CN104497058B

CN104497058B - 利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法

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Publication number: CN104497058B
Application number: CN201410704679.2A
Authority: CN
Inventors: 柴永海; 冯颖乐; 吴晶晶; 邓楚翘; 张琦
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN104497058A

Abstract

本发明公开了一种利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法，即在氟载体支载的生物分子合成中，向反应体系中加入聚四氟乙烯粒子，反应过程在液相中进行并可以通过传统手段来监测，反应完后通过改变溶剂以使聚四氟乙烯粒子和氟载体支载的生物分子能通过氟与氟之间的作用力而充分吸附，从而仅通过过滤即可得到目标产物。本发明很大程度结合了“液相反应，固相分离”的优势，实现简单、快速分离纯化氟载体支载的生物分子，避免了F‑SPE分离技术中繁冗的转移步骤，减小了化合物的损失，并且产物纯度较高，所用的聚四氟乙烯粒子不仅价格低廉，可重复使用，而且稳定性高，可以广泛应用于糖、肽、核酸及其它有机化合物的合成中。

Description

利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法

技术领域

本发明属于生物分子的合成技术领域，具体涉及一种利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法。

背景技术

蛋白质、核酸、糖是三大生物大分子，其中蛋白质和核酸在生物体内的作用已为大家所共识。对于糖类化合物，早期人们对其的认知仅停留于能源物质以及结构组成成分的层次上。随着糖生物学的发展，糖的更深层次的作用已陆续被揭示出来。研究表明，糖还是一种信息分子广泛地参与了很多生理过程，如炎症的发生、免疫反应、细胞的增殖、分化、变异过程等等。

对于蛋白质和核酸而言，早在上个世纪后期已经采用固相合成技术实现了自动化合成。即使如此，固相合成寡核苷酸及寡肽过程中仍有很多问题未能解决，包括：(1)反应监测困难；(2)非均相反应体系导致的偶联效率问题；(3)用于支载的树脂价格昂贵且不易回收；(4)由于树脂的溶胀所引起的反应规模有限等等。

由于糖的研究相对滞后，目前能实现寡糖的快速合成的方法主要有一釜合成法以及各种载体(如不溶性树脂、可溶性树脂、离子液体、脂肪链、氟载体等)支载的糖的合成。一釜合成法又包括化学合成法、正交合成法以及“预活化”合成法。一釜合成法不需要对反应中间产物进行分离，从而省去了很多纯化过程而使糖的合成效率大为提高，但是一釜合成法还有各自的优缺点：化学合成法需要将糖模块按照活性由大到小依次投入，因此需要对保护基进行复杂的调节；正交合成法虽然克服了部分化学合成法的缺点，却需要对离去基团进行精细的调控；“预活化”合成法能很好地解决糖的合成问题，但在反应中存在着端基重生以及偶联效率问题。固相合成法属于载体支载的糖的合成范畴，目前在糖的合成中有较多的应用。其优点在于仅需要过滤洗涤即可实现产物及过量反应试剂的分离。然而固相合成由于是在非均相反应体系中进行的，偶联过程对糖基化试剂的需求量较大，此外还存在着监测困难等问题。

氟载体合成法其优点在于反应在均相体系中进行，反应可以按照常规的手段来监测，过量的反应试剂及其它副产品可以通过氟固相分离(F-SPE)技术除去。氟固相分离可以分为标准氟固相分离(Standard F-SPE)和反相氟固相分离(Reverse F-SPE)。标准的氟固相分离技术创始于1997年，该技术分离所需的填料为氟修饰的硅胶。使用前，先以DMF活化氟硅胶，再用80％MeOH/H₂O淋洗柱子。随后，将反应混合物以较少的溶剂如DMF、CH₂Cl₂溶解后，附载于氟硅胶上，依次以憎氟相溶剂(如80％MeOH/H₂O、90％DMF/H₂O、100％DMSO)以及亲氟相溶剂(如MeOH，MeCN，THF)淋洗，分别将非氟化合物和含氟化合物淋洗下来。一次分离完成后，氟柱子只需用丙酮或四氢呋喃淋洗，就可以重复使用。2004年Curran小组首次报道了反相氟固相分离技术。反相柱子中的硅胶为普通的硅胶，同标准氟固相分离技术一样，需要以少量溶剂上样后，再依次以亲氟性相溶剂(如FC-72(全氟环己烷)和乙醚的混合物，或HFE-71000(全氟丁基甲基醚)与乙酸乙酯的混合物)及一般的有机溶剂淋洗，分别将含氟化合物以及非氟化合物淋洗下来。F-SPE技术极大地简化了化合物的分离，但同时存在着一些不可忽略的问题：(1)整个分离过程类似传统的柱色谱分离，需要对样品进行多步的转移，不仅操作较为繁琐，且样品损耗量也较大。(2)常用的标准氟固相分离技术所需的填料为氟化的硅胶，其价格昂贵，难以大规模使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有生物分子(糖、肽、核酸)合成方法的不足，提供一种利用聚四氟乙烯粒子简单、快速分离纯化氟载体支载的生物分子的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：在氟载体支载的生物分子合成过程中，向各阶段偶联或脱保护反应的反应体系中加入聚四氟乙烯粒子，浓缩，加入憎氟相溶剂，搅拌均匀，过滤，再将吸附于聚四氟乙烯粒子上的偶联产物或脱保护产物用有机溶剂解吸下来。

上述聚四氟乙烯粒子的粒径为1～400μm，所述聚四氟乙烯粒子的加入量为各阶段偶联或脱保护反应物总质量的5～50倍。

上述的氟载体可以是单氟链或具有多个侧链的氟载体，本发明中优选结构式如下的氟载体：

式中a为0～3的整数，b为0～2的整数，c为4～7的整数。

上述结构式中，当a为0时，所述氟载体的合成方法如下：

(1)以水为反应介质，将化合物1、环氧氯丙烷、相转移催化剂(具体如四丁基溴化铵、四丁基碘化铵等)、碱(具体如氢氧化钠、氢氧化钾等)按摩尔比为1:0.5～3:0.1～0.6:2～20，在30～80℃下反应3～24小时，结束反应，待反应液冷却至室温后，将反应液倾倒入去离子水中，用乙醚萃取，有机相经无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩、柱色谱分离，得到化合物2，其反应方程如下：

化合物1和化合物2中的b为0～2的整数，c为4～7的整数。

(2)将化合物2与三苯基膦、对羟基苯甲醛、偶氮试剂(具体如偶氮二甲酸二乙酯、偶氮二甲酸二异丙酯等)按摩尔比为1:1～2:1～2:1～2加入非质子性溶剂(具体如甲苯、苯、N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷等)中，在0～150℃下反应3～24小时，将反应液用乙醚稀释后倒入蒸馏水中，用乙醚萃取，有机相依次经无水硫酸钠干燥、浓缩、柱色谱分离，得到化合物3，其反应方程如下：

(3)将化合物3溶解于极性溶剂(具体如乙醇、甲醇、异丙醇等醇类溶剂以及四氢呋喃、乙醚等醚类溶剂)中，加入还原剂(具体如硼氢化钠、氢化铝锂等)，室温搅拌1～5小时，浓缩反应液，以乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:2的混合液为淋洗剂柱色谱分离，得到氟载体，其反应方程式如下：

上述结构式中，当a为1～3的整数时，所述氟载体的合成方法如下：

(1)将化合物2分别与化合物4-1、化合物4-2或化合物4-3按摩尔比为1:1～3溶于有机溶剂(具体如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃等)中，在冰浴冷却条件下滴加路易斯酸(具体如三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟甲磺酸、三氟化硼乙醚等)，反应30～60分钟，用三乙胺淬灭反应，浓缩，柱色谱分离，分别得到化合物5-1、化合物5-2、化合物5-3；

上述的LG代表离去基团，如：Br、Cl、I、-OTs、-OMs、-OTf、-OC(NH)CCl₃；R为-CH₃、-CH₂CH₃等烷基；R’为叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基等羟基保护基。

(2)将化合物5-1、化合物5-2、化合物5-3溶解于有机溶剂(具体如二氯甲烷，氯仿、乙醚、四氢呋喃等)中，加入其摩尔量1～2倍的脱保护试剂(具体如四丁基氟化铵)，-10～50℃反应1～24小时，得到氟载体，反应方程式为：

上述的生物分子为糖、肽、核酸等；所述的憎氟相溶剂是N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、丙酮中任意一种与蒸馏水的混合物；所述的有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯等。

本发明在利用氟载体合成生物分子的过程中，通过改变溶剂来调控聚四氟乙烯粒子与氟载体支载的生物分子之间的作用，使得反应过程在液相中进行并且可以通过传统手段(如TLC、HPLC、¹HNMR、¹³CNMR及MS)来监测，反应完除去溶剂后，加入憎氟相溶剂，以使聚四氟乙烯粒子和氟载体支载的生物分子能通过氟与氟之前的作用力而充分吸附，从而使得纯化过程类似于固相合成法而快速得到目标产物。

本发明所用的聚四氟乙烯粒子不仅价格低廉，可重复使用，而且稳定性高、不参与各种类型的反应，能最大程度结合“液相反应，固相分离”的优势，实现简单、快速分离纯化氟载体支载的生物分子，避免了F-SPE分离技术中繁冗的转移步骤，减小了化合物的损失，并且产物纯度较高，可广泛应用于糖、肽、核酸等生物分子以及其它有机化合物的合成中。

附图说明

图1是实施例1中聚四氟乙烯粒子分离化合物7和柱色谱分离化合物7的分离效果对比图。

图2是实施例2中聚四氟乙烯粒子分离化合物9和柱色谱分离化合物9的分离效果对比图。

图3是实施例2中聚四氟乙烯粒子分离化合物11和柱色谱分离化合物11的分离效果对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

以糖的合成为例，其具体合成路线及合成方法如下：

向827mg(1.31mmol)2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(即化合物6)、390.6mg(0.44mmol)化合物A、12g聚四氟乙烯粒子混合后加入10mL干燥的二氯甲烷中，在0℃下冷却10分钟后，滴加8μL三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)，反应30分钟后，薄层色谱监测反应已完全。将反应用三乙胺淬灭，浓缩除去二氯甲烷，然后加入30mL丙酮与水的体积比为7：3的混合液，搅拌均匀，过滤，再用30mL丙酮与水的体积比为7：3的混合液淋洗以除去22-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯的水解产物以及其它反应试剂(不含氟部分)，再用丙酮将吸附于聚四氟乙烯粒子上的产物解吸下来，浓缩，得到510mg化合物7，其产率为85％。

对比实施例1

在实施例1中，不添加聚四氟乙烯粒子，反应完后的产物采用柱色谱分离。

将实施例1和对比实施例1所得产物采用超导傅立叶数字化核磁共振谱仪进行表征，结果见图1，其中曲线A是对比实施例1所得产物的¹H NMR谱图，曲线B是实施例1中所得化合物7的¹H NMR谱图，曲线C是聚四氟乙烯粒子分离的不含氟部分的¹H NMR谱图。由图1可见，采用聚四氟乙烯分离得到的化合物7峰与柱色谱分离得到的产物的峰一致，且纯度也比较高，而以憎氟相溶剂洗脱下来的化合物中无含氟化合物，证明了聚四氟乙烯粒子能较好地实现氟载体支载的化合物和不含氟化合物之间的分离。

实施例2

以糖的合成为例，其具体合成路线及合成方法如下：

1、将93.5mg(0.15mmol)2,4,6-三-O-苄基-3-O-乙酰基-β-D-半乳糖三氯乙酰亚胺酯、87.4mg(0.05mmol)化合物8及1.8g聚四氟乙烯粒子混合后加入干燥的二氯甲烷中，在冰浴冷却条件下滴加0.1mL 0.05mol/L TMSOTf的二氯甲烷溶液，反应30分钟后，将反应用三乙胺淬灭，浓缩除去二氯甲烷，加入10mL丙酮与水的体积比为7：3的混合液，搅拌均匀，过滤，再用10m丙酮与水的体积比为7：3的混合液淋洗以除去过量的2,4,6-三-O-苄基-3-O-乙酰基-β-D-半乳糖三氯乙酰亚胺酯的水解产物及其它反应试剂(不含氟部分)，再用丙酮将吸附于聚四氟乙烯粒子上的产物解吸下来，浓缩，得到110mg化合物9，其产率为99％。所得产物与不添加聚四氟乙烯粒子而采用柱色谱法分离得到的产物分别进行核磁表征，结果见图2，其中曲线A是柱色谱分离所得产物的¹H NMR谱图，曲线B是所得化合物9的1HNMR谱图，曲线C是聚四氟乙烯粒子分离的不含氟部分的¹H NMR谱图。由图2可见，采用聚四氟乙烯粒子分离得到的化合物9峰与柱色谱分离得到的产物的峰一致，且纯度也比较高，而以憎氟相溶剂洗脱下来的化合物中无含氟化合物，证明了聚四氟乙烯粒子能较好地实现氟载体支载的化合物和不含氟化合物之间的分离。

2、将110mg化合物9及1.3g聚四氟乙烯粒子混合后加入5mL干燥的四氢呋喃中，在搅拌条件下，向该混合物中滴加0.1mL 0.12mol/L甲醇钠的甲醇溶液，室温搅拌5小时后，TLC检测反应完全，浓缩除去四氢呋喃，加入10mL丙酮与水的体积比为1：2的混合液，搅拌均匀，过滤，再用20mL丙酮与水的体积比为1：1的混合液淋洗，再用丙酮将吸附于聚四氟乙烯粒子上的产物解吸下来，浓缩，得到107mg化合物10，其产率为98％。

3、将107mg(0.049mmol)化合物10与75mg(0.1mmol)2-三氯乙酰基-3-O-乙酰丙酰基-4,6-O-苄基-α-D-2-脱氧-半乳糖三氯乙酰亚胺酯按照步骤1的方法进行偶联，得到120mg化合物11，其产率为86％。所得产物与不添加聚四氟乙烯粒子而采用柱色谱法分离得到的产物分别进行核磁表征，结果见图3，其中曲线A是柱色谱分离所得产物的¹H NMR谱图，曲线B是所得化合物11的¹H NMR谱图，曲线C是聚四氟乙烯粒子分离的不含氟部分的¹H NMR谱图。由图3可见，采用聚四氟乙烯分离得到的化合物11峰与柱色谱分离得到的产物的峰一致，且纯度也比较高，而以憎氟相溶剂洗脱下来的化合物中无含氟化合物，证明了聚四氟乙烯粒子能较好地实现氟载体支载的化合物和不含氟化合物之间的分离。

实施例3

以胸腺五肽的合成为例，其具体合成路线及合成方法如下：

1、将377mg(0.42mmol)化合物B、250mg(0.54mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH及7.9g聚四氟乙烯粒子混合后加入10mL干燥的二氯甲烷中，冰浴冷却10分钟后，加入149mg(0.78mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐及5.4mg(0.04mmol)4-二甲氨基吡啶，在冰浴至室温条件下反应3.5小时后，浓缩除去二氯甲烷，加入10mL丙酮与水的体积比为13：7的混合液，搅拌均匀，过滤，再用30mL丙酮与水的体积比为13：7的混合液淋洗以除去过量的氨基酸及缩合剂，再用丙酮将吸附于聚四氟乙烯粒子上的产物解吸下来，浓缩，得到547mg偶联产物，薄层色谱显示产物较为纯净，经计算其产率为97％。

2、向步骤1的偶联产物与5.5g聚四氟乙烯粒子的混合物中滴加20mL 0.1mol/L四丁基氟化铵的N,N-二甲基甲酰胺溶液，搅拌15分钟，然后加入20mL蒸馏水并搅拌均匀，过滤，水洗，再用丙酮将吸附于聚四氟乙烯粒子上的产物解吸下来，浓缩，得到462mg脱保护产物，其产率为99％。

3、将步骤2中的脱保护产物、182.1mg(0.54mmol)Fmoc-val-OH及10g聚四氟乙烯粒子混合后加入20mL干燥的二氯甲烷中，冰浴冷却10分钟后依次加入202mg苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、83.5mg(0.62mmol)1-羟基苯并三氮唑以及186μL二异丙基乙基胺，反应3.5小时后，薄层色谱监测反应完全，浓缩除去二氯甲烷，加入20mL丙酮与水的体积比为13：7的混合液并搅拌均匀。过滤，再以30mL丙酮与水的体积比为13：7的混合液淋洗以除去过量的氨基酸及缩合剂，再用丙酮将吸附于聚四氟乙烯粒子上的产物解吸下来，浓缩，得到576mg偶联产物，其产率为96％。

4、按以上步骤2及3依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，得到516.1mg胸腺五肽(未脱保护)，总产率为55％，经高分辨质谱测试，ESI-MSC₉₈H₁₁₉F₂₆N₉O₁₉S(M+Na)⁺理论值：2251.7928，实测值：2252.7936。

上述实施例中的氟载体也可以是能采用FSPE分离的其他单氟链或具有多个侧链的氟载体替换，均可采用本发明的方法，利用聚四氟乙烯粒子快速分离纯化氟载体支载的生物分子。

Claims

1.一种利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法，其特征在于：在氟载体支载的生物分子合成过程中，向各阶段偶联或脱保护反应的反应体系中加入聚四氟乙烯粒子，浓缩，加入憎氟相溶剂，搅拌均匀，过滤，再将吸附于聚四氟乙烯粒子上的偶联产物或脱保护产物用有机溶剂解吸下来；

上述氟载体的结构式如下所示：

式中a为0～3的整数，b为0～2的整数，c为4～7的整数；

上述的生物分子为糖或肽。

2.根据权利要求1所述的利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法，其特征在于：所述的聚四氟乙烯粒子的加入量为各阶段偶联或脱保护反应物总质量的5～50倍。

3.根据权利要求1所述的利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法，其特征在于：所述聚四氟乙烯粒子的粒径为1～400μm。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法，其特征在于：所述的憎氟相溶剂是N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、丙酮中任意一种与蒸馏水的混合物。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的利用聚四氟乙烯粒子合成氟载体支载的生物分子的方法，其特征在于：所述的有机溶剂为四氢呋喃、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯中的任意一种。