WO2012148023A1 - 무수갈락토스의 분리정제 방법 - Google Patents

무수갈락토스의 분리정제 방법 Download PDF

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WO2012148023A1
WO2012148023A1 PCT/KR2011/003228 KR2011003228W WO2012148023A1 WO 2012148023 A1 WO2012148023 A1 WO 2012148023A1 KR 2011003228 W KR2011003228 W KR 2011003228W WO 2012148023 A1 WO2012148023 A1 WO 2012148023A1
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galactose
anhydrous
separation
anhydrous galactose
algae
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PCT/KR2011/003228
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Inventor
임동중
김경수
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바이올시스템즈 주식회사
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
    • C13K13/007—Separation of sugars provided for in subclass C13K
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the present application relates to a method for separating and purifying anhydrous galactose, and more particularly, anhydrous galactose from sugar mixtures produced by chemical synthesis or hydrolysis using Recycling Preparative Liquid Chromatography (Recycling-Prep-LC). It is about a method of separating.
  • 3,6-AHG is mainly contained in seaweed and is produced in the saccharification process using seaweed as a raw material.
  • the 3,6-AHG produced during the saccharification process is a monosaccharide such as galactose and glucose, which is a saccharification process, and has a very similar chemical structure and molecular weight, so that it can be separated in large quantities with high purity by conventional solvent extraction, adsorption, and chromatography. It is difficult.
  • the separation method of 3,6-AHG is an anion-chromatography method, but it is only a small scale for analysis, and it is low in durability, high raw material price, deterioration of separation efficiency when increasing the separation capacity. There is a problem such as.
  • an object of the present invention is to provide a method for separating and purifying anhydrous galactose from a sugar mixture containing anhydrogalactose produced through chemical synthesis or hydrolysis of polysaccharides.
  • Another object of the present invention is to provide 3,6-anhydrous-L-galactose separated and purified through the above-described separation purification method.
  • preparing a sugar mixture containing anhydrogalactose produced through chemical synthesis or hydrolysis of polysaccharides And separating the anhydrous galactose by performing circulating preparative liquid chromatography (Recycling-Prep-LC) on the sugar mixture.
  • the anhydrous galactose may include 3,6-anhydro-L-galactose (3,6-anhydro-L-galactose), but is not limited thereto.
  • the sugar mixture containing anhydrous galactose may be a saccharified solution obtained through the saccharification process of seaweed, but is not limited thereto.
  • the process of obtaining saccharified solution through the saccharification process of the seaweed may be performed by a method known in the art, for example, as described in the Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0025221 The contents disclosed in the Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0025221 can be incorporated herein by reference in its entirety.
  • the algae may be an algae containing anhydrous galactose or a polymer thereof, but is not limited thereto.
  • the seaweed is Chondrus , Eucheuma , Gigartina , Pterocladia , Hypnea , Iridaea , Kappaphycus , Gellidium , or Gracilaria algae, but is not limited thereto.
  • the saccharified solution may include 3,6-anhydrous-L-galactose and galactose, but is not limited thereto.
  • the step of separating the anhydrous galactose comprises performing one or more repeated cycles of circulating preparative liquid chromatography on the sugar mixture, so as to retain residence between the anhydrous galactose in the sugar mixture and the remaining components. It may include, but is not limited to, performing only an aliquot of anhydrous galactose by increasing the difference in retention time.
  • the circulating preparative liquid chromatography may be equipped with a column having a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 to 2,000, but is not limited thereto.
  • MWCO molecular weight cut-off
  • the circulating preparative liquid chromatography may be performed at a flow rate of 0.1 to 20 ml / min, but is not limited thereto.
  • the circulating preparative liquid chromatography may be, but is not limited to, using an aqueous solvent, for example, water or an alcohol, as the mobile phase.
  • an aqueous solvent for example, water or an alcohol
  • a recycling preparative liquid chromatography by the method according to the above-mentioned method from the sugar mixture containing anhydrogalactose produced through chemical synthesis or hydrolysis of polysaccharides And purified to give purified anhydrous galactose.
  • anhydrous obtained by separation and purification by performing Recycling Preparative Liquid Chromatography on sugar mixtures containing anhydrogalactose produced through chemical synthesis or hydrolysis of polysaccharides.
  • Galactose is provided.
  • the anhydrous galactose may include 3,6-anhydro-L-galactose (3,6-anhydro-L-galactose), but is not limited thereto.
  • the sugar mixture may be a saccharified solution containing a sugar compound obtained through the saccharification process of seaweed, but is not limited thereto.
  • the saccharified solution may include 3,6-anhydrous-L-galactose and galactose, but is not limited thereto.
  • the algae may include anhydrous galactose or a polymer thereof, but is not limited thereto.
  • the seaweeds are Chondrus , Eucheuma , Gigartina , Pterocladia , Hypnea , Iridaea , Kappaphycus , Gellidium , or Gracilaria algae, but is not limited thereto.
  • the step of generating a saccharified solution from the algae may be performed by the saccharification process of seaweed known in the art, for example, the contents disclosed in the Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0025221 It may be performed as, the entire contents disclosed in the Republic of Korea Patent Publication No. 10-2009-0025221 is incorporated herein by reference.
  • the step of producing the saccharification liquid, sulfuric acid, HCl, HBr, HNO 3 , CH 3 COOH, HCOOH, HClO 4 , H 3 PO at a concentration of about 0.05% to about 50% relative to the algae raw 4 , using a hydrolysis catalyst selected from the group consisting of PTSA and a commercial solid acid may include a reaction at a temperature of 60 °C to 300 °C, but is not limited thereto.
  • the saccharified solution may include 3,6-anhydrous-L-galactose and galactose, but is not limited thereto.
  • anhydrous galactose with high purity from hydrolyzate including precursor and similar monosaccharide sugar mixtures, anhydrous galactose, through repeated cycles using circulating preparative liquid chromatography.
  • circulating preparative liquid chromatography By increasing the size of the circulating preparative liquid chromatography, it is possible to manufacture a mass separation and purification process facility of anhydrous galactose, and mass production of anhydrous galactose at low cost is possible.
  • anhydrous galactose can be easily separated and purified from the saccharified solution obtained through the saccharification process of seaweed using the separation purification method according to the present application. Accordingly, the present invention can purify and purify 3,6-anhydrous-L-galactose with high purity in a high purity, which is expected to be useful as a bioactive substance and a medicament.
  • 1 is a flow chart showing a separation process of 3,6-AHG according to an embodiment of the present application.
  • Figure 2 is a graph showing the results of separating 3,6-AHG by performing one and two cycles of circulating preparative liquid chromatography according to an embodiment of the present application.
  • Figure 3 is a graph showing the result of separating 3,6-AHG by performing three and four cycles of circulating preparative liquid chromatography according to an embodiment of the present application.
  • Figure 4 is a graph showing the result of separating 3,6-AHG by performing a circulating preparative liquid chromatography according to an embodiment of the present application.
  • Figure 5 is a graph showing the result of separating 3,6-AHG by performing a circulating preparative liquid chromatography from the algae saccharification liquid according to an embodiment of the present application.
  • a layer or member when a layer or member is located “on” with another layer or member, it is not only when a layer or member is in contact with another layer or member, but also between two layers or another member between the two members. Or when another member is present.
  • the preparing of the sugar mixture (S10) may be performed through various chemical synthesis or hydrolysis processes in which anhydrous galactose may be generated, and for example, sugars including anhydrous galactose through the saccharification process of biomass. Mixtures can be obtained.
  • a variety of known saccharification processes for saccharifying the biomass may be used.
  • a method of saccharifying algae may be used so as to produce saccharified solution.
  • the anhydrous galactose is, for example, 3,6-anhydro-L-galactose (3,6-anhydro-L-galactose) produced during the saccharification process of algae, but 3 can be prepared through a chemical synthesis process, etc.
  • Other anhydrous galactoses such as, 6-anhydrous-D-galactose, are not excluded, but are applicable to the separation of isomers, derivatives and analogs of various galactoses. Separate purification of various anhydroglucose such as 1,6-anhydrous-D-glucose and the like may also be possible in the same manner.
  • the algae is not particularly limited, but seaweeds containing anhydrous galactose or a polymer thereof as a constituent are preferable, and for example, Chondrus and Yukema ( Eucheuma ), Gigartina , Pterocladia , Hypnea , Iridaea , Kappaphycus , Gellidium , and Gracilaria ) Algae, and the like, in particular, red algae such as agar (Agar) may be used.
  • the saccharified solution through saccharification of the seaweed may include 3,6-AHG and galactose.
  • anhydrous galactose is separated from the sugar mixture by performing recycling preparative liquid chromatography (Recycling-Prep-LC) on the sugar mixture (S20).
  • the circulating preparative liquid chromatography refers to a liquid chromatography that is a type of liquid chromatography that can be injected into the column regardless of the number of times by recycling the sample passed through the column without being separated.
  • Liquid chromatography is a generic term for chromatography using liquids as mobile phases.
  • the liquid chromatography is roughly divided into liquid-solid chromatography and liquid-liquid chromatography (also called liquid distribution chromatography). Broader terms include droplet reflow chromatography, emulsion chromatography, and field flow classification.
  • the liquid chromatography includes planar chromatography, such as tube chromatography, thin layer chromatography, and paper chromatography, depending on the shape of the stationary phase.
  • High-performance liquid chromatography (HPLC) is a high-performance device for narrow column chromatography. Today, liquid chromatography is widely used to refer to this. Liquid chromatography has a wider range of applied samples and less thermal stability and volatility than gas chromatography.
  • the circulating preparative liquid chromatography is a method of re-separation by inducing the sample back to the column introduction in the process of separating and eluting the sample through the column. Theoretically, the number of cycles can be increased to infinity, which increases the resolution of the sample, making it possible to apply even the most difficult samples. However, as the degree of separation increases, the sample dilution of the solvent requires optimum conditions for each sample.
  • the optimal separation of unknown samples is column type, eluent rate, sample injection volume, recirculation frequency, etc., and the desired sample can be separated and aliquoted when each of these values is optimized.
  • the circulating preparative liquid chromatography performs retention cycles between anhydrous galactose and the remaining components in the sugar mixture by performing one or more cycles of liquid chromatography on the sugar mixture. It is possible to aliquot only said anhydrous galactose by greatly increasing the difference. Preferably two or more, three or more, four or more, or five or more repetition cycles may be performed, more preferably four or more repetition cycles.
  • the upper limit of the recovery cycle of the repetition cycle is not particularly limited, and the difference in retention time with other components is 5 minutes to 10 Spreading more than a minute can make it very easy to purely collect anhydrous galactose.
  • the column mounted on the circulating preparative liquid chromatography may be equipped with a column having a molecular weight cut-off (MWCO) of about 100 to about 5,000 for separation of anhydrous galactose, particularly 3,6-anhydrous-L-galactose, Preferably a column having a MWCO of about 100 to about 2,000, most preferably a MWCO of about 2,000 can be used.
  • MWCO molecular weight cut-off
  • the flow rate for performing the circulating preparative liquid chromatography may be performed at a flow rate of about 0.1 to about 100 ml / min, preferably at a flow rate of about 0.1 to about 20 ml / min.
  • the large-scale system can set the flow rate accordingly.
  • an aqueous solvent such as water or alcohol may be used, and preferably water may be used as the mobile phase.
  • anhydrous galactose may be separated and purified to a high purity of 99% or more, or 99.9% or more, but is not limited thereto.
  • Anhydrous galactose was prepared in the same manner as in Example 1, except that the saccharified solution containing the sugar compound obtained through the saccharification step of the algae was used instead of the mixture mixture of 3,6-AHG and galactose. Separation and purification were used as a seaweed.
  • the substrate was mixed with 150 ml of a 1% sulfuric acid solution and placed in a 4 l triangle flask and reacted at 121 ° C. for 15 minutes, followed by temperature to room temperature.
  • the obtained saccharified solution was neutralized with CaCO 3 and centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes using a centrifuge (VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea) to remove CaSO 4 .
  • an aqueous sulfuric acid solution 0.5 to 4.0%) containing the substrate according to the S / L ratio (5.5 to 15.0%) was placed in a high pressure reactor, followed by a set temperature range (about 80 ° C to about 200 ° C) for 4 hours.
  • the saccharification reaction was carried out to obtain saccharified solution containing 3,6-AHG and galactose.
  • the saccharification process was performed with reference to that disclosed in Korean Patent Publication No. 10-2009-0025221.
  • Example 1 in one cycle, separation was difficult due to the overlap between two materials, 3,6-AHG and galactose, and the residence time between the two materials was increased during two and three cycles, thereby circulating an aliquot. Separation was possible on liquid chromatography, and 3,6-AHG and galactose were completely separated in four cycles, and the aliquots were separated to obtain high purity (more than 99%) of 3,6-AHG material.

Abstract

무수갈락토스(anhydrogalactose)의 분리정제 방법이 개시된다. 화학합성 또는 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스를 함유하는 당혼합물을 준비하는 단계; 및 상기 당혼합물로 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling-Prep-LC)를 수행하여 무수갈락토스를 분리하는 단계를 포함하는 무수갈락토스의 분리정제 방법을 통하여, 고순도의 무수갈락토스를 효율적으로 대량 분리 및 정제할 수 있다.

Description

무수갈락토스의 분리정제 방법
본원은 무수갈락토스의 분리정제 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling Preparative Liquid Chromatography = Recycling-Prep-LC)를 이용하여 화학합성 또는 가수분해로 생성되는 당혼합물로부터 무수갈락토스를 분리하는 방법에 관한 것이다.
무수갈락토스(anhydrogalactose), 특히 해조류 구성물질인 당류중 하나인 3,6-무수-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose = 3,6-AHG), 3,6-무수-D-갈락토스(3,6-anhydro-D-galactose) 등은 차후 생리활성 물질 개발 및 제약 분야 응용시 유용한 기능성이 예상되는 후보물질이다.
3,6-AHG는 주로 해조류에 많이 포함되어 있으며 해조류를 원료로 이용하는 당화공정상에서 생성된다. 이러한 당화공정 중에 생성된 3,6-AHG는 당화공정산물인 갈락토스 및 글루코스와 같은 단당류로서 화학구조 및 분자량이 매우 유사하여 기존의 용매추출, 흡착, 크로마토그래피 등의 방법에서 고순도로 대량 분리해내기 어렵다.
현재 전세계적으로 3,6-AHG의 생산 및 판매량은 매우 적은 것으로 추정되며 100 mg 당 약 300 달러로 매우 고가로 판매되고 있다.
현재까지 3,6-AHG의 분리방법으로서는 음이온-크로마토그래피법이 있으나, 오직 분석전용의 미량 규모로서 이를 대량규모로 적용하기에는 레진의 낮은 내구성, 높은 원료 가격, 장기간 및 분리용량 증가시 분리효율 저하 등의 문제점을 가지고 있다.
따라서, 무수갈락토스, 그 중에서도 특히 3,6-AHG를 저가로 대량 생산할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있는 실정이다.
본원자들은, 특정 조건 하에서의 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling-Prep-LC)의 반복 사이클을 통하여 유사한 단당류의 혼합물로부터 무수갈락토스를 순수하게 분리할 수 있음을 확인함으로써 본원을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본원의 목적은, 화학합성 또는 다당류의 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스(anhydrogalactose)를 함유하는 당혼합물로부터 무수갈락토스를 분리정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본원의 다른 목적은, 전술한 분리정제 방법을 통하여 분리정제된 3,6-무수-L-갈락토스를 제공하는 것이다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 일 측면에 따르면, 화학합성 또는 다당류의 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스(anhydrogalactose)를 함유하는 당혼합물을 준비하는 단계; 및, 상기 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling-Prep-LC)를 수행하여 무수갈락토스를 분리하는 단계:를 포함하는, 무수갈락토스의 분리정제 방법이 제공된다.
일 구현예에 있어서, 상기 무수갈락토스는 3,6-무수-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에 있어서, 상기 무수갈락토스를 함유하는 당혼합물은 해조류의 당화공정을 통하여 수득된 당화액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 해조류의 당화공정을 통한 당화액 수득 과정은 당업계 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들어, 대한민국특허공개공보 10-2009-0025221에 개시된 내용과 같이 수행될 수 있으며, 상기 대한민국특허공개공보 10-2009-0025221에 개시된 내용 전체는 본원 명세서에 참고로서 포함된다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 해조류는 무수갈락토스 또는 그 중합체가 함유되어 있는 해조류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 해조류는, 진두말속(Chondrus), 유케마속(Eucheuma), 돌가사리속(Gigartina), 개우뭇속(Pterocladia), 히프니아속(Hypnea), 둥근비단속(Iridaea), 카파피쿠스속(Kappaphycus), 우뭇가사리속(Gellidium), 또는 꼬시래기속(Gracilaria) 해조류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 당화액은 3,6-무수-L-갈락토스 및 갈락토스를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 무수갈락토스를 분리하는 단계는, 상기 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피의 1회 이상의 반복 사이클을 수행하여, 상기 당혼합물 중의 무수갈락토스와 그 외 나머지 성분 사이의 체류 시간(retention time)의 차이를 증가시켜 무수갈락토스만을 분취하여 수행되는 것을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 순환 분취 액체크로마토그래피는, MWCO(Molecular Weight Cut-off)가 100 내지 2,000인 컬럼을 장착한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 순환 분취 액체크로마토그래피는 0.1 내지 20 ml/min의 유속(flow rate)으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 순환 분취 액체크로마토그래피는 이동상(mobile phase)으로서 수계 용매, 예를 들어, 물또는 알코올을 용매로 사용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 다른 측면에 따르면, 화학합성 또는 다당류의 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스(anhydrogalactose)를 함유하는 당혼합물로부터 전술한 본원에 따른 방법에 의하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling-Prep-LC)를 수행하여 분리정제된 무수갈락토스가 제공된다.
일 구현예에 있어서, 화학합성 또는 다당류의 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스(anhydrogalactose)를 함유하는 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling Preparative Liquid Chromatography)를 수행함으로써 분리정제되어 수득되는, 무수갈락토스가 제공된다.
다른 구현예에 있어서, 상기 무수갈락토스는 3,6-무수-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 당혼합물은 해조류의 당화공정을 통하여 수득된 당화합물을 함유하는 당화액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 당화액은 3,6-무수-L-갈락토스 및 갈락토스를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 해조류는 무수갈락토스 또는 그의 중합체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 해조류는 진두말속(Chondrus), 유케마속(Eucheuma), 돌가사리속(Gigartina), 개우뭇속(Pterocladia), 히프니아속(Hypnea), 둥근비단속(Iridaea), 카파피쿠스속(Kappaphycus), 우뭇가사리속(Gellidium), 또는 꼬시래기속(Gracilaria) 해조류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 또 다른 측면에 따르면, 해조류 원초 또는 해조류에서 추출한 다당류 물질에 분해효소 및/또는 가수분해 촉매를 처리하여 무수갈락토스 또는 그의 중합체를 포함하는 포함하는 당화액을 생성하는 단계; 및, 상기 당화액에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling Preparative Liquid Chromatography)를 수행하여 무수갈락토스를 분리하는 것:을 포함하는, 해조류로부터 무수갈락토스의 제조 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 해조류로부터 당화액을 생성하는 단계는, 당업계에 공지된 해조류의 당화공정에 의하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 대한민국특허공개공보 10-2009-0025221에 개시된 내용과 같이 수행될 수 있으며, 상기 대한민국특허공개공보 10-2009-0025221에 개시된 내용 전체는 본원 명세서에 참고로서 포함된다.
다른 구현예에 있어서, 상기 당화액을 생성하는 단계는, 상기 해조류 원초에 대해 약 0.05％ 내지 약 50％ 농도의 황산, HCl, HBr, HNO3,CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA 및 상용 고체산으로 구성된 군으로부터 선택되는 가수분해 촉매를 이용하여 60℃ 내지 300℃ 온도에서 반응시키는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에 있어서, 상기 당화액은 3,6-무수-L-갈락토스 및 갈락토스를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본원에 따른 무수갈락토스의 분리정제 방법에 대하여 기재된 내용은 상기 본원에 따른 해조류로부터 무수갈락토스의 제조 방법에 적용되며, 편의 상 중복기재를 생략한다.
본원에 의하여, 순환 분취 액체크로마토그래피를 이용한 반복 사이클을 통하여, 전구체 및 유사한 단당류의 당혼합물, 무수갈락토스를 포함하는 가수분해물로부터 무수갈락토스를 고순도로 분리 및 정제하는 것이 가능하다. 순환 분취 액체크로마토그래피의 대형화를 통하여 무수갈락토스의 대량 분리정제 공정 설비의 제조가 가능하며, 저렴한 비용으로 무수갈락토스의 대량 생산이 가능하다. 또한, 해조류의 당화공정을 통하여 수득된 당화액으로부터 상기 본원에 따른 분리정제 방법을 이용하여 무수갈락토스를 용이하게 분리정제할 수 있다. 이에, 본원에 의하여 생리활성 물질 및 의약으로서 유용한 기능성이 예상되는 3,6-무수-L-갈락토스를 고순도로 대량 분리정제할 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 3,6-AHG의 분리 공정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 순환 분취 액체크로마토그래피를 1회 및 2회 사이클 수행하여 3,6-AHG 를 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 순환 분취 액체크로마토그래피를 3회 및 4회 사이클 수행하여 3,6-AHG 를 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 순환 분취 액체크로마토그래피 수행하여 3,6-AHG 를 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 해조류 당화액으로부터 순환 분취 액체크로마토그래피를 수행하여 3,6-AHG 를 분리한 결과를 나타낸 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 층 또는 부재가 다른 층 또는 부재와 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 층 또는 부재가 다른 층 또는 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 층 또는 두 부재 사이에 또 다른 층 또는 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~ (하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본원의 일 구현예에 따른 무수갈락토스의 분리정제 방법을 상세히 설명한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 화학합성 또는 다당류의 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스(anhydrogalactose)를 함유하는 당혼합물을 준비하는 단계(S10); 및 상기 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling-Prep-LC)를 수행하여 무수갈락토스를 분리하는 단계(S20):를 포함하는, 무수갈락토스의 분리정제 방법이 제공된다.
상기 당혼합물을 준비하는 단계(S10)는, 무수갈락토스가 생성될 수 있는 다양한 화학합성 또는 가수분해 과정을 통하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 바이오매스의 당화공정을 통하여 무수갈락토스를 포함하는 당혼합물이 수득될 수 있다. 여기서, 상기 바이오매스를 당화시키는 공지의 다양한 당화공정을 이용할 수 있으며, 예컨대, 해조류를 당화시켜 당화액을 생성시킬 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기, 무수갈락토스는, 예를 들어, 해조류의 당화과정에서 생성되는 3,6-무수-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)이지만, 화학합성 과정 등을 통해 제조될 수 있는 3,6-무수-D-갈락토스 등의 기타의 무수갈락토스를 배제하는 것이 아니며, 다양한 갈락토스의 이성질체, 유도체 및 유사체의 분리에도 적용이 가능하다. 다양한 무수글루코스, 예컨대, 1,6-무수-D-글루코스 등의 분리 정제 역시 동일한 방법으로 가능할 수 있다.
해조류를 당화시켜 당화액을 생성시키는 경우, 상기 해조류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 무수갈락토스 또는 그의 중합체가 구성 성분으로서 함유되어 잇는 해조류가 바람직하며, 예를 들어, 진두말속(Chondrus), 유케마속(Eucheuma), 돌가사리속(Gigartina), 개우뭇속(Pterocladia), 히프니아속(Hypnea), 둥근비단속(Iridaea), 카파피쿠스속(Kappaphycus), 우뭇가사리속(Gellidium), 및 꼬시래기속(Gracilaria) 해조류 등이 이에 포함될 수 있으며, 특히, 우뭇가사리(agar) 등의 홍조류가 사용될 수 있다. 상기 해조류의 당화를 통한 당화액에는 3,6-AHG 및 갈락토스가 포함되어 있을 수 있다.
상기 당혼합물을 준비한 후, 상기 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling-Prep-LC)를 수행하여 상기 당혼합물로부터 무수갈락토스를 분리(S20)한다.
상기 순환 분취 액체크로마토그래피는 액체크로마토그래피의 한 종류로서 분리되지 않고 컬럼을 통과한 시료를 재순환하여 횟수에 상관없이 컬럼내로 주입시킬 수 있는 액체크로마토그래피를 말한다.
액체크로마토그래피는 이동상(移動相)으로서 액체를 사용하는 크로마토그래피의 총칭이다. 상기 액체크로마토그래피는 액체-고체크로마토그래피와 액체-액체크로마토그래피 (액체분배크로마토그래피라고도 한다) 로 크게 나뉜다. 넓은 뜻으로는 액적역류크로마토그래피, 에멀션크로마토그래피, 필드플로분류와 같은 것까지도 포함된다. 상기 액체크로마토그래피는 고정상(固定相)의 형태에 따라서는 관크로마토그래피, 얇은막크로마토그래피, 종이크로마토그래피와 같은 평면크로마토그래피가 있다. 좁은 뜻의 관크로마토그래피를 고성능 장치화한 것으로 고속액체크로마토그래피(HPLC)가 있는데, 오늘날 액체크로마토그래피라 하면 이것을 가리킬 정도로 널리 보급되어 있다. 액체크로마토그래피는 기체크로마토그래피에 비해 적용 시료의 범위가 넓고 열안정성 및 휘발성도 거의 문제되지 않는다. 저분자·고분자·극성·비극성 등의 모든 시료를 분석 대상으로 삼을 수 있다. 또한 액체크로마토그래피에서는 다양한 이동상을 선택할 수 있고 여러 종류의 상호작용을 분리에 이용할 수 있기 때문에 기체크로마토그래피로 분석할 수 없는 분야나 평면크로마토그래피로 분리능·정량성을 만족할 수 없는 분야에 적용하여 많은 성과를 거두고 있다. 또한 크로마토그래피 본래의 목적인 분취(分取)가 쉽다는 장점이 있다.
상기 순환 분취 액체크로마토그래피는 기존방법인 시료가 컬럼을 통과하여 분리 용출되는 과정에서 이를 다시 컬럼 도입부로 유도시켜 재분리하는 방법이다. 이론상 무한대로 순환횟수를 증가시킬수 있으며 이때 시료에 대한 분리도(resolution)가 증가됨으로써 분리하기 매우 어려운 시료까지 적용가능하다. 그러나 분리도가 증가할수록 용매에 대한 시료희석현상으로 분리정도를 시료마다 최적의 조건이 필요로 한다. 미지의 시료를 최적으로 분리되기위해서는 컬럼종류, 용출액속도, 시료주입량, 재순환횟수 등이며 이 값들의 각각의 최적화된 결과값이 도출될시에 원하는 시료를 분리/분취가 가능하다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 순환 분취 액체크로마토그래피는 상기 당혼합물에 대하여 1회 이상의 액체크로마토그래피의 반복 사이클을 수행함으로써 상기 당혼합물 중의 무수갈락토스와 나머지 성분 사이의 체류 시간(retention time)의 차이를 크게 증가시켜 상기 무수갈락토스만을 분취하는 것이 가능하다. 바람직하게는 2회 또는 그 이상, 3 회 또는 그 이상, 4회 또는 그 이상, 또는 5회 또는 그 이상의 반복 사이클을 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 4회 이상의 반복 사이클을 수행할 수 있다. 상기 사이클의 반복에 따라 다른 물질과의 체류 시간의 차이가 벌어져 무수갈락토스만을 순수하게 분취하는 것이 가능하다면 반복 사이클의 회수 상한은 특별히 제한되지 않으며, 다른 성분과의 체류 시간의 차이가 5분 내지 10분 이상으로 벌어지게되면 무수갈락토스를 순수하게 분취하는 것이 매우 용이하게 될 수 있다.
상기 순환 분취 액체크로마토그래피에 장착되는 컬럼은 무수갈락토스, 특히 3,6-무수-L-갈락토스의 분리를 위하여 MWCO(Molecular Weight Cut-off)가 약 100 내지 약 5,000 인 컬럼을 장착할 수 있으며, 바람직하게는 MWCO가 약 100 내지 약 2,000, 가장 바람직하게는 MWCO가 약 2,000인 컬럼을 사용할 수 있다.
상기 순환 분취 액체크로마토그래피를 수행하는 유속은 약 0.1 내지 약 100 ml/min의 유속(flow rate)으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 ml/min의 유속으로 수행할 수 있다. 예컨대, 3,6-AHG를 분리하는 경우 약 3.5 ml/min의 유속으로 수행할 수 있으며, 대용량 규모의 상기 시스템에서는 그에 맞는 유속을 설정할 수 있다.
상기 순환 분취 액체크로마토그래피의 이동상(mobile phase)으로는 물, 알코올 등의 수계 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물을 이동상으로서 사용할 수 있다.
전술한 본원의 분리정제 방법을 통하여, 해조류 등 다당류의 당화공정 또는 화학합성 과정에서 생성되는, 화학구조 및 분자량이 유사한 다양한 단당류의 혼합물 중에서 분리하고자 하는 특정 무수갈락토스를 선택적으로 분리하는 것이 가능하며, 무수갈락토스의 종류에 따른 적절한 분리조건의 도출을 통하여 고순도의 대량 분리 및 정제가 가능할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 99% 이상, 또는 99.9% 이상의 고순도로 무수갈락토스를 분리정제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본원의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 아래 실시예는 본원을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본원의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
3,6-AHG 및 갈락토스를 포함하는 혼합액으로부터 3,6-AHG의 분리
3,6-AHG 및 갈락토스가 혼합된 혼합액 500 ppm(DW)을 준비하고, 아래 조건의 순환 분취 액체크로마토그래피 방법을 사용하여 분리를 시도하였다:
- W251(MWCO 2,000) 컬럼을 장착한 LC-9101(제조사: JAI) 순환 분취 액체크로마토그래피 장치
- 유속(Flow rate): 3.5 ml/min
- 주입 부피(Injection Vol.): 8 ml(500 ppm)
- 이동상(Mobile phase): 물(18 M)
- Refractive Index: Oven, sensitivity 15
- Chart speed : 150 mm/h
상기 조건 하에서 순환 분취 액체크로마토그래피를 수행하여, 1회 및 2회 사이클에서의 분리 결과를 도 2에 표시하고, 3회 및 4회 사이클에서의 분리 결과를 도 3에 표시하였다.
1회 사이클에서는 상기 분리조건에서 우선 다른 불순물에서부터 분리된 3,6-AHG 및 갈락토스 두 물질간의 겹침으로 분리가 어려웠으며, 2회 및 3회 사이클 과정을 거치면서 상기 두 물질 사이의 체류시간 차이가 5~8 분으로 증대되어 순환 분취 액체크로마토그래피 상에서 분리가 가능해졌으며, 분해능(resolution) 또한 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다. 4회 사이클에서 3,6-AHG와 갈락토스가 완벽히 분리되었으며, 이를 따로 분취하여 99%이상 3,6-AHG 물질을 수득할 수 있었다 [표 1 : 시료 중 성분들 사이의 분리시간 참조].
1회 사이클 이후 2회 및 3회 사이클 결과에서의 3,6-AHG 및 갈락토스 각 물질의 물질 동정을 위해 그래프를 비교한 결과를 도 4에 나타내었다. 사이클의 횟수가 증가할수록 갈락토스와 3,6-AHG의 체류 시간(Retention time)의 격차가 증가됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 정리하여 아래 표 1에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2011003228-appb-T000001
[실시예 2]
당혼합물을 3,6-AHG 및 갈락토스가 혼합된 혼합액이 아닌, 해조류의 당화공정을 통하여 수득된 당화합물을 함유하는 당화액을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해 무수갈락토스를 분리정제하였으며, 해조류로는 꼬시래기를 사용하였다.
구체적으로, 홍조류의 일종인 꼬시래기를 건조하여 파쇄시킨 것을 기질로 사용하여 상기 기질 75 g을 1％ 황산수용액 150 ml와 혼합하여 4ℓ삼각플라스크에 넣어 121℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 상온으로 온도를 내려 수득된 당화액을 CaCO3로 중화하고 원심분리기(VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea)를 이용, 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 CaSO4를 제거하였다. 이어서, 고압반응기에 S/L 비(5.5∼15.0％)에 따른 상기 기질을 포함하는 황산수용액 (0.5∼4.0％)을 넣은 후, 설정된 온도 범위(약 80℃ 내지 약 200℃)와 4 시간 동안 당화 반응을 수행하여 3,6-AHG 및 갈락토오스를 포함하는 당화액을 수득하였다. 상기 당화액 수득 과정은 대한민국특허공개공보 10-2009-0025221에 개시된 것을 참고하여 수행되었다.
이어서, 상기 수득된 당화액을 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 조건 하에서 순환 분취 액체크로마토그래피를 1회 내지 4회 사이클로 분리 정제한 결과를 도 5에 표시하였다.
실시예 1에서와 같이, 1회 사이클에서는 3,6-AHG 및 갈락토스 두 물질간의 겹침으로 분리가 어려웠으며, 2회 및 3회 사이클 과정을 거치면서 상기 두 물질 사이의 체류시간이 증대되어 순환 분취 액체크로마토그래피 상에서 분리가 가능해졌으며, 4 회 사이클에서 3,6-AHG와 갈락토스가 완벽히 분리되었으며, 이를 따로 분취하여 고순도(99% 이상)의 3,6-AHG 물질을 수득할 수 있었다.
상기에서는 본원의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본원의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본원을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. 화학합성 또는 다당류의 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스(anhydrogalactose)를 함유하는 당혼합물을 준비하고;
    상기 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling Preparative Liquid Chromatography)를 수행하여 무수갈락토스를 분리하는 것:
    을 포함하는, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 무수갈락토스는 3,6-무수-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 것인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 당혼합물은 해조류의 당화공정을 통하여 수득된 당화합물을 함유하는 당화액인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 해조류는 무수갈락토스 또는 그의 중합체를 포함하는 것인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 해조류는 진두말속(Chondrus), 유케마속(Eucheuma), 돌가사리속(Gigartina), 개우뭇속(Pterocladia), 히프니아속(Hypnea), 둥근비단속(Iridaea), 카파피쿠스속(Kappaphycus), 우뭇가사리속(Gellidium), 또는 꼬시래기속(Gracilaria) 해조류를 포함하는 것인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 당화액은 3,6-무수-L-갈락토스 및 갈락토스를 포함하는 것인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 무수갈락토스를 분리하는 단계는, 상기 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피의 1회 이상의 반복 사이클을 수행함으로써, 상기 당혼합물 중의 무수갈락토스와 나머지 성분의 체류 시간(retention time)의 차이를 증가시켜 상기 무수갈락토스만을 분취하는 것을 포함하는 것인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 순환 분취 액체크로마토그래피는 MWCO(Molecular Weight Cut-off)가 100 내지 2,000인 컬럼을 이용하여 0.1 내지 20 ml/min의 유속(flow rate)으로 수행되는 것인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 순환 분취 액체크로마토그래피의 이동상(mobile phase)으로서 물 또는 알코올 용매를 이용하는 것인, 무수갈락토스의 분리정제 방법.
  10. 화학합성 또는 다당류의 가수분해를 통해 생성된 무수갈락토스(anhydrogalactose)를 함유하는 당혼합물에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling Preparative Liquid Chromatography)를 수행함으로써 분리정제되어 수득되는, 무수갈락토스.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 당혼합물은 해조류의 당화공정을 통하여 수득된 당화합물을 함유하는 당화액인, 무수갈락토스.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 해조류는 무수갈락토스 또는 그의 중합체를 포함하는 것인, 무수갈락토스.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 해조류는 진두말속(Chondrus), 유케마속(Eucheuma), 돌가사리속(Gigartina), 개우뭇속(Pterocladia), 히프니아속(Hypnea), 둥근비단속(Iridaea), 카파피쿠스속(Kappaphycus), 우뭇가사리속(Gellidium), 또는 꼬시래기속(Gracilaria) 해조류를 포함하는 것인, 무수갈락토스.
  14. 해조류 원초 또는 해조류에서 추출한 다당류 물질에 분해효소 및/또는 가수분해 촉매를 처리하여 무수갈락토스 또는 그의 중합체를 포함하는 포함하는 당화액을 생성하는 단계; 및,
    상기 당화액에 대하여 순환 분취 액체크로마토그래피(Recycling Preparative Liquid Chromatography)를 수행하여 무수갈락토스를 분리하는 것:
    을 포함하는, 해조류로부터 무수갈락토스의 제조 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 당화액을 생성하는 단계는, 상기 해조류 원초에 대해 0.05% 내지 50％ 농도의 황산, HCl, HBr, HNO3,CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA 및 상용 고체산으로 구성된 군으로부터 선택되는 가수분해 촉매를 이용하여 60℃ 내지 300℃ 온도에서 반응시키는 것을 포함하는 것인, 해조류로부터 무수갈락토스의 제조 방법.
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