CN102747169A - 一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法 - Google Patents
一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102747169A CN102747169A CN2012102175270A CN201210217527A CN102747169A CN 102747169 A CN102747169 A CN 102747169A CN 2012102175270 A CN2012102175270 A CN 2012102175270A CN 201210217527 A CN201210217527 A CN 201210217527A CN 102747169 A CN102747169 A CN 102747169A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhamnosyl
- raw material
- material production
- degradation
- marine alga
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种生产鼠李糖的方法，该方法以海藻生物质：绿藻或螺旋藻为原料，首先采集、清洗、干燥和粉碎海藻生物质，配置成海藻生物质溶液，然后加入降解催化剂对海藻多糖进行充分降解，接着利用层析等技术对海藻多糖降解液中的不同组份进行分离，获得鼠李糖粗品，再经过脱色和重结晶过程，获得高纯度的鼠李糖。本发明克服了目前直接从高等植物提取鼠李糖时原材料相对较为短缺和含量较低的缺点，且与目前发酵法生产鼠李糖相比，本发明工艺相对简单，生产周期短，为快速实现鼠李糖的规模化生产提供了一条可行性的方案。
Description
技术领域
本发明涉及鼠李糖的生产工艺技术领域，尤其涉及一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法。
背景技术
鼠李糖是甘露糖6位的一个羟基被氢取代的衍生物，自然界天然存在的为L型，即6-脱氧-L-甘露糖，又称甲基戊糖。鼠李糖的甜度为蔗糖的33％，熔点为93-95℃。纯品鼠李糖为无色结晶性粉末，能溶于水和甲醇，微溶于乙醇，其结晶呈两种形式，α型和β型。α型含有一分子结晶水，加热后失去结晶水，转变为β型，β型在空气中吸潮转变为α型，故常见鼠李糖为α-L-鼠李糖。
鼠李糖作为一种还原糖，可广泛用于香料、食品和医药行业。在香料领域，鼠李糖可用于制备水果芳香剂，其粉末可用于制备黄酮类化合物呋喃酮，它是食品和香料工业中芳香剂的基体，带有一种强烈的乳香味，改变其分子半径、浓度或其他组成可以得到草莓、菠萝、柚子、熟牛肉等各种气味。在食品领域，鼠李糖可作为食品添加剂添加于高档咖啡、饮料、肉类中。在医药领域，鼠李糖可合成强心药物及其他许多药物的前体物，也可作为肠道渗透测试剂。
鼠李糖脂是鼠李糖的重要衍生物之一。鼠李糖脂是阴离子生物表面活性剂，不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在碱性水溶液中也表现出良好的溶解特性，可以在温度、pH值及盐度处于极端状况下使用，并且无毒，可以生物降解。另外，鼠李糖脂兼具良好的化学和生物特性，具有油、水两亲性，可以降低水表面张力，可以作为润湿剂、乳化剂和发泡剂使用。因此，鼠李糖脂在石油工业、绿色农业和生态环境方面，以及在食品行业、化妆品、医疗方面均有较大的应用潜力。目前，鼠李糖脂主要是由微生物分泌产生，而利用鼠李糖直接化学合成鼠李糖脂是目前研究的热点，有望成为将来实现鼠李糖脂工业化生产的重要途径之一。
目前，鼠李糖主要是通过从天然植物中提取含有L-鼠李糖基的化合物，将该L-鼠李糖基的化合物水解而获得。例如，市售鼠李糖主要是从阿拉伯胶或柚皮苷的水解物中提取（CN102093323A、CN101891774A和CN102093435A）。但是，该方法所使用的原料受季节和产地的限制，价格昂贵，并且该方法的工艺劳动强度大，生产中会产生大量芳香族污染物。因此，该方法成本高、产量低，导致鼠李糖价格昂贵，限制了其大规模的工业化使用。另外，工业化生产鼠李糖的主要方法是利用微生物工程菌株发酵生产鼠李糖，但是该方法一方面受微生物工程菌株效率的影响，另一方面受到从发酵液中提取多糖的技术难度限制，例如多糖本身的性质对于发酵过程的影响、由于发酵液粘度高而使生物反应器的搅拌需要消耗过多能量，以及工艺条件难以控制等等，致使目前鼠李糖的价格仍旧居高不下。因此，低成本、高产量的鼠李糖生产工艺是目前亟需探索研究的重要课题之一。
发明内容
本发明的技术目的是针对上述鼠李糖生产工艺的不足，提供一种生产鼠李糖的新方法，该方法能够降低鼠李糖的生产成本、提高鼠李糖的产量。
针对海藻生物质鼠李糖高含量的特点，开发适合螺旋藻或者绿藻的海藻多糖降解方法，保证最大限度的获得鼠李糖。
本发明实现上述技术目的所采用的技术方案是：一种生产鼠李糖的方法，该方法以海藻生物质为原料，该海藻生物质为绿藻（Chlorophyta）或螺旋藻（Spirulina）生物质，制备步骤如下：
步骤1、将海藻生物质清洗、干燥后粉碎为海藻生物质颗粒，然后将海藻生物质颗粒配制为海藻生物质水溶液；
步骤2、在该海藻生物质水溶液中加入降解催化剂以降解海藻生物质；
步骤3、将降解产物过滤，去除不溶性残渣，获得可溶性的单糖和多糖上清溶液；
步骤4、将单糖和多糖溶液进行低、中或高压层析分离，使鼠李糖、单糖和多糖分离，获得鼠李糖粗提溶液；
步骤5、将鼠李糖粗提溶液进行脱色处理，再进行高压液相分离，得到的上清液进行浓缩处理，然后将浓缩产物进行结晶、重结晶，得到鼠李糖晶体。
所述的绿藻包括但不限于石莼属（Ulva）、礁膜属（Monostroma）和浒苔属（Enteromorpha）。
所述的步骤1中，海藻生物质颗粒粒径优选在50μm以内。
所述的步骤1中，海藻生物质水溶液的浓度优选高于200g/L。
所述的步骤2中，在海藻生物质水溶液中还加入降解酶，所述的降解酶主要包括但不限于鼠李糖苷酶、液化酶和糖化酶中的一种或几种。
所述的步骤2中，降解催化剂包括酸性降解催化剂与碱性降解催化剂，酸性降解催化剂包括但不限于H2SO4、HCl、H3PO4、HNO3、HBr、CH3COOH、HCOOH、HClO4、三氟乙酸以及固体酸中的一种或几种的混合物；碱性降解催化剂包括但不限于NaOH、KOH、K2CO3、磷酸钠和Na2CO3中的一种或几种的混合物。
所述的步骤2中，海藻生物质水溶液中加入降解催化剂的质量体积浓度（w/v）优选为1～30%。
所述的步骤2中，降解温度优选控制在80℃～300℃，降解时间优选控制为10min～24h。
所述的步骤4中，作为优选，包括过程A：将分离后的多糖进行检测，当其中含有鼠李糖后，加入降解催化剂以降解该多糖，然后重复步骤4，获得鼠李糖粗提溶液；接着重复该过程A数次。
所述的步骤5中，脱色处理方法包括但不限于吸附脱色，所述的吸附脱色包括但不限于使用活性炭进行吸附脱色。所述的活性炭加入的质量浓度优选为0.1～10%。
所述的步骤5中，重结晶的方法优选为：将结晶产物与2～10倍的醇类溶液混合，过滤除去不溶物，将上清液浓缩进行结晶、干燥，即得到鼠李糖晶体。其中，所述的醇类溶液包括但不限于甲醇，所述的醇类溶液的浓度优选大于90%。
综上所述，本发明提供了一种全新的直接从植物中提取鼠李糖的方法，该方法以海洋生物：绿藻生物质或螺旋藻生物质为原料，通过降解、分离、提纯工艺得到鼠李糖。大量生化研究结果发现，海藻中的绿藻和螺旋藻中鼠李糖含量较高，约占整个生物质的0.5～10%，这为直接提取鼠李糖提供了可行性。据世界粮农组织统计数据，2008年，全球人工收获的海藻约为1578万吨。中国是世界上海藻养殖面积最大，养殖技术最成熟的国家之一，2008年海藻产量占世界总产量63%，约993万吨，这为大规模生产鼠李糖提供了丰富的原材料。因此，本发明提供的鼠李糖的制备方法原材料充足，能够大幅度降低生产成本，为大规模生产鼠李糖奠定了基础，也为我国海洋经济发展提供了一个切入点，有利于我国海洋经济的快速发展和产业转型升级。
附图说明
图1是本发明以海藻为原料生产鼠李糖工艺流程图；
图2是本发明实施例1中以钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）为原料生产鼠李糖的提取率和得率图；
图3是本发明实施例2中以浒苔（Enteromorpha prolifera）为原料生产鼠李糖的提取率和得率图。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1：
本实施中，以钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）为原料生产鼠李糖，该生产工艺如图1所示，以下是具体的生产步骤。
步骤1：采集、清洗和干燥钝顶螺旋藻生物质。
步骤2：利用粉碎机将钝顶螺旋藻生物质粉碎，粉碎后钝顶螺旋生物质颗粒粒径小于50μm，取粉碎后的钝顶螺旋生物质颗粒20g配成100ml钝顶螺旋生物质水溶液。
步骤3：在钝顶螺旋生物质水溶液中加入10gNaOH在130℃下降解处理90min。
步骤4：将降解后的钝顶螺旋藻生物质水溶液过滤，去除不溶性残渣，得到的上清液进行低压层析粗分离。其中，低压分离使用层析介质为葡聚糖凝胶Sephadex-25，缓冲液为50mM Tris盐酸溶液（pH=7.0），流速为1ml/min。利用示差检测器检测糖类物质组分分离情况，分别收集不同组分，使用分析性高压液相和凝胶色谱仪分别检测含有收集组分中的单糖和多糖，收集合并含鼠李糖组分和多糖组分。将多糖组分再重复步骤3与4，直至鼠李糖在多糖组分中的质量含量低于0.5%（w/w）。合并多次收集的含鼠李糖组分，约为10ml。
步骤5：在鼠李糖粗提溶液中加入0.02g活性炭对鼠李糖进行脱色，过滤后取上清液。
步骤6：使用制备型高压液相色谱将粗分离的含鼠李糖组分分离，获得鼠李糖粗提溶液3ml。
步骤7：将上清液浓缩粗结晶，得到粗结晶产物0.9g，将该粗结晶产物再使用5倍体积95%（v/v）甲醇进行重结晶，得到鼠李糖晶体0.75g，其纯度大于等于99%。
如图2所示，上述以钝顶螺旋藻为原料生产得到的鼠李糖的提取率为4.5%，得率为3.75%。
实施例2：
本实施中，以绿藻浒苔（Enteromorpha prolifera）为原料生产鼠李糖，该生产工艺如图1所示，以下是具体的生产步骤。
步骤1：采集、清洗和干燥青岛沿海采集的浒苔生物质。
步骤2：利用粉碎机将浒苔生物质粉碎，粉碎后浒苔生物质颗粒粒径小于50μm，取粉碎后的浒苔生物质颗粒20g配成100ml浒苔生物质水溶液。
步骤3：在浒苔生物质水溶液中加入0.1g糖化酶和0.2g鼠李糖苷酶处理4h，再加入10ml H2SO4在150℃下降解处理100min。
步骤4：将降解后的浒苔生物质水溶液过滤，得到的上清液进行低压层析粗分离。其中，低压分离使用层析介质为葡聚糖凝胶Sephadex-25，缓冲液为50mM Tris盐酸溶液（pH=7.0），流速为1.5ml/min。利用示差检测器检测糖类物质组分分离情况，分别收集不同组分，使用分析性高压液相和凝胶色谱仪分别检测含有收集组分中的单糖和多糖，收集合并含鼠李糖组分和多糖组分。将多糖组分再重复步骤3与4，直至鼠李糖在多糖组分中含量低于0.5%（w/w）。合并多次收集的含鼠李糖组分，约为20ml。
步骤5：在鼠李糖粗提溶液中加入0.1g活性炭对鼠李糖进行脱色，过滤后取上清液。
步骤6：使用制备型高压液相色谱将粗分离的含鼠李糖组分分离，获得鼠李糖粗提溶液10ml。
步骤7：将上清液浓缩粗结晶，得到粗结晶产物1.86g，将该粗结晶产物再使用5倍体积95%（v/v）的甲醇进行重结晶，得到鼠李糖晶体1.59g，其纯度大于等于99%。
如图2所示，上述以绿藻浒苔为原料生产得到的鼠李糖的提取率为9.3%，得率为7.95%。
实施例3：
本实施中，以绿藻礁膜为原料生产鼠李糖，该生产工艺如图1所示，以下是具体的生产步骤。
步骤1：采集、清洗和干燥礁膜生物质。
步骤2：利用粉碎机将礁膜生物质粉碎，粉碎后礁膜生物质颗粒粒径小于50μm，取粉碎后的礁膜生物质颗粒20g配成10ml礁膜生物质水溶液。
步骤3：在礁膜生物质水溶液中加入0.15g糖化酶和0.3g鼠李糖苷酶处理4h，再加入15g NaOH在120℃下降解处理150min。
步骤4：将降解后的礁膜生物质水溶液过滤，得到的上清液进行低高压层析粗分离。其中，低压分离使用层析介质为葡聚糖凝胶Sephadex-25，缓冲液为50mM Tris盐酸溶液（pH=7.0），流速为1.5ml/min。利用示差检测器检测糖类物质组分分离情况，分别收集不同组分，使用分析性高压液相和凝胶色谱仪分别检测含有收集组分中的单糖和多糖，收集合并含鼠李糖组分和多糖组分。将多糖组分再重复步骤3与4，直至鼠李糖在多糖组分中含量低于0.5%（w/w）。合并多次收集的含鼠李糖组分，约为20ml。
步骤5：在鼠李糖粗提溶液中加入0.3g活性炭对鼠李糖进行脱色，过滤后取上清液。
步骤6：使用制备型高压液相色谱将粗分离的含鼠李糖组分分离，获得鼠李糖粗提溶液15ml。
步骤7：将上清液浓缩结晶，得到粗结晶产物1.4g，将该粗结晶产物再使用5倍95%（v/v）的甲醇进行重结晶，得到鼠李糖晶体1.1g，其纯度大于等于99.5%。
上述以绿藻礁膜为原料生产得到的鼠李糖的提取率为7.0%，得率为5.5%。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：以海藻生物质为原料，该海藻生物质为绿藻（Chlorophyta）或螺旋藻（Spirulina）生物质，制备步骤如下：
步骤1、将海藻生物质清洗、干燥后粉碎为海藻生物质颗粒，然后将海藻生物质颗粒配制为海藻生物质水溶液；
步骤2、在该海藻生物质水溶液中加入降解催化剂以降解海藻生物质；
步骤3、将降解产物过滤，去除不溶性残渣，获得含有单糖和多糖的上清溶液；
步骤4、将单糖和多糖溶液进行低、中或高压层析分离，使鼠李糖与非鼠李糖单糖和多糖分离，获得鼠李糖粗提溶液；
步骤5、将鼠李糖粗提溶液进行脱色处理，再进行高压液相分离，得到的上清液进行浓缩处理，然后将浓缩产物进行结晶、重结晶，得到鼠李糖晶体。
2.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的绿藻包括石莼属（Ulva）、礁膜属（Monostroma）和浒苔属（Enteromorpha）。
3.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤1中，海藻生物质颗粒粒径在50μm以内。
4.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤1中，海藻生物质水溶液的浓度高于200g/L。
5.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤2中，在海藻生物质水溶液中还加入降解酶，所述的降解酶包括鼠李糖苷酶、液化酶和糖化酶中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤2中，降解催化剂包括酸性降解催化剂与碱性降解催化剂，酸性降解催化剂是H2SO4、HCl、H3PO4、HNO3、HBr、CH3COOH、HCOOH、HClO4、三氟乙酸以及固体酸中的一种或几种的混合物；碱性降解催化剂是NaOH、KOH、K2CO3、磷酸钠和Na2CO3中的一种或几种的混合物。
7.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤2中，海藻生物质水溶液中加入降解催化剂的质量体积浓度为1～30%。
8.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤2中，降解温度为80℃～300℃，降解时间为10min～24h。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤4中，包括如下过程A：
将分离后的多糖进行检测，当其中含有鼠李糖后，加入降解催化剂以降解该多糖，然后重复步骤4，获得鼠李糖粗提溶液；接着重复所述的过程A数次。
10.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤5中，脱色处理方法为使用活性炭进行吸附脱色。
11.根据权利要求1所述的以海藻为原料生产鼠李糖的方法，其特征是：所述的步骤5中，重结晶的方法为：将结晶产物与2～10倍的醇类溶液混合，过滤除去不溶物，将上清液浓缩进行结晶、干燥，即得到鼠李糖晶体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012102175270A CN102747169A (zh) | 2012-06-26 | 2012-06-26 | 一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012102175270A CN102747169A (zh) | 2012-06-26 | 2012-06-26 | 一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102747169A true CN102747169A (zh) | 2012-10-24 |
Family
ID=47027656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012102175270A Pending CN102747169A (zh) | 2012-06-26 | 2012-06-26 | 一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102747169A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103951761A (zh) * | 2014-05-13 | 2014-07-30 | 浙江工商大学 | 酶法降解浒苔多糖的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6210096A (ja) * | 1985-07-04 | 1987-01-19 | Towa Kasei Kogyo Kk | Ｌ−ラムノ−スの製造方法 |
| US4758283A (en) * | 1985-11-26 | 1988-07-19 | Towa Chemical Industry Co. Ltd. | Process for preparing L-rhamnose |
| CN101932715A (zh) * | 2007-02-26 | 2010-12-29 | 韩国生产技术研究院 | 使用海藻生产生物燃料的方法 |
-
2012
- 2012-06-26 CN CN2012102175270A patent/CN102747169A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6210096A (ja) * | 1985-07-04 | 1987-01-19 | Towa Kasei Kogyo Kk | Ｌ−ラムノ−スの製造方法 |
| US4758283A (en) * | 1985-11-26 | 1988-07-19 | Towa Chemical Industry Co. Ltd. | Process for preparing L-rhamnose |
| CN101932715A (zh) * | 2007-02-26 | 2010-12-29 | 韩国生产技术研究院 | 使用海藻生产生物燃料的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 浦跃武，等: "鼠李糖的研究现状及其应用", 《食品工业科技》, vol. 23, no. 2, 31 December 2002 (2002-12-31) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103951761A (zh) * | 2014-05-13 | 2014-07-30 | 浙江工商大学 | 酶法降解浒苔多糖的方法 |
| CN103951761B (zh) * | 2014-05-13 | 2016-04-13 | 浙江工商大学 | 酶法降解浒苔多糖的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Filote et al. | Biorefinery of marine macroalgae into high-tech bioproducts: a review | |
| Zollmann et al. | Green technology in green macroalgal biorefineries | |
| Sindhu et al. | Conversion of food and kitchen waste to value-added products | |
| CN102731176B (zh) | 一种海藻生物复合有机液肥的生产方法 | |
| CN104328064B (zh) | 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用 | |
| CN100577793C (zh) | 微生物转化d-果糖制备d-阿洛酮糖的菌种和方法 | |
| JP6919827B2 (ja) | 微生物から油を回収する方法 | |
| CN103352062B (zh) | 一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法 | |
| KR101244480B1 (ko) | 전처리된 해조류 잔사의 추출물을 이용한 휘발성 지방산 제조 방법 | |
| Sun et al. | Research development on resource utilization of green tide algae from the Southern Yellow Sea | |
| CN102334702B (zh) | 一种紫菜蛋白多糖营养素粉的生产方法 | |
| JP2015012842A (ja) | 焼酎廃水を培地として使用するスクワレン産生藻類の培養方法 | |
| CN104341535A (zh) | 一种浒苔高值化提取方法 | |
| CN103740597A (zh) | 一种草酸青霉菌fh6菌株及其筛选方法和应用 | |
| Nicodemou et al. | Biorefinery development for the production of polyphenols, algal biomass and lipids using olive processing industry waste | |
| JP7385799B2 (ja) | パームオイル工場排出液（ｐｏｍｅ）をつかった従属栄養性微細藻類の培養方法及びｄｈａ製造方法 | |
| CN105483015A (zh) | 用生活污水稀释餐厨垃圾厌氧消化液培养色球藻的方法 | |
| CN102747169A (zh) | 一种以海藻为原料生产鼠李糖的方法 | |
| CN102329833A (zh) | 用废糖蜜和废甘油发酵生产槐糖酯的方法 | |
| CN106701587A (zh) | 一种回收利用微藻藻渣用于生产富含多糖螺旋藻的方法 | |
| CN102533565B (zh) | 产糖苷酶的黑曲霉及其应用于提高虎杖中白藜芦醇含量 | |
| Trivedi et al. | Marine macroalgal biorefinery: Recent developments and future perspectives | |
| CN103540535B (zh) | 胞内脂肪酶产生菌及其应用及筛选方法及使用方法 | |
| CN101475963B (zh) | 一种以海带为原料生产沼气的方法 | |
| Dhiman et al. | Potential Benefits of Utilization of Kitchen and Agri Wastes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121024 |