KR101569210B1

KR101569210B1 - 갈락토오스의 대사 이용율을 증대시키는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물

Info

Publication number: KR101569210B1
Application number: KR1020080106278A
Authority: KR
Inventors: 유병조; 박재찬; 구현민; 진용수; 이기성
Original assignee: 삼성전자주식회사; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2008-10-29
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2015-11-23
Also published as: KR20100047407A; JP2010104357A; US8722388B2; EP2184357A1; US20100105573A1; EP2184357B1

Abstract

과발현시 갈락토오스의 대사 이용성을 증대시킬 수 있는 유전자에 관한 기술을 제공한다. 구체적인 예에서, 과발현시 갈락토오스의 대사 이용성을 증가시키는 유전자로서, SNR84 유전자를 제공한다. SNR84 유전자는 과발현됨으로써 갈락토오스의 대사율을 증가시킬 수 있으므로, 갈락토오스를 함유하는 탄소원으로부터 바이오알코올의 생산성을 크게 증가시킬 수 있다.

Description

갈락토오스의 대사 이용율을 증대시키는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물 {Gene Increasing Metabolic Availability of Galactose, Recombinant Vector and Recombinant Microorganism Containing the Same}

갈락토오스 대사 이용율을 증대시키는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 과발현시 갈락토오스(galactose) 대사 이용성을 증대시키는 유전자로서, SNR84 유전자에 관한 것이다.

전세계적으로 화석 연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환경오염에 대한 우려가 증가함에 따라 안정적이고 지속적으로 에너지를 생산하는 신재생 대체에너지 개념이 화두가 되고 있다. 그러한 대체에너지 개발의 일환으로 바이오매스로부터 에너지를 생산하는 기술이 주목 받고 있다.

바이오매스란 태양광을 이용하여 이산화탄소를 고정하는 탄소동화과정, 즉 광합성 과정을 통하여 생합성되는 당류 및 이를 포함하는 생물체 전반을 일컫는다.

이러한 바이오매스의 제공원료로서 최근 해조류(Algae)에 대한 관심이 고조되고 있다. 일부 해조류는 자연적으로 기름을 생산하고 축적하며, 해조류의 에너지 전환 공정에서 발생하는 질소 산화물들과 이산화탄소를 흡수하고 이용함으로써 폐기물을 처리할 수도 있다. 이와 같은 반응은 이산화탄소의 포획을 돕고 기후 변화의 확산을 방지하는 데 일조한다. 특수한 해조류 종들은 오일 함유량이 매우 높고 쉽게 추출될 수 있으며, 현재 이용할 수 있는 기술들을 사용하여 처리하고 정제하면 수송용 액체 연료들로 전환될 수 있기 때문에 해조류는 차세대 바이오연료의 잠재적 원료로서 높게 평가되고 있다.

잠재적 원료로서의 해조류가 주는 다른 장점들은 풍부하고 빠르게 성장한다는 점이다. 또한, 해조류는 성장을 위하여 이산화탄소를 소비하고 산소를 배출하기 때문에 에너지 생산과 환경문제 해결이라는 두 가지를 모두 해결할 수 있다는 장점을 지니고 있으나 아직은 널리 생산·이용되지 못했다.

한편, 해(홍)조류 유래 바이오매스의 가수분해물에는 갈락토오스가 풍부하게 존재한다. 따라서, 효모를 이용한 해(홍)조류 유래 바이오매스 가수분해물의 유용물질로의 전환을 위한 생물공정의 구현을 위해서는 가수분해물에 다량 함유되어 있는 갈락토오스의 효과적인 이용이 선행되어야 한다.

자연계에 존재하는 효모의 경우 갈락토오스를 대사하지만 그 대사속도는 포도당에 비하여 현저히 낮다는 한계가 있다.

이에, 종래 갈락토오스 대사경로 및 그 조절 유전자의 교란에 의하여 갈락토오스의 이용성을 증대시키려는 기술이 시도되었다. 즉, 기능이 알려진 특정 유전 자의 과발현 또는 제거에 의한 갈락토오스의 대사 이용성을 증진시키려는 시도만이 이루어져 왔다. 그러나, 현재 규명된 극소수의 유전자 이외에는 갈락토오스의 대사 이용성 관련 원인 유전자를 전체 게놈 (genome) 수준에서 규명할 수 없었기 때문에 충분한 해결책이 되지 못하고 있다.

과발현시 갈락토오스의 이용성을 증대시키는 신규 유전자를 발굴하고, 이를 이용하여 형질 전환된 효모를 사용하여 갈락토오스 함유 탄소원으로부터 바이오알코올의 생산성을 증대시키고자 한다.

또한, 갈락토오스의 대사 이용성을 증진시키는 다양한 원인 유전자를 한 번에 규명할 수 있는 게놈수준의 시스템 생명공학 기법을 고안하려는 것이다.

하나의 실시예에 따르면, 과발현시 갈락토오스(galactose) 대사 이용성을 증대시키는 유전자는 SNR84 유전자이다.

상기 유전자는 서열번호: 1로 기재되는 염기서열을 가지는 것일 수 있다.

또 다른 실시예에 따르면, 상기 SNR84 유전자를 포함하는 재조합 벡터이다.

상기 벡터는 구체적으로 플라스미드일 수 있으며, 더욱 구체적인 예에서, 도 4에 개시된 개열지도를 갖는 플라스미드로서 pRS424일 수 있다.

또 다른 실시예는, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질 전환된 재조합 미생물이다.

상기 미생물은 효모일 수 있는 바, 구체적인 예에서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 파키솔렌(Pachysolen) 속, 클라비스포라(Clavispora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 디베리오마이세스(Debaryomyces) 속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 속, 캔디다(Candida) 속, 피키아(Pichia) 속, 및 데케라(Dekkera) 속으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 예에서, 기탁번호 KCTC 11388 BP 로 기탁된 S. 세레비시애인 재조합 미생물을 제공한다.

또 다른 일 실시예는 미생물을 이용하여 갈락토오스 함유 탄소원으로부터 바이오알코올을 생산하는 방법으로서, 갈락토오스 이용성을 향상시키기 위해 상기 SNR84 유전자, 상기 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는 바이오알코올 생산 방법이다.

이 때, 상기 유전자가 과발현됨으로써 바이오알코올 생산성 증대가 일어날 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에는 과발현시 갈락토오스 대사 이용율을 증대시키는 효모 내 원인 유전자를 선별하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 선별 방법을 제공한다.

trp를 포함하는 멀티 카피 플라스미드를 이용하여 효모의 게놈 DNA 라이브러 리를 구축하는 단계(이하, 단계(1)로 약칭하기도 한다);

상기에서 구축된 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 효모를 형질전환시켜 효모의 모든 유전자가 과발현되는 형질전환 효모 라이브러리를 제조하는 단계(이하, 단계(2)로 약칭하기도 한다);

상기에서 제조된 형질전환 효모 라이브러리를 갈락토오스를 유일 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하고, 연속 계대배양(Serial subculture)을 통해 거대 콜로니를 형성하는 갈락토오스의 이용성이 증대된 형질전환 효모를 선별하는 단계(이하, 단계(3)으로 약칭하기도 한다); 및

상기에서 선별된 형질전환 효모로부터 플라스미드를 분리하여, 분리된 플라스미드에 삽입된 효모 유전자 서열을 확인하는 단계(이하, 단계(4)로 약칭하기도 한다).

상기 단계(1)에서 효모는 S. 세레비시애 CEN.PK2-1D일 수 있고, 상기 멀티 카피 플라스미드는 pRS424일 수 있다.

하나의 예에서, 상기 단계(4) 이후에 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다.

(i) 효모의 게놈 염기서열과 플라스미드에 도입된 삽입유전자(insert)의 양쪽 말단에 존재하는 소정 길이의 유전자 서열을 비교하여 도입 유전자의 효모 게놈 상의 위치를 추적하여 과발현된 유전자를 확인하는 단계;

(ii) 확인된 유전자를 포함하는 플라스미드로 효모를 다시 형질전환시켜 갈락토오스의 이용성 증대가 상기 유전자의 과발현에 의한 것임을 확인하는 단계; 또는

(iii) 상기 단계 (i) 및 (ii) 모두.

일 실시예에서는 또한 상기의 선별 방법으로 선별된 과발현시 갈락토오스 이용성을 증대시키는 유전자를 제공한다.

상기 유전자는 SNR84 일 수 있다.

상기 유전자 SNR84는 서열번호: 1로 기재되는 염기서열을 가질 수 있다.

이상 설명한 바에 따르면, SRN84 유전자가 과발현된 재조합 미생물은 갈락토오스의 대사율을 증가시킬 수 있어서, 갈락토오스를 함유하는 탄소원으로부터 바이오알코올의 생산성을 크게 증가시킬 수 있으므로, 산업적 효용가치가 우수하다.

이하, 상기 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 실시예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 실시예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다.

1. SNR84 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물

일 실시예에서는, 과발현시 갈락토오스(galactose) 대사 이용성을 증대시키는 유전자로서, SNR84 유전자를 제공한다.

상기 SNR84는 rRNA의 큰 서브유닛(large subunit)의 슈도우리딘 화(pseudouridylation) 염기변형에 관여하는 것으로 알려진 H/ACA 미세인 RNA (small nucleolar RNA; snoRNA) 이다. 본 출원의 발명자들은 이러한 SNR84가 과발현되는 효모를 이용하는 경우 놀랍게도 갈락토오스의 대사 이용성이 현저히 증가되는 것을 최초로 확인하였다.

그 이유는 명확히 밝혀진 것은 아니지만, rRNA의 큰 서브유닛의 슈도우리딘화를 수행하는 SNR84의 기능이 활성화됨으로써, rRNA의 성숙(maturation) 속도 및 양을 증대시킬 것으로 예상된다. 이에, 초기 대수기(exponential phase)에서 mature rRNA가 빠르게 형성된다면 대부분의 효소들의 생성속도가 빠르게 변할 것이고, 그에 따라 갈락토스 대사 관련 효소들과 이와 관련된 효소들 역시 다량으로 신속하게 만들어지기 때문으로 추측된다.

상기 갈락토오스는 분자식 C₅H₁₂O₆로 표현되는 알도헥소오스의 일종으로서, 효모에 의해 갈락토오스-1-인산을 거쳐 글루코오스-1-인산이 된 후 발효과정을 거쳐 대사됨으로써 알코올로 분해된다. 이러한 갈락토오스의 대사 과정에서 갈락토오스의 소모시간 대비 알코올의 생산 농도를 바이오알코올의 생산성으로 표현한다. 따라서, 갈락토오스의 대사 이용성 증대는 다른 측면에서 바이오알코올의 생산성 증대로 받아들여질 수 있다.

상기 갈락토오스(galactose) 대사에 관여하는 유전자, 즉, 갈락토오스 대사 유전자는 예를 들어, gal2, gal1, gal7, gal10, gal5 (pgm1, pgm2) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

하나의 예에서, 상기 SNR84은 서열번호: 1로 기재되는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호: 1로 기재되는 염기서열과 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고, 서열상동성이 적어도 60% 이상이거나, 또는 85% 이상, 또는 95% 이상인 서열일 수 있다. 여기서, '서열 상동성을 갖는 서열'이란 약간의 서열 변이를 갖지만 서열 기능이 동일한 염기서열을 의미하고, '서열변이'란 하나 또는 복수의 염기가 결실, 치환, 또는 부가된 경우를 의미한다.

또 다른 실시예에 따르면, 상기 SNR84 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

용어, "벡터"란 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는 데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 이용 가능한 벡터로는 박테리아 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

벡터의 일종인 "플라스미드"는 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, "바이러스 벡터"는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다.

상기 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 "플라스미드"라고 표현된 경우 "벡터"를 뜻하는 용어로서 서로 바꾸어 쓸 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있음은 물론이다.

상기 발현 벡터는 효모에서 발현 가능하고 유전자 재조합이 가능한 것으로서, 이러한 발현 벡터의 예로는 2 마이크론, pBM272, pBR322-6, pBR322-8, pCS19, pDW227, pDW229, pDW232, pEMBLYe23, pEMBLYe24, pEMBLYi21, pEMBLYi22, pEMBLYi32, pEMBLYr25, pFL2, pFL26, pFL34, pFL35, pFL36, pFL38, pFL39, pFL40, pFL44L, pFL44S, pFL45L, pFL45S, pFL46L, pFL46S, pFL59, pFL59+, pFL64-, pFL64+, pG6, pG63, pGAD10, pGAD424, pGBT9, pGKl2, pJRD171, pKD1, pNKY2003, pNKY3, pNN414, pON163, pON3, pPM668, pRAJ275, pRS200, pRS303, pRS304, pRS305, pRS306, pRS313, pRS314, pRS315, pRS316, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, pRS423, pRS424, pRS425, pRS426, pRSS56, pSG424, pSKS104, pSKS105, pSKS106, pSZ62, pSZ62, pUC-URA3, pUT332, pYAC2, pYAC3, pYAC4, pYAC5, pYAC55, pYACneo, pYAC-RC, pYES2, pYESHisA, pYESHisB, pYESHisC, pYEUra3, rpSE937, YCp50, YCpGAL0, YCpGAL1, YCplac111, YCplac22, YCplac33, YDp-H, YDp-K, YDp-L, YDp-U, YDp-W, YEp13, YEp213, YEp24, YEp351, YEp352, YEp353, YEp354, YEp355, YEp356, YEp356R, YEp357, YEp357R, YEp358, YEp358R, YEplac112, YEplac181, YEplac195, YIp30, YIp31, YIp351, YIp352, YIp353, YIp354, YIp355, YIp356, YIp356R, YIp357, YIp357R, YIp358, YIp358R, YIp5, YIplac128, YIplac204, YIplac211, YRp12, YRp17, YRp7, pAL19, paR3, pBG1, pDBlet, pDB248X, pEA500, pFL20, pIRT2, pIRT2U, pIRT2-CAN1, pJK148, pJK210, pON163, pNPT/ADE1-3, pSP1, pSP2, pSP3, pSP4, pUR18, pUR19, pZA57, pWH5, pART1, pCHY21, pEVP11, REP1 ,REP3, REP4, REP41, REP42, REP81, REP82, RIP, REP3X, REP4X, REP41X, REP81X, REP42X, REP82X, RIP3X/s, RIP4X/s, pYZ1N, pYZ41N, pYZ81N, pSLF101, pSLF102, pSLF104, pSM1/2, p2UG, pART1/N795, pYGT 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. (http://genome-www2.stanford.edu/vectordb/vector.html, http://pingu.salk.edu/~forsburg/vectors.html 참조)

하나의 예에서, 상기 플라스미드는 도 4에 개시된 개열지도를 갖는 플라스미드 pRS424 일 수 있다.

상기 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 본 발명에서 기술되는 유전자에 의해 코딩된 융합 단백질 또는 펩타이드 등의 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다. 경우에 따라, 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 함유할 수 있다.

상기 프로모터 서열은 원핵 또는 진핵 또는 바이러스 기원일 수 있다. 효모에 적절한 프로모터는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 벡터는 추가적인 조절 서열을 포함할 수 있다. 적절한 조절 서열의 예는 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열이 대표적이다. 또한, 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포를 선별하는 데 필요한 적절한 마커를 포함할 수 있다. 숙주의 형질전환은 당업계에 널리 알려진 다양한 기술 및 Sambrook 의 문헌에 기술되어 있는 기술 중 하나를 사용하여 이루어질 수 있다.

또 다른 실시예는, 상기 SNR84 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질 전환된 재조합 미생물이다.

구체적으로, SNR84 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질 전환된 재조합 미생물로서, SNR84 유전자가 과발현되어 갈락토오스(galactose) 대사 이용성을 증대시키는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 미생물은 박테리아, 곰팡이, 효모를 포함한 당업계에 공지된 것이라면 어느 것이나 사용될 수 있다.

하나의 예에서, 상기 미생물은 효모일 수 있는 바, 구체적인 예에서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 파키솔렌(Pachysolen) 속, 클라비스포라(Clavispora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 디베리오마이세스(Debaryomyces) 속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 속, 캔디다(Candida) 속, 피키아(Pichia) 속, 및 데케라(Dekkera) 속으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이러한 재조합 효모 균주는, SNR84 유전자가 과발현됨으로써 포도당 및 갈락토오스 혼합당 또는 갈락토오스를 유일 탄소원으로 하는 배지에서 갈락토오스를 빠르게 바이오알코올로 전환할 수 있다. 이는 SNR84 유전자의 과발현이 갈락토오스를 탄소원으로 할 때 세포의 성장을 향상시키는 것으로 사료된다. 이러한 갈락토오스의 이용성의 증대는 곧 갈락토오스를 탄소원으로 하는 모든 생물공정의 생산성의 향상을 가져올 수 있다.

상기 효모의 형질전환 방법은 통상의 형질전환 방법이므로, 본 발명이 속하 는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시가능하다. 예를 들어, 상기 재조합 벡터의 효모로의 형질전환 과정은 통상적인 방법(Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.)에 따라 실시될 수 있다.

구체적인 예에서, S. 세레비시애 CEN.PK2-1D에 이종 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환하기 위하여 spheroplast transformation kit (Bio 101, Vista, CA) 사용할 수 있고, 형질전환주는 20g/l의 포도당이 함유된 YSC (yeast synthetic complete) medium에서 배양될 수 있으며 이후 갈락토스 대사능이 향상된 균주의 선별을 위하여 4% 갈락토스가 함유된 YSC medium에서 연속배양 후 같은 평판고체 배지에서 선별할 수 있다.

또 다른 측면에서, 기탁번호 KCTC 11388 BP로 기탁된 재조합 미생물을 제공한다.

상기 기탁된 재조합 미생물은 갈락토오스 이용성이 우수한 균주를 선별한 것으로, 대한민국 대전시 유성구에 소재한 한국생명공학연구원 유전자은행에 2008년 09월 04일자로 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK2-1D/pRS424-SNR84으로 명명하여 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11388 BP를 부여받았다.

2. 바이오연료 생산 방법

일 실시예는 미생물을 이용하여 갈락토오스 함유 탄소원으로부터 바이오연료 를 생산하는 방법에 있어서, 갈락토오스 이용성을 향상시키기 위해 상기 유전자, 상기 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 미생물을 이용하는 바이오연료 생산 방법이다.

이 때, 상기 SNR84 유전자가 과발현됨으로써 바이오알코올 등의 바이오연료의 생산성 증대가 일어날 수 있다. 즉, 상기 바이오연료 생산 방법에 따르면, SNR84 유전자의 과발현에 의해 갈락토오스 대사 유전자의 발현이 촉진됨으로써, 갈락토오스 함유 탄소원으부터 갈락토오스를 빠르게 바이오연료로 전환할 수 있다.

상기 바이오연료의 예로는 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 바이오알코올 또는 아세톤을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 갈락토오스 함유 탄소원은 예를 들어, 갈락토오스와 글루코오스의 혼합 배지 또는 갈락토오스만으로 이루어진 배지일 수 있다. 상기 갈락토오스와 글루코오스의 혼합 배지에서 혼합 비율은 특별히 제한되지 않으며, 갈락토오스의 비율이 40% 이상 또는 50% 이상일 수 있다.

본 발명자들이 수행한 실험에 따르면, 상기 SNR84 유전자의 과발현에 의해 갈락토오스 함유 배지에서 바이오알코올의 생산성 (Volumetric productivity)이 기존의 효모 균주에 비해 현저히 증대되었음을 확인하였다.

상기 갈락토오스 함유 탄소원은 조류 바이오매스의 가수분해물일 수 있다.

상기 조류는 특별히 제한되지 않으며, 홍조류(예를 들어 김(Porphyra yezoensis Ueda), 갈조류(예를 들어 다시마(Laminariaceae 과의 조류), 미역(Undaria pinnatifida) 또는 톳(Hizikia fusiforme)) 및 녹조류(예를 들어 파 래(Enteromorpha 속))를 포함할 수 있다.

상기 홍조류는 예를 들어 우뭇가사리 (Gelidium amansii), 꼬시래기(Gracilaria verrucosa), 김파래 (Bangia atropurpurea), 둥근돌김 (Porphyra suborbiculata), 방사무늬김 (Porphyra yezoensis), 납작갈라가라(Galaxaura falcate), 외흐늘풀 (Scinaia japonica), 애기우뭇가사리 (Gelidium divaricatum), 왕우뭇가사리 (Gelidium pacificum), 혹돌잎 (Lithophylum okamurae), 낭과쩍 (Lithothammion cystocarpideum), 넓은게발(Amphiroa anceps), 고리마디게발 (Amphiroa beauvoisii), 참산호말 (Corallina officinalis), 작은구슬산호말 (Corallina pilulifera), 방황게발혹 (Marginisporum aberrans), 부채까막살 (Carpopeltis prolifera), 참지누아리 (Grateloupia filicina), 참도박 (Grateloupia elliptica), 개도박 (Grateloupia lanceolanta), 미끌지누아리 (Grateloupia turtuturu), 꿩꼬리풀 (Phacelocarpus japonicus), 불등풀가사리 (Gloiopeltis furcata), 참가시우무 (Hypnea charoides), 갈고리가시우무 (Hypnea japonitca), 사이다가시우무 (Hypnea saidana), 주름진두발 (Chondrus cripspus), 돌가사리 (Chondracanthus tenellus), 잎꼬시래기 (Gracilaria textorii), 마디잘록이 (Lomentaria catenata), 엇가지풀 (Heterosiphonia japonica), 개서실 (Chondria crassicaulis), 참보라색우무 (Symphyocladia latiuscula) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

해조류 바이오매스를 이용하여 바이오알코올을 생산하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예시적으로 홍조류 바 이오매스를 이용하는 방법을 살펴보면, 홍조류를 직접 당화시키는 직접 당화 공정과, 홍조류로부터 우무 또는 섬유소를 추출한 후, 상기 추출물을 당화시켜 갈락토오스 또는 글루코오스를 얻는 간접 당화 공정 등을 들 수 있다. 상기 당화 공정은 갈락토시다아제 효소 등을 이용한 효소 가수분해법 또는 산가수분해용 촉매를 사용하는 산가수분해법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 당화 공정을 통해 획득한 갈락토오스 또는 글루코오스는 소정의 미생물 발효를 통해 에탄올, 부탄올 등의 바이오 알코올 또는 아세톤을 제조할 수 있다.

이와 같이, 자연계에 풍부하게 존재하는 해조류 바이오매스를 이용하여 바이오 연료를 제조하는 경우 원료 수급이 안정적이고 생산 효율이 매우 우수하다는 장점이 있다.

3. 유전자 선별 방법

또 다른 실시예에 의하면, 과발현시 갈락토오스 대사 이용율을 증대시키는 효모 내 원인 유전자를 선별하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 선별 방법을 제공한다.

(1) trp를 포함하는 멀티 카피(multi copy) 플라스미드를 이용하여 효모의 게놈 DNA 라이브러리를 구축하는 단계;

(2) 단계(1)에서 구축된 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 효모를 형질전환시켜 효모의 모든 유전자가 과발현되는 형질전환 효모 라이브러리를 제조하는 단계;

(3) 단계(2)에서 제조된 형질전환 효모 라이브러리를 갈락토오스를 유일 탄소원 으로 포함하는 배지에서 배양하고, 연속 계대배양(Serial subculture)을 통해 거대 콜로니를 형성하는 갈락토오스의 이용성이 증대된 형질전환 효모를 선별하는 단계; 및

(4) 단계(3)에서 선별된 형질전환 효모로부터 플라스미드를 분리하여, 분리된 플라스미드에 삽입된 효모 유전자 서열을 확인하는 단계.

이와 관련하여, 도 1에는 유전자 선별 방법이 모식적으로 도시되어 있다. 도 1을 참조하여 상기 유전자 선별 방법을 구체적으로 살펴본다.

구체적인 예에서, 상기 단계(1)에서 효모의 게놈 DNA 라이브러리를 제조하는 과정은 Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 게놈 DNA를 제한효소 등을 이용하여 절단하는 과정, 절단된 DNA 단편을 Multi-copy 플라스미드(pRS424)에 도입하는 과정, 및 제조된 플라스미드를 대장균(E. coli)에서 증폭시키는 과정으로 이루어질 수 있다.

상기 단계(2)는 형질전환 효모 라이브러리를 제조하는 과정으로서, 상기 효모로의 형질전환 과정은 통상적인 방법(Ito, H., Y. Fukuoka, K. Murata, A. Kimura (1983) Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bacteriol. 153, 163-168.)에 따라 실시될 수 있다.

상기 단계(3)에서는 연속 계대배양(Serial subculture)을 통해 거대 콜로니를 형성하는 갈락토오스의 이용성이 증대된 형질전환 효모를 선별한 후, 단계(4)에 서는 거대 콜로니로부터 분리된 형질전환 효모로부터 플라스미드에 삽입된 유전자 서열을 확인한다. 이 때, 유전자 서열의 확인은 Gel documentation (gel doc) 장치 또는 Hydra 장치 등을 이용하여 수행될 수 있다.

하나의 예에서, 상기 선별 방법은 상기 단계(4) 이후에 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다.

(iii) 상기 단계 (i) 및 (ii) 모두.

이에 따라, 단계(4)에서 선별된 유전자를 명확히 하고, 이에 의해 갈락토오스의 이용성 증대가 유발되는 것임을 재차 확인할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 또한 상기의 선별 방법으로 선별된 과발현시 갈락토오스 이용성을 증대시키는 유전자를 제공한다.

상기 유전자는 SNR84 일 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열번호: 1로 기재되는 뉴클레오티드 염기서열을 가지는 유전자일 수 있다.

이하, 본 발명의 하나의 실시예에 따라 본 발명을 상술한다.

[실시예 1] 과발현시 갈락토오스 대사 이용율을 증대시키는 유전자 선별

multi-copy 플라스미드(pRS424)를 이용하여 S. cerevisiae CEN.PK2-1D 게놈 DNA 라이브러리를 제조하였다. 제조된 게놈 라이브러리를 효모에 형질전환 시킴으로써 효모 내 모든 유전자가 과발현되는 형질전환 효모 라이브러리를 제조하였다. 그런 다음, 갈락토오스를 유일탄소원으로 포함하는 배지에서 구축된 형질전환 효모 라이브러리를 배양하고, 연속 계대배양법을 이용하여 갈락토오스의 이용성이 증대된 형질전환 효모를 선별하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 갈락토오스의 이용성이 증대된 #2, 5, 34, 37, 40 효모 균주 중 #40의 형질전환 효모로부터 플라스미드를 분리하여 클로닝에 사용된 제한효소 양 옆의 알려진 유전자서열 정보를 이용하여 분리된 플라스미드에 도입된 효모유전자 서열을 확인하였다. 그런 다음, 효모의 게놈 염기서열과 플라스미드에 도입된 삽입유전자의 양쪽 말단에 존재하는 소정 길이의 유전자 서열을 비교하여 도입 유전자의 효모 게놈 상의 위치를 추적하여 과발현된 유전자를 확인하였다. 그 결과 #40의 효모 균주에 도입된 유전자 서열은, 도 3에 도시된 바와 같이, 효모의 4번 염색체 중 1492241에서 1494948염기 서열이고, 여기에 SNR84유전자 서열이 포함되어 있음을 확인하였다. 이에, SNR84유전자가 갈락토오스의 이용성 증대에 관여한 것인지 여부를 확인하기 위해, SNR84유전자를 포함하는 플라스미드로 효모를 다시 형질전환시켜 갈락토오스의 이용성 증대가 상기 유전자의 과발현에 의한 것임을 확인하였다.

[실시예 2] 갈락토오스 대사 이용율 평가

SNR84를 포함하는 효모(S. cerevisiae) 4번 염색체 1492241에서 1494948염기를 multi-copy 플라스미드를 이용하여 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (MATalpha; ura3-52; trp1-289; leu2-3_112; his3 D1; MAL2-8C; SUC2) 균주에 형질 전환하고, 4% 갈락토오스를 포함하는 최소배지에서 20시간 경과 후 갈락토오스의 대사이용성을 관찰하기 위해 에탄올의 생성을 관찰하였고, 그 결과를 도 5 및 6과 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

대조군의 경우 주어진 갈락토스를 다 소모하는데 28시간이 걸렸고 이 때 에탄올 농도가 17g/l였다. 또한, 20시간 경과 후의 대조군 균주는 약 14 g ethanon/L를 생산하고 8 g/L의 갈락토오스를 남겼다. 반면에, snr84과발현 균주의 경우 20시간에 모든 갈락토스를 소모하였고, 이 때 에탄올 농도가 18 g/l였다.

즉, SRN84 유전자가 과발현된 균주는 대조군 균주에 비해 갈락토오스의 분해속도가 현저히 향상되고, 에탄올의 생산 농도 역시 증가하였는 바, 에탄올의 생산성이 무려 48% 증가하였다.

도 1은 본 발명의 실시예에 의한 유전자 선별 방법을 나타낸 모식도이다;

도 2는 도 1에 따른 방법으로 선별된 다양한 효모 균주의 연속 배양시 에탄올의 생성량을 나타낸 그래프이다 (5ml YSC containing 4% galactose for 20h);

도 3 은 SNR84를 포함하는 효모의 4번 염색체 증폭 유전자 지도이다 (효모 게놈 (Chromosome IV) 1492241~ 1494948);

도 4 는 본 발명의 실시예에 따른 플라스미드 pRS424의 개열지도이다;

도 5 및 6은 본 발명의 실시예 2에서 SNR84에 의한 4% 갈락토오스 배지에서 발효능 향상 효과를 관찰한 그래프이다 (도 5: 대조군 균주, 도 6: SNR84 형질전환 균주).

<110> SAMSUNG ELECRONICS CO., LTD. SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Gene Increasing Metabolic Availability of Galactose, Recombinant Vector and Recombinant Microorganism Containing the Same <130> 2008pp684 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 550 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> snr gene <400> 1 attgcacaac ttaagtttgt cgaggatcat ttttttgaac tgaatcatgc tctttttaag 60 tgctttgaaa ccctcgatga atgtgtcaat gtgcaaagat aaaccattgt tctctgttga 120 tcagtgactt aatgtttgct ttggagaatg atattttccc tttcctatat ttgacttttg 180 ttctaaaagt tatttggaga gaaaaggcat gattgaggtt gcgacttttt cgtttttgct 240 tttgcatgga taattcatcc atgcacatct cactttattg gaccttcaag attggtttcc 300 catgtaattt aattttctct cctctacatt taatatgttc tatattaatt aataccaatt 360 gagttgtgcg tacttcattg cagatatttt accagacctg tctgagtttt tcgttcaagt 420 ttggttgaaa tcggcttgag gtatatgaac gtggttggga tatggagatt gggagatcaa 480 agaagcgaaa atacctgaga cagttttttt aaaaaagaag ctaaggaaca tgactcaaag 540 agacacatta 550

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
야생형과 비교하여 SNR84 유전자를 과발현하도록 형질 전환된 갈락토오스 대사 이용성이 증대된 재조합 효모.
제 6 항에 있어서, 상기 SNR84 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질 전환된 재조합 효모.
제 7 항에 있어서, 상기 SNR84 유전자는 서열번호: 1의 염기서열로 구성된 재조합 효모.
제 7 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 파키솔렌(Pachysolen) 속, 클라비스포라(Clavispora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 디베리오마이세스(Debaryomyces) 속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 속, 캔디다(Candida) 속, 피키아(Pichia) 속, 및 데케라( Dekkera) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 재조합 효모.
제 6 항에 있어서, 기탁번호 KCTC 11388 BP의 CEN.PK2-1D/pRS424-SNR84인 재조합 효모.
제6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 효모를 이용하여 갈락토오스 함유 탄소원으로부터 에탄올을 생산하는 방법.
삭제
삭제
제 11 항에 있어서, 상기 갈락토오스 함유 탄소원은 갈락토오스를 40% 이상 포함하는 에탄올을 생산하는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제