-1>使用混合糖的发酵
石花菜在高压灭菌器中在121℃下第一次糖化15分钟后，半乳糖浓度为0.8-0.9％，而葡萄糖浓度为0.03-0.05％。在该实施例中，使用与水解产物相同的浓度以及相同的比例(半乳糖/葡萄糖)来制备混合糖。然后，研究了使用混合糖时酿酒酵母和卡斯酒香酵母的乙醇发酵模式。图17和图18说明了使用酿酒酵母和卡斯酒香酵母作为混合糖中的发酵酵母的乙醇发酵结果。酿酒酵母在发酵48小时后甚至都没有 消耗所有混合糖(消耗了所有葡萄糖，但是只消耗了35％的半乳糖)，并且其首先消耗葡萄糖，在消耗了所有葡萄糖后再开始消耗半乳糖用于代谢。同时，卡斯酒香酵母同时使用了葡萄糖和半乳糖用于其代谢，并且在发酵24小时内消耗了所有的混合糖。该菌株从发酵开始时就开始产生乙醇(由葡萄糖引发)并在48小时后，其产生大约4.1g/l乙醇(乙醇产量：93.8％)。将卡斯酒香酵母用作发酵酵母时，甚至在发酵24小时后在消耗了所有碳源后继续增加乙醇水平，表明转化了细胞内组成。
<3-2-2>使用水解产物的发酵
图19和图20说明了使用酿酒酵母和卡斯酒香酵母作为发酵酵母和使用在高压灭菌器中水解的水解产物的乙醇发酵结果。酿酒酵母甚至在发酵48小时后也没有产生乙醇，而卡斯酒香酵母在发酵12小时后产生了乙醇(4.6g/l，乙醇产量：96.0％)，但是从那时开始没有再增加。与使用混合糖的结果相比较，酿酒酵母和卡斯酒香酵母都证明了较慢的糖消耗速率和较低的乙醇生产。
工业实用性
如之前所解释的，本发明使用海藻生产生物燃料的方法通过使用大量的海洋生物质有助于改善原料供应，通过排除木质素消除过程来降低生产成本，木质素消除过程是根据常规方法使用木基原料时必需的，通过将海藻中包含的大部分碳水化合物如半乳糖、3，6-脱水半乳糖以及葡萄糖转化成生物燃料来降低生产成本，克服了能源担忧问题，并且由于通过海藻极好的CO2吸收来减少温室气体。因此，本发明在经济和环境观点中是有利的，并且还应对了国际环境规则。
Claims (21)
1.生物燃料的生产方法，包括以下步骤：
通过用水解酶和/或水解催化剂处理海藻或从海藻中提取出来的多糖来产生单糖；和
使用微生物发酵单糖。
2.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中生物燃料选自C1-C4醇和C2-C4酮。
3.根据权利要求2的生物燃料的生产方法，其中生物燃料选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和丙酮。
4.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中多糖选自琼脂、淀粉、卡拉胶、藻酸和纤维蛋白。
5.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中海藻是大藻类或微藻类。
6.根据权利要求5的生物燃料的生产方法，其中大藻类选自红藻、褐藻和绿藻。
7.根据权利要求5的生物燃料的生产方法，其中微藻类是小球藻或螺旋藻。
8.根据权利要求6的生物燃料的生产方法，其中红藻选自石花菜(Gelidium amansii)、紫菜、Cottonii、Grateloupia lanceolata、圆紫菜(Porphyra suborbiculata)、鸡毛藻(Pterocladia tenuis)、Acanthopeltis japonica、鹿角海萝(Gloiopeltis tenax)、真江篱(Gracilaria verrucosa)、角叉菜(Irish moss)、厚膜藻(Pachymeniopsis elliptica)、长枝沙菜(Hypnea charoides)、三叉仙菜(Ceramium kondoi)、波登仙菜(Ceramium boydenii)、线形杉藻(Gigartina tenella)、钩凝草(Campylaephora hypnaeoides)和繁枝蜈蚣藻(Grateloupia filicina)。
9.根据权利要求6的生物燃料的生产方法，其中褐藻选自裙带菜(Undaria pinnatifida)、海带(Laminaria japonica)、Analipusjaponicus、长松藻(Chordaria flagelliformis)、铁钉菜(Ishigeokamurai)、Scytosiphon lomentaria、鹅肠菜(Endarachnebinghamiae)、Ecklonia cava、Ecklonia stolonifera、Eisenia bicyclis、Costaria costata、Sargassum fulvellum、铜藻(Sargassum horneri)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)和羊栖菜(Hitzikia fusiformis)。
10.根据权利要求6的生物燃料的生产方法，其中绿藻选自石莼(ulva lactuca)、水绵属、浒苔属、刺松藻(Codium fragile)、Codiumminus、Caulerpa okamurai和Nostoc commune。
11.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中通过以下步骤来进行多糖的提取：
将海藻在碱水溶液中浸泡并用水清洗；
将清洗过的海藻浸泡在提取溶剂中预定的时间，并提取一种或多种选自琼脂、卡拉胶和藻酸的糖；和
分离提取物并收集剩余的淀粉或纤维蛋白。
12.根据权利要求11的生物燃料的生产方法，其中提取溶剂选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用的固体酸。
13.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中单糖选自半乳糖、半乳糖衍生物、3，6-脱水半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、鼠李糖、木糖和甘露糖。
14.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中水解酶选自β-琼脂水解酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、内-1，4-β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和纤维素酶。
15.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中水解催化剂选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用的固体酸。
16.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中通过将琼脂与浓度为0.05-30％的选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用固体酸的水解催化剂在60-200℃下反应0-6小时来产生单糖。
17.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中通过将纤维蛋白与浓度为0.05-50％的选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用固体酸的水解催化剂在80-300℃下反应来产生单糖。
18.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中通过将纤维蛋白与水解酶反应0-144小时来产生单糖。
19.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中通过将海藻与浓度为0.05-50％的选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用固体酸的水解催化剂在60-300℃下反应0-6小时来产生单糖。
20.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中通过多步骤糖化来产生单糖，所述多步骤糖化包括以下步骤：将海藻与浓度为0.05-50％的选自H2SO4、HCl、HBr、HNO3、CH3COOH、HCOOH、HClO4、H3PO4、PTSA和常用固体酸的水解催化剂在60-300℃下反应0-6小时；和在如上的相同反应条件下剩余的纤维蛋白或淀粉的第二次或第三次糖化。
21.根据权利要求1的生物燃料的生产方法，其中用于发酵的微生物选自酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)、胃八叠菌(Sarcinaventriculi)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、Zygomomonasmobilis、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)IMB3、卡斯特酒香酵母(Brettanomyce custersii)、丙酮丁酸梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、金黄丁酸梭菌(Clostriduim aurantibutylicum)和假破伤风梭菌(Clostridiumtetanomorphum)。
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