KR101690289B1

KR101690289B1 - 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 알코올 생산성 형질전환 균주 및 이를 이용한 알코올의 제조방법

Info

Publication number: KR101690289B1
Application number: KR1020100025395A
Authority: KR
Inventors: 구현민; 박성민; 서진호; 박재찬; 박용철
Original assignee: 삼성전자주식회사; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-03-22
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2016-12-28
Also published as: KR20110106145A

Abstract

알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 알코올 생산성 균주 및 이를 이용한 알코올의 생산방법에 관한 기술로서, 특정한 단리된 폴리뉴클레오티드가 호스트셀 내에서 과발현됨으로써 호스트셀의 알코올 발효저해물에 대한 저항성이 증대되므로 알코올 발효시 생산성이 증대될 수 있다.

Description

알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 알코올 생산성 형질전환 균주 및 이를 이용한 알코올의 제조방법 {Isolated Polynucleotides Increasing Tolerance For Alcohol Fermentation Inhibitive Compound, Recombinant Vector and Alcohol Producing Transformed Cell Containing the Same, and Method of Producing Alcohol Using the Same}

알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 알코올 생산성 균주 및 이를 이용한 알코올의 생산방법에 관한 기술을 제공한다.

전세계적으로 화석 연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환경오염에 대한 우려가 증가함에 따라 안정적이고 지속적으로 에너지를 생산하는 신재생 대체에너지 개념이 화두가 되고 있다. 그러한 대체에너지 개발의 일환으로 바이오매스 자원으로부터 알코올을 생산하는 기술이 가장 주목을 받고 있다.

현재 사탕수수 등의 당질계, 옥수수 등의 전분계를 이용한 제 1 세대 바이오연료(Biofuel)가 생산되고 있다. 또한, 지구상에서 가장 풍부하고 고갈 없이 재생이 가능한 자원으로 대표되는 목질자원 리그노셀룰로오스(lignocelluloses)를 이용한 제 2 세대 바이오연료가 개발 중에 있다. 최근에는 해조류(marine algae)를 이용한 바이오연료의 개발이 역시 진행 중에 있다.

이러한 바이오연료를 제조하는 과정은 통상 바이오매스를 당화공정에 적용이 용이하도록 전처리하는 과정, 전처리된 바이오매스를 당화하여 단당체로 전환하는 당화과정, 및 단당체를 발효하여 알코올을 제조하는 발효과정으로 이루어진다.

상기 발효과정은 일반적으로 효모 등의 발효 미생물을 이용한 유기 화합물의 생물학적 산화를 이용한다. 이러한 미생물의 물질대사는 미생물의 종과 환경 조건에 의존하여 다양한 다른 메커니즘을 통해 일어날 수 있다. 모든 종속 영양 세균은 가장 일반적으로 산화되는 화합물인 탄수화물(특히 글루코오스), 지방 및 단백질 등의 유기 화합물의 산화로부터 에너지를 얻는다.

알코올 발효에 널리 이용되는 미생물의 다양한 유전적 교란을 통하여 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증가시킴으로써 높은 성장율 및 항상성을 발휘하는 균주를 개발하고자 한다. 또한, 알코올 생산시 우수한 발효능 및 발효유지능을 발휘하는 균주를 이용함으로써 높은 알코올 생산성을 발휘하는 생산방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증가시키는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 상기 알코올 발효저해물은 푸르푸랄, 5-하이드록시메틸-2-푸랄데하이드(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되며, 서열번호 1 내지 13 로 이루어진 군에서 선택된 염기서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터는 예를 들어 상술한 단리된 폴리뉴클레오티드, 발현 조절서열 및 헥소오스 트랜스포터 7(HXT7) 프로모터가 작동가능하게 융합된 플라스미드일 수 있다.

또한 본 발명의 일 측면에 따르면, 알코올 발효저해물을 포함하는 리그노셀룰로오스의 가수분해물로부터 에탄올을 생산하는 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 갖는 알코올 생산성 형질전환 균주를 제공한다.

상기 형질전환 균주는 서열번호 1 내지 13 로 이루어진 군에서 선택된 염기서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 염기서열로 이루어진 유전자 또는 그 절편이 하나 이상 발현증가(upregulate) 및/또는 과발현된 균주이다.

상기 알코올 발효저해물은 푸르푸랄 및 5-하이드록시메틸-2-푸랄데하이드(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF) 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

이러한 형질전환 균주는 상술한 재조합 벡터가 도입되어 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

상기 형질전환 균주는 알코올 발효저해물을 포함하는 배지에서 동일한 조건 하에서 배양되었을 때 야생형 균주에 비해 세포성장의 유도기(lag phase)가 단축된다.

또한, 알코올 발효저해물을 포함하는 배지에서 동일한 조건 하에서 배양되었을 때 야생형 균주 대비 퍼센트 에탄올 생산속도 (percent ethanol product rate)가 증가한다.

상기 형질전환 균주는 (i) 기탁번호 KCTC11642BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE001; (ii) 기탁번호 KCTC11643BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE002; (iii) 기탁번호 KCTC11644BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE003; (iv) 기탁번호 KCTC11645BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae)CEN.PK2-1D/pLJE004; (v) 기탁번호 KCTC11646BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE005; (vi) 기탁번호 KCTC11647BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-ROG1; (vii) 기탁번호 KCTC11648BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-PEP4; (viii) 기탁번호 KCTC11649BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-SNF1; (ix) 기탁번호 KCTC11650BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-KIP2; (x) 기탁번호 KCTC11651BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-SKO1; (xi) 기탁번호 KCTC11652BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-RSP5; (xii) 기탁번호 KCTC11653BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-ROD1; 및 (xiii) 기탁번호 KCTC11654BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-TRP1; 중에서 선택될 수 있다.

상기 형질전환 균주는 바이오매스로부터 얻은 알코올 발효저해물 함유 리그노셀룰로오스의 가수분해물을 포함하는 배지에서 배양되어 알코올을 생산할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드는 알코올 발효저해물에 대한 내성을 갖는 단백질을 코딩하므로 이를 포함하는 호스트셀은 발효저해제에 의한 알코올 생산율 저하를 방지하고 발효에서 균주의 항상성(Homeostasis)을 높일 수 있다. 따라서, 이를 산업적 알코올 발효에 사용함으로써 알코올 생산성 향상을 도모할 수 있어서, 산업적 효용가치가 우수하다.

도 1은 내성유전자 절편 도입에 따른 재조합 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D의 세포성장곡선이다 (형질전환 벡터 ○: pRS424(HMF 미첨가), ●: pRS424(2g/L HMF첨가), ◆: pLJE001(2g/L HMF첨가), ■: pLJE002(2g/L HMF첨가), ●: pLJE003(2g/L HMF첨가), ▲: pLJE004(2g/L HMF첨가), ▼: pLJE0005(2g/L HMF첨가));
도 2는 대조군 1로서 내성유전자가 없는 플라스미드 p426HXT로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 푸르푸랄이 없는 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다(+: DCW, ●: 글루코오스, ■: 푸르푸랄, ◆: 에탄올, ▲: 아세트산);
도 3은 대조군 2로서 내성유전자가 없는 플라스미드 p426HXT로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다(+: DCW, ●: 글루코오스, ■: 푸르푸랄, ◆: 에탄올, ▲: 아세트산);
도 4 내지 8은 플라스미드 pLJE001내지 5가 도입된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애를 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다 (도 4: pLJE001, 도 5: pLJE002, 도 6: pLJE003, 도 7: pLJE004, 도 8: pLJE001, +: DCW, ●: 글루코오스, ■: 푸르푸랄, ◆: 에탄올, ▲: 아세트산, ★: 글리세롤);
도 9는 내성유전자 ROG1이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE001를 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다(+: DCW, ●: 글루코오스, ■: 푸르푸랄, ◆: 에탄올, ▲: 아세트산, ★: 글리세롤, 이하 같다);
도 10은 내성유전자 PEP4가 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE002를 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 11은 내성유전자 TRP1이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE008를 푸르푸랄이 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 12는 대조군 3으로서 내성유전자가 없는 플라스미드 p426HXT로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다(+: DCW, ●: 글루코오스, ■: HMF, ◆: 에탄올, ▲: 아세트산, ★: 글리세롤, 이하 같다);
도 13는 내성유전자 ROG1이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE001를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 14은 내성유전자 PEP4가 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE002를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 15은 내성유전자 SNF1이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE003를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 16은 내성유전자 KIP2이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE004를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 17은 내성유전자 Sko1이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE005를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 18은 내성유전자 RSP5이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE006를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 19은 내성유전자 ROD1이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE007를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다;
도 20은 내성유전자 TRP1이 과발현된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 LJE008를 HMF가 첨가된 배지에서 성장시킨 회분식 배양결과이다.

이하, 본 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 실시예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 실시예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 명세서 및 청구항에 사용된 성분, 반응 조건 등의 수치을 나타내는 모든 숫자는 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반된 언급이 없다면, 본 발명의 명세서 및 첨부된 청구항에 나타난 수적인 파라미터는 본 발명의 목적하는 바에 따라 달라질 수 있는 근사값이다.

본 발명에서 사용된 용어는 별도의 언급이 없다면 하기와 같은 의미를 갖는다. 또한, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서에서 별도의 언급이 없다면 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 비변형(non-modified) 또는 변형된(modified) RNA 또는 DNA 등의 모든 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일- 또는 이중 가닥, 또는 단일- 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 3중 가닥 영역을 포함한다. 또한 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

용어 "단리된(isolated)"은 천연 상태로부터 인간에 의해 변경된 것, 즉 천연 환경으로부터 변화 및/또는 제거되었음을 의미한다. 예를 들면, 유기체에 본태적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니나, 천연 상태의 공존 물질로부터 단리된 동일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이다. 나아가, 형질전환(transformation), 유전적 조작 또는 모든 다른 재조합 방법에 의해 유기체 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 유기체 내에 존재할지라도 "단리된" 것이다.

용어 "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산이 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합을 통해 결합된 펩티드 또는 단백질을 의미한다. "폴리펩티드"는 펩티드, 올리고펩티드 또는 올리고머 등의 단쇄 및 단백질 등의 장쇄를 모두 포함한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. "폴리펩티드"는 천연적 방법 또는 당업계에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-라이보실화, 아미드화, 비오틴화, 플라빈의 공유 부착, 헴(heme) 부분의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 사이클화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커(anchor) 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 가수분해 가공, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레오일화, 황화, 아르기닐화와 같이 아미노산의 단백질에 대한 전달-RNA 매개 첨가 및 유비퀴틴화를 포함한다 (문헌[Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, NewYork, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in Post-translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors" , Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990] 및 [Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging" , Ann NY Acad Sci, 663,48-62, 1992] 참조).

폴리뉴클레오티드 서열의 "절편(fragment)"은 서열 목록에 나타낸 대조 서열보다 짧은 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 폴리펩티드 서열의 "절편"은 대조 서열보다 짧으나 대조 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드 서열을 지칭한다.

"변종(variant)"은 대조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상이하나, 이의 본질적 성질을 유지하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 전형적인 변종은 대조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이하다. 변종 뉴클레오티드 서열에서의 변화는 대조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시킬 수도 있고 아닐 수도 있다. 뉴클레오티드 변화는 아미노산 치환, 첨가, 결실, 대조서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에서의 융합 및 절단을 일으킬 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변종은 대조 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 대조 폴리펩티드 및 변종의 서열의 변화는 제한적이어서 전반적으로 유사하고 많은 영역에서 동일하다. 변종 및 대조 폴리펩티드의 아미노산 서열은 1 이상의 치환, 삽입, 결실의 모든 조합일 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전적 코드에 의해 코딩될 수 있거나 코팅될 수 없다. 전형적인 보존적 치환은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe 및 Tyr을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변종은 대립유전자와 같이 자연적으로 발생할 수 있거나, 또는 천연적으로 발생한다고 알려지지 않은 변종일 수 있다. 천연적으로 발생하지 않은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변종은 돌연변이 발생 기술에 의하거나 또는 직접 합성에 의해 제조할 수 있다. 또한, 변종으로는 글리코실화, 포스포릴화, 메틸화, ADP 라이보실화 등과 같은 1 이상의 후해독 변경을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 변종은 스플라이스 변종, 대립유전자 변종, 및 단일 염기 변이(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

용어 "엄중 조건(stringent condition)"은 약 42℃의 6 X SSC/0.1 % SDS 중에서 약 2.5 시간 동안 철야 인큐베이션한 후에, 65℃의 1.0 X SSC/0.1 % SDS 중에서 필터를 세척하는 것이다.

용어 "상동성(Identity)"은 서열을 비교하여 측정되는 2 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계를 반영한다. 일반적으로, 상동성은 비교되는 서열의 길이에 걸쳐 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 일치를 지칭한다. 2 이상의 서열의 상동성 및 유사성의 비교 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 프로그램 BESTFIT 및 GAP와 같은 위스콘신 서열 분석 패키지 버전 9.1 (Wisconsin Sequence Analysis package, version 9.1; Devereux J etal, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984, 미국 위스콘신주 매디슨 소재 제네틱스 컴퓨터 그룹으로부터 입수가능)을 사용하여 2개의 폴리뉴클레오티드 간의 %상동성 및 2개의 폴리펩티드 서열 간의 %상동성 및 %유사성을 측정할 수 있다.

BESTFIT는 Smith 및 Waterman의 "국소 상동성" 알고리즘 [J Mol Biol, 147, 195-197, 1981]을 사용하여 2 서열 간의 최선의 단일 유사성 영역을 발견한다. BESTFIT는 길이가 유사하지 않은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열을 비교하는데 더욱 적합하고, 상기 프로그램은 더 짧은 서열이 더 긴 부분을 나타낸다고 추정한다.

GAP는 2 서열을 정렬하여 Neddleman 및 Wunsch의 알고리즘 [J Mol Biol, 48, 443-453, 1970]에 따라 "최대 유사성"을 발견한다. GAP는 대략 동일 길이인 서열을 비교하는데 더욱 적합하고, 정렬은 전체 길이에 걸친 것으로 예상된다. 바람직하게는 각 프로그램에서 사용되는 갭 중량 및 길이 중량은 각각 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 50 및 3, 폴리펩티드 서열에 대하여 12 및 4이다.

또 다른 서열 간의 상동성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 프로그램으로는, BLAST 프로그램 패밀리 (Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재 National Center for Biotechnology Information(NCBI)로부터 입수가능하고 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 NCBI의 홈페이지를 통하여 접근가능함) 및 FASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 19988, 위스콘신 서열 분석 팩키지의 일부로 입수가능함)를 들 수 있다.

용어 "알코올 내성이 증가"한다는 것은 호스트셀의 알코올에 대한 저항성이 증가했다는 것을 의미한다. 알코올 내성 증가는 MIC (Minimum Inhibitory Concentration)에서 셀 성장률, 최종 셀농도, 레그 시간(lag time)의 감소율을 야생형 셀 또는 대조군 셀(공벡터(empty vector)로 변형된 개체)과 비교하여 관찰될 수 있다.

발효저해물

리그노셀룰로오스계 바이오매스는 크게 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌 등으로 구성되어 있다. 이를 발효 가능한 가수분해물인 글루코오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스 등으로 전환시키기 위해서는 우선 물리ㆍ화학ㆍ생물학적 전처리가 필요하다.

전처리 공정에서 가장 널리 쓰이고 있는 약산을 이용한 가수분해공정의 경우 셀룰로오스의 탈수화반응(dehydration)을 통하여 5-하이드록시메틸-2-푸랄데하이드(HMF), 자일로오스와 아라비노오스 등에서 2-푸랄데하이드(furfural) 등의 부산물이 생성된다.

HMF와 푸르푸랄의 농도는 바이오매스의 종류와 가수분해공정에 따라서 다르지만, HMF의 경우 전나무에서 최대 5.9g/L, 푸르푸랄의 경우 corn stover에서 최대 11g/L, 일반적으로 2g/L 내외의 양으로 생성된다.

HMF와 푸르푸랄은 세포에 작용하여 다양한 생리적 현상을 저해하는데 그 메커니즘은 아직 규명되어 있지 않지만, HMF와 푸르푸랄의 처리로 인해 세포 내 ATP와 NAD(P)H 농도가 낮아지고, 직접적인 효소활성의 저해 등의 현상이 세포 내에서 관찰된다. 이러한 저해현상을 극복하기 위해서 세포는 내부에너지를 세포의 복구에 이용, 조효소의 추가적인 소모 및 재생산 등에 의해서 세포 성장 및 에탄올 생산능력이 떨어진다.

구체적으로 HMF와 푸르푸랄의 생리적 저해도에 있어서 에탄올 생산효율은 최대 12%, 생산성은 40~80%가 낮아지며 세포성장에 있어서 15g/L의 HMF, 6g/L의 푸르푸랄에서 생장이 이루어지지 않는다. 또한 1.0 g/L HMF에 대해서 세포성장의 유도기(lag phase)가 4시간 연장되고, 1.2g/L HMF와 1.0g/L 푸르푸랄을 동시에 처리할 경우 24시간 연장된다.

따라서, 알코올을 생산하기 위해서 리그노셀룰로오스계 자원에서 유래한 부산물인 HMF와 푸르푸랄에 대한 내성균주의 개발이 필요하다.

알코올 생산용 균주인 S. 세레비시애에서 알데하이드 형태인 HMF와 푸르푸랄은 각각 HMF 알코올과 푸르푸랄 알코올 등의 알코올 형태로 전환되어 무해화(detoxification)되는데, 이러한 반응을 촉매하는 효소는 NAD(P)H를 조효소로 이용한다. 이와 같이 HMF와 푸르푸랄의 내성과 관련된 효소는 NAD(P)H의 공급 및 이용과 관련되어 있기 때문에 NAD(P)H의 공급을 원활히 할 경우 HMF와 푸르푸랄의 무해화 메카니즘이 활성화될 것으로 예상된다.

이에, 게놈 라이브러리를 이용하여 HMF와 푸르푸랄에 대한 내성유전자를 선별하고 내성유전자 시퀀스를 확보하며, 내성유전자의 효모발현용 벡터시스템을 구축하고, 이로 형질전환된 재조합 사카로마이세스 세레비지애를 제조하고자 한다.

단리된 폴리뉴클레오티드

알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증가시키는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 알코올 발효저해물은 2-푸랄데하이드(푸르푸랄), 5-하이드록시메틸-2-푸랄데하이드(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

하나의 예에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 13 로 이루어진 군에서 선택된 염기서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함한다. 이외에도, 상기 폴리뉴클레오티드의 절편, 폴리뉴클레오티드의 변종, 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 엄중 조건 하에서 하이브리딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 로부터 유래된 것일 수 있다. 그러나, 타 생물 유래의 폴리뉴클레오티드라고 할지라도 기능적으로 동등하고 유전적으로 관련이 있는 것이라면 본 발명의 예에 동일하게 적용될 수 있을 것이다.

이러한 단리된 폴리뉴클레오티드는 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단백질을 코딩하므로 이를 포함하는 호스트셀은 고농도 알코올 발효저해물 존재 하에서 항상성이 우수하다. 따라서, 이를 산업적 알코올 발효에 사용함으로써 알코올 생산성 향상을 도모할 수 있다.

사카로마이세스 세레비시애의 게놈 라이브러리를 이용하여 세포생장 억제물질인 발효저해물에 대한 내성을 갖는 5종의 유전자 절편 및 8종의 유전자를 선별하였다. 사카로마이세스 세레비지애의 게놈 라이브러리의 제조방법은 하기에서 별도로 설명한다.

선별된 유전자 절편 및 유전자는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

[표 1]

이와 같이 선별된 유전자 또는 유전자 절편으로 형질전환된 균주는 상대적 세포농도가 대조군에 비해 2배 이상 높게 나타났다.

상기에서 서열번호 6 내지 13의 유전자가 각각 암호화하는 단백질은 하기 표 2와 같다.

[표 2]

본 발명에 예시된 단리된 폴리뉴클레오티드는 호스트셀의 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증가시키는 단백질을 코딩한다. 따라서, 본 발명의 예시에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 호스트셀을 이용하는 경우 호스트셀의 성장 속도가 증가될 수 있다.

상기 알코올 발효저해물에 대한 저항성은 호스트셀의 세포성장 시간에 따른 세포농도를 통해 파악될 수 있으며, 세포농도는 세포건조중량(Dry Cell Weight; DCW) 등의 성장지표를 통해 관찰될 수 있다. 즉, 세포건조중량의 증가하는 시점 이전의 유도기(lag phase) 시간이 단축되었는지 여부를 통해 파악될 수 있다.

또는, 알코올 발효저해물에 대한 저항성이 높은 경우 세포성장이 대조군에 비해 높게 나타날 수 있으므로 상대적 세포성장 회복시간을 통해 관찰될 수 있다. 이는 발효시작에서 특정 세포농도까지 도달하는 시간을 대조군과 상대적으로 비교함으로써 파악할 수 있고, 이 때 대조군은 발효저해물을 포함하지 않는 배지에서 성장한 세포일 수 있다.

본 발명에서 예시하고 있는 다양한 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 합성 폴리뉴클레오티드 또는 시험관 내에서(in vitro) 조작된 기타 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자 생성물을 제조하기 위해 를 사용될 수 있다. 예를 들어, 클로닝된 폴리뉴클레오티드가 적합한 발현 벡터(예를 들어 플라스미드) 내로 삽입되고, 상기 플라스미드는 적합한 호스트셀을 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 호스트셀을 '재조합 호스트셀'로 표현할 수 있다. 또한 상기 유전자를 재조합 호스트셀에서 발현시켜 예를 들어 '재조합 단백질'을 생산할 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 비-코딩되는 기능(예: 프로모터, 복제 원인, 리보솜-결합 부위 등)을 포함할 수 있다.

게놈 라이브러리의 제조 및 유전자 선별

예시적인 사카로마이세스 세레비지애의 게놈 라이브러리의 제조방법은 다음과 같다.

먼저, 사카로마이세스 세레비지애의 게놈 라이브러리를 제조한다.

게놈 라이브러리를 구축하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 (i) 야생형 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 제한효소 등을 이용하여 절단하는 과정, (ii) 절단된 DNA 절편을 멀티카피 플라스미드에 도입하는 과정, 및 (iii) 제조된 플라스미드를 증폭시키는 과정으로 이루어질 수 있다. 구체적인 예에서, 사카로마이세스 세레비지애의 염색체를 분리한 후 NotI 제한효소를 이용하여 자르고, Klenow fragment 효소를 처리해서 잘려진 염색체 라이브러리 간의 자가-연결(self-ligation)을 방지한다. 사카로마이세스 세레비지애용 발현벡터인 pRS424 를 NotI 제한효소를 이용하여 자른 후 Klenow fragment 효소를 처리한다. 이후 사카로마이세스 세레비지애 염색체의 라이브러리와 잘려진 pRS424 벡터를 혼합한 후 유전자 리가아제를 이용하여 각 유전자를 pRS424 벡터와 결합시킨다. 게놈 라이브러리의 제조를 위한 발현벡터는 pRS424 이외에도 하기 항목 '재조합 벡터'에서 서술하는 바와 같은 다양한 벡터가 이용될 수 있다.

그런 다음, 제조된 게놈 라이브러리를 효모에 형질전환하여 효모 내 모든 유전자가 과발현되는 형질전환 균주 라이브러리를 제조한다. 상기 형질전환 과정은 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다. 구체적인 예에서, 게놈 라이브러리가 결합된 벡터 pRS424를 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에 형질전환하여 사카로마이세스 세레비지애 라이브러리를 제조한다.

마지막으로, 제조된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 라이브러리를 푸르푸랄 및 HMF를 포함하는 고체한정배지에서 순수배양 후 세포를 성장시키고 대조군(야생형 균주 또는 공벡터가 도입된 균주)에 비해 빠른 성장을 나타내는 균주를 선별함으로써 발효저해물 내성 균주를 1차 선별한다. 또한, 1차 선별된 균주들이 초기 대수기가 되도록 맞춘 다음 푸르푸랄 및 HMF를 포함하는 액체배지에서 순수배양한 후 세포 흡광도 측정을 통해 2차 선별을 수행할 수 있다. 선별된 형질전환 사카로마이세스 세레비지애로부터 플라스미드를 분리하여 클로닝에 사용된 제한효소 양 옆의 알려진 유전자서열 정보를 이용하여 단리된 플라스미드에 도입된 서열을 확인한다. 이 때, 서열의 확인은 Gel documentation (gel doc) 장치 또는 Hydra 장치 등을 이용하여 수행될 수 있다.

필요에 따라, 야생형 사카로마이세스 세레비지애 유전자 서열과 플라스미드에 도입된 삽입 부위(Insert)의 양 말단 유전자 서열을 비교하여 벡터에 도입된 정확한 유전자를 확인하는 과정, 및/또는 상기 확인된 유전자를 포함하는 플라스미드를 다시 야생형 사카로마이세스 세레비지애에 형질전환하여 알코올 발효저해물에 대한 내성이 단리된 폴리뉴클레오티드에 포함된 유전자의 교란에 의한 것임을 재확인하는 과정을 더욱 거칠 수 있다.

재조합 벡터

일 예에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 벡터(vector)는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 제조물을 의미한다. 여기서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 한 부분의 작용(예: 전사를 조절하는 능력)으로 인해 다른 부분에 있어서 작용(예: 서열의 전사)을 일으키는, 2개 부분 사이의 기능적 관계를 나타낸다.

따라서, 폴리뉴클레오티드 발현 조절서열(예: 프로모터 또는 기타 전사 조절서열) 및 소망하는 폴리뉴클레오티드 서열(예: 천연 또는 재조합 폴리뉴클레오티드) 사이의 기능적 연결이 존재하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 조절 서열에 작동가능하게 연결되며, 여기서 발현 조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시한다.

상기 발현 조절서열 또는 프로모터는 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 발현 조절서열로서, 외래 또는 천연 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프로모터는 중합효소 결합 부위와 같은 전사의 출발 부위 근처의 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 말단 인핸서(enhancer) 또는 리프레서(repressor) 요소를 포함할 수 있다. 적절한 조절서열의 예는 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열을 들 수 있다. 또한, 발현 벡터는 형질전환된 호스트셀을 선별하는 데 필요한 적절한 마커를 포함할 수 있다.

효모에 적절한 프로모터는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 하나의 예에서, 상기 프로모터는 유도기에서 발현성이 높은 프로모터일 수 있다. 그러한 예로는, 사카로마이세스 세레비시애 유래의 헥소오스 트랜스포터 7(HXT7)를 들 수 있다.

상기 벡터는 알코올 생산성 균주에서 발현 가능하고 유전자 재조합이 가능한 것으로서, 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 절편 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드는 내부에 추가적으로 DNA 절편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.

상기 벡터는 호스트셀 내로 도입되어 본 발명에서 기술되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.

에탄올 생산성 형질전환 균주

본 발명의 또 다른 예는, 상기 서열번호 1 내지 13 로 이루어진 군에서 선택된 염기서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 그 절편이 하나 이상 발현증가(upregulate) 및/또는 과발현된 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 갖는 에탄올 생산성 형질전환 균주에 관한 것이다.

상기 균주는 알코올 발효저해물을 포함하는 리그노셀룰로오스의 가수분해물로부터 에탄올을 생산할 수 있는 균주이다. 상기 알코올 발효저해물은 푸르푸랄 및 5-하이드록시메틸-2-푸랄데하이드(HMF) 로 이루어진 군에서 선택된다.

이러한 에탄올 생산성 형질전환 균주는 상술한 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터가 에탄올 생산성 균주 내에 도입되어 형질전환됨으로써 제조될 수 있다.

상기 에탄올 생산성 형질전환 균주는 고용적의 산업적 발효 공정의 수행시 발효산물의 생산성을 방해하는 다양한 억제자들로부터 내성을 가지며, 발효저해물에 의한 셀 성장 억제 현상을 방지할 수 있다. 결과적으로, 알코올의 생산 수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 발효균주의 활용도를 높일 수 있으므로 경제성이 우수하다.

상기 균주는 리그노셀룰로오스의 가수분해물로부터 에탄올을 생산할 수 있고 본 발명에서 기술하고 있는 폴리뉴클레오티드의 발현에 충분한 세포 환경을 제공하는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

예를 들어, 사카로마이세스 세라비시에(Saccharomyces cerevisiae), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) P2, 브레타노마이세스 커스터시(Brettanomyces curstersii), 사카로마이세스 우브즈런(Saccharomyces uvzrun), 캔디다 브래시카에(Candida brassicae). 벤트리컬리 (Sarcina ventriculi), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) IMB3, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이저린키이(Clostridium beijerinckii), 클루이베로마이세스 푸레질리스(Kluyveromyces fragilis), Brettanomyces custersii, Clostriduim aurantibutylicum 및 Clostridium tetanomorphum 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 형질전환 균주는 알코올 발효저해물을 포함하지 않는 배지에서 배양된 야생형 균주(또는 공벡터가 도입된 균주, 이하 같다) 대비 퍼센트 에탄올 생산속도 (ethanol product rate)가 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상일 수 있다. 여기서, 퍼센트 에탄올 생산속도는 단위 세포당 단위 시간에 생산된 에탄올 함량(g/hr)을 알코올 발효저해물을 포함하지 않는 배지에서 배양된 야생형 균주를 100%로 하고 이를 기준으로 대비하여 상대적으로 나타낸 것이다.

상기 형질전환 균주는 발효저해물을 포함하는 배지에서 배양된 야생형 균주의 퍼센트 에탄올 생산속도에 비해서는 적어도, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 이상 증가될 수 있다. 일 예에서, 1.9g/L 푸르푸랄을 포함하는 배지에서 배양된 야생형 사카로마이세스 세레비시애 대비 퍼센트 에탄올 생산속도 (percent ethanol product rate)가 적어도 5 % 이상 증가될 수 있다.

상기 예시적인 호스트셀은 소정의 폴리뉴클레오티드가 발현증가 및/또는 과발현 균주이다. 이는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질의 세포내 활성(intracellular activity) 또는 농도가 증가한다는 것을 의미한다. 상기 발현증가 및/또는 과발현에 의해 폴리펩티드의 농도 또는 활성이 야생형 균주에 존재하는 폴리펩티드의 그것에 비해 예를 들어 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가될 수 있다.

상기 과발현은 유전자의 복제수를 증대시킴으로써 이루어질 수 있으며, 유전자 또는 유전자 구조체는 멀티카피가 가능한 플라스미드 내에 존재하거나 또는 염색체 중에서 합체되어 증폭될 수 있다.

또는, 재조합적으로 삽입되고 상기 유전자에 천연적으로 존재하지 않는 유전적 조절서열의 제어에 의해 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 조절함으로써 과발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, 프로모터 및 조절부위(regulation region) 또는 구조 유전자의 리보솜 결합 영역을 변형시킬 수도 있다. 또는, 상기 호스트셀의 야생형 단백질보다 더 높은 특이적 활성을 갖는 변형형 단백질을 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용하여 달성될 수도 있다. 또는, 배지의 조성 및 배양 과정의 변화에 의해서도 이루어질 수 있다. 이외에도 과발현은 당업계에 널리 공지되어 있는 방법을 통해 달성될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 호스트셀 내로 도입하는 기술은 당업계에 다수 공지되어 있다. 예를 들어, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 트랜스벡션(transvection), 미세주입, 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 트랜스덕션, 스크레이프 로딩, 탄도(ballistic) 도입 또는 감염을 포함한다. 또한, 염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 시스템, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효소 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스로부터 유래한 벡터 등 다양한 발현 시스템을 사용할 수 있다.

상기 발현 시스템은 발현을 조절할 뿐만 아니라 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 호스트셀에서 폴리펩티드를 생산하기 위하여 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현할 수 있는 모든 시스템 또는 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 예시적인 과발현 방법은 플라스미드 벡터를 이용하는 것이다.

상기 알코올 생산성 형질전환 균주는 대한민국 대전시 유성구에 소재한 한국생명공학연구원 유전자은행에 2010년 02월 19일자로 기탁된 하기 표 3의 균주들 중에서 선택될 수 있다. 각각의 호스트셀의 기탁번호, 명칭, 및 각각의 균주에 삽입된 유전자의 명칭 등은 하기 표 3과 같다.

[표 3]

알코올 생산방법

상기 알코올 생산성 형질전환 균주를 단당체 함유 영양원(nutrient source)에서 배양하는 발효과정을 포함하는 알코올을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 발효(fermentation) 과정은 하기 식들에서 예시된 바와 같이, 당화과정에 의해 생성된 가수분해물을 미생물로 발효시켜 알코올 등으로 전환하는 과정이다.

C₆H₁₂O₆ → 2C₂H₅OH + 2CO₂ (2)

3C₅H₁₀O₅ → 5C₂H₅OH + 5CO₂ (3)

상기 단당체는 예를 들어, 글루코오스, 갈락토오스, 갈락토오스 유도체, 3,6-무수갈락토오스(3,6-anhydrogalactose), 푸코오스(fucose), 람노오스(rhamnose), 자일로오스, 글루콘산(Glucuronic acid), 아라비노오스, 만노오스(mannose) 및 이들의 혼합물 또는 복합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 이러한 단당체 함유 영양원은 당질계 바이오매스, 리그노셀룰로오스계 바이오매스, 또는 해조류 바이오매스의 가수분해물일 수 있고 알코올 발효저해물을 포함할 수 있다. 상기 셀룰로오스계 또는 리그노셀룰로오스계 바이오매스의 원료는 예를 들어 볏짚, 하드 우드, 소프트 우드, 초본류, 재생지(recycled paper), 폐지(waste paper), 목편, 펄프 및 종이 폐기물, 폐목재, 간벌목, 옥수수대, 옥수수심, 볏짚, 왕겨, 밀짚, 사탕수수대, 팜나무부산물, 바가스, 농부산물, 농폐기물, 가축분뇨, 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 알코올 생산성 형질전환 균주는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

상기 알코올은 예를 들어, 에탄올, 프로판올, 이소 프로판올, 부탄올, 이소 부탄올, 아세톤, 에틸렌, 프로필렌, 지방산 메틸 에스테르, 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

하나의 예에서, 상기 발효 과정을 수행하기에 앞서 단당체 함유 영양원을 생산하기 위한 당화 과정을 거칠 수 있다. 상기 당화 과정은 황산 등의 가수분해 촉매 또는 가수분해 효소를 이용하여 바이오매스 또는 다당체를 단당체로 가수분해하는 공정이다.

한편, 상기 당화과정과 발효과정은 각각 별도의 반응기에서 수행하는 분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF) 공정으로 수행될 수도 있고, 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행하는 동시당화발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF) 공정으로 수행될 수도 있다.

상기 분리당화발효 공정은 당화과정과 발효과정에 각각 최적화된 조건 하에 반응시킬 수 있다는 장점이 있는 반면, 중간생성물과 최종생성물 사이에서 가수분해효소 반응의 억제 영향이 일어날 수 있는 바, 이를 극복하기 위해 효소의 양을 늘려야만 하므로 비경제적이다. 예를 들어 셀룰로오스를 당화하는 과정에서 중간생성물인 셀로비오스와 최종생성물인 글루코오스는 억제 영향에 의해 반응이 진행됨에 따라 축적된 글루코오스의 농도가 높아지면 반응이 종결되는 단점이 있다.

반면에, 동시당화발효 공정에서는 당화과정에서 글루코오스가 생성되자마자 효모가 발효과정에 의해 글루코오스를 바로 제거하고 반응기 내에 당의 축적을 최소화할 수 있으므로, 분리 당화발효 공정에서 나타나는 최종 생성물의 억제작용을 방지할 수 있고 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있다. 또한, 설비비용 저감과 낮은 효소 투입량에 의한 비용절감을 할 수 있고, 반응기 내에 에탄올이 존재하므로 오염문제를 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

상기 발효 공정 조건은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 초기 글루코오스 농도 2∼60 %(w/v)에서, 25~37℃의 온도, 5.0~8.0의 pH 조건으로 50~250 rpm의 속도로 교반하면서 반응을 수행할 수 있다.

필요에 따라, 당업자는 기타 추가단계 및/또는 공정을 수행할 수 있는 바, 예를 들어, 바이오매스를 분쇄 또는 가수분해하여 당화에 유리하도록 전처리하는 공정, 상기 발효과정에 의해 수득한 발효액을 당업계에 공지된 방법에 따라, 정제하는 정제과정을 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 다양한 실시예들에 따라 본 발명을 상술한다.

[제조예 1]

게놈 라이브러리의 제조

사카로마이세스 세레비시애 CEN.PK2-1D (MATalpha; ura3-52; trp1-289; leu2-3_112; his3 D1; MAL2-8C; SUC2)의 게놈 라이브러리를 구축하기 위해, 초음파 분해(sonication)를 통해 게놈 DNA를 조각낸다. 그런 다음, 2 ~ 4 kb의 크기를 갖는 절편을 아가로스 겔에서 선별한다. Klenow fragment 효소의 처리를 통해서 잘려진 염색체 라이브러리 간의 자가결합(self-ligation)을 방지한다. 또한, 제한효소인 멀티카피 플라스미드 pRS424를 NotI 으로 절단한 후 Klenow fragment 효소를 처리한다.

이후 사카로마이세스 세레비지애 염색체 라이브러리와 절단된 pRS424 벡터를 혼합한 후 유전자 리가아제를 이용하여 연결시킨다. 게놈 라이브러리가 결합된 벡터 pRS424를 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에 형질전환하여 사카로마이세스 세레비지애 라이브러리를 제조한다.

셀의 선별 및 유전자의 확인

각각의 유전자 절편이 과발현된 형질전환 균주 CEN.PK2-1D를 5 mL 용량의 액체배지에서 30℃, 250 rpm의 환경조건에서 키운 후 흡광도 1이 되도록 희석한다. 2 g/L 푸르푸랄 및 2 g/L HMF가 첨가된 고체 제한배지에 재조합세포 현탁액 10 μl를 떨어뜨려 도말한 후 콜로니가 형성될 때까지 30℃의 정치배양기에서 세포를 성장시킨다. 이후 대조군에 비해 빠른 성장을 보이는 균주를 선별한다. 각각의 균주를 3번의 반복성장과정을 거쳐 각각의 세포생장이 초기대수기가 되도록 맞춘다. 푸르푸랄과 HMF가 첨가된 액체배지에서 순수배양하고 세포의 흡광도를 측정하여 2차 선별과정을 수행한다.

선별된 5개의 균주로부터 플라스미드를 Zymoprep kit(Zymo research)를 사용하여 분리한다. 플라스미드에 함유된 유전자의 서열을 분석하기 위해, 클로닝된 부분의 플라스미드 유전자 서열을 토대로 제작된 sequencing primer를 이용하여 클로닝된 유전자 서열을 분석한다. 그런 다음, 사카로마이세스 게놈 데이터베이스()의 블라스트(blast) 검색 엔진을 검색하여 유전자 후보를 비교, 검색한다. 이에 상기 표 1에서와 같이, 유전자 절편 5종 및 유전자 8종을 선별하였다.

[실험예 1] 유전자 절편 5종이 도입된 형질전환 균주의 발효저해물 내성

제조예 1에서 선별된 균주 중 서열번호 1 내지 5의 유전자 절편이 도입된 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 회분식 배양한다. 도입된 유전자 절편은 하기 표 4와 같다.

[표 4]

배양조건은 100mL의 액체배지를 넣은 500mL 용량의 플라스크를 이용하여 온도 30℃, 회전속도 90 rpm에서 실시하였고, pH는 조절하지 않았다. 액체배지의 조성은 10g/L 효모액기스, 20g/L 펩톤, 50g/L 무수 글루코오스, 1.9g/L 푸르푸랄이다.

배양액의 분석을 위해서 고속액체컬럼크로마토그래피(Agilent 1200 series, USA)를 이용한다. 컬럼은 REZEX ROA-organic acid column (Phenomenex, Torrance, USA), 이동상은 5 mM H₂SO₄을 이용하고, 이동상 속도는 0.6 ml/min, 컬럼온도는 60℃로 유지한다. Refractive Index 검출기로 글루코오스, 아세트산, 에탄올, 푸르푸랄을 분석하였다. 그 결과를 도 1, 도 4 내지 8에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 선택된 유전자 절편으로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주는 pRS424 대조구 발현벡터로 형질전환된 비교예 균주보다 20 시간에서 급격한 세포성장을 관찰할 수 있었다. 세포성장 20 시간에서의 세포 농도를 비교하면 하기 표 5와 같다.

[표 5]

또한, 도 1 및 도 4 내지 8를 참조하면, 푸르푸랄이 포함된 배지에서 배양된 비교예 1의 균주에 비해 선택된 유전자 절편으로 형질전환된 실시예 1 내지 5의 균주를 이용한 경우 세포 유도기 기간이 4 시간 이상 단축된 것으로 나타났다.

[제조예 2] 재조합 벡터 및 형질전환 균주의 제조

제조예 1에서 선별된 균주 중 서열번호 6 내지 13의 유전자가 사카로마이세스 세레비지애에서 고율로 발현될 수 있도록 재조합 발현벡터를 제조한다.

모벡터는 GPD(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터와 CYC(cytochrome-c-oxidase) 종결자(terminator)가 포함되어 있는 플라스미드 p426GPD을 사용한다. 헥소오스 트렌스포터 7(HXT7)을 암호하는 유전자의 전사를 활성화하는 프로모터 위치를 PCR을 이용하여 증폭한다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D의 염색체를 순수하게 분리한 후, 하기 표 6에 따른 유전자 절편을 이용하여 HXT7 유전자의 프로모터 부분의 유전자 서열을 증폭한다. 증폭된 HXT7 프로모터 유전자와 플라스미드 p426GPD을 BamHI과 SacI 제한효소로 처리한 후 각 절단된 유전자 절편을 리게이션하여 최종적으로 플라스미드 p426HXT를 제조한다. 이 발현벡터는 GPD 프로모터 영역이 HXT7 프로모터로 치환된 것이다.

[표 6]

서열번호 6 내지 13의 유전자인 ROG1, PEP4, SNF1, KIP2, SKO1, RSP5, ROD1, TRP1을 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 대량발현하기 위해서 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D의 염색체를 순수분리하였고, 하기의 표 7에 기술한 유전자 절편을 이용하여 PCR로 각각의 유전자를 증폭한다.

[표 7]

각각의 유전자를 증폭시킨 후 제한효소(유전자절편명에 병기된 제한효소)를 이용하여 증폭시킨 유전자와 플라스미드 p426HXT를 각각 절단한다.

그런 다음, 유전자 절편을 연결시켜 ROG1, PEP4, SNF1, KIP2, SKO1, RSP5, ROD1, TRP1 유전자가 도입된 재조합 벡터인 pH-ROG1, pH-PEP4, pH-SNF1, pH-KIP2, pH-SKO1, pH-RSP5, pH-ROD1, pH-TRP1을 제조한다.

이와 같이 제조한 재조합 벡터를 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에 형질전환시켜 하기 표 8에서와 같이 각 유전자가 고발현된 형질전환 재조합 사카로마이세스를 제조한다.

[표 8]

[실험예 2] 유전자 8종이 도입된 형질전환 균주의 발효저해물 내성

제조예 2에서 얻은 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 균주의 발효저해물 내성특성을 규명하기 위해서 회분식 배양을 실시한다. 배양의 조건으로 100mL의 액체배지를 넣은 500mL 용량의 플라스크를 이용하여 온도 30℃, 회전속도 90 rpm에서 실시하였고, pH는 조절하지 않는다. 액체배지의 조성은 10g/L 효모액기스, 20g/L 펩톤, 50g/L 무수글루코오스, 1.9g/L 푸르푸랄이다. 실험예 1에서와 동일하게, 배양액의 분석을 위해서 고속액체컬럼크로마토그래피(Agilent 1200 series, USA)를 이용하여 배양액을 분석였고, Refractive Index 검출기로 글루코오스, 아세트산, 에탄올, 푸르푸랄을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 9 및 도 2, 도 3, 도 9 내지 11에 나타내었다.

[표 9]

도 2는 대조군 1로서 발효저해제 푸르푸랄이 첨가되지 않는 배지에 내성유전자가 없는 p426HXT 플라스미드가 도입된 사카로마이세스 세레비지애(비교예 1)를 회분식 발효한 결과이다. 12시간에 투입된 글루코오스가 모두 소모되어 세포성장과 에탄올 생성이 이루어졌다.

도 3은 대조군 2로서 발효저해제 푸르푸랄 1.9 g/L가 첨가된 배지에 내성유전자가 없는 p426HXT 플라스미드가 도입된 재조합 사카로마이세스 세레비지애(비교예 1)를 회분식 발효한 결과이다. 세포성장은 첨가된 푸르푸랄이 모두 소모된 16시간에서 시작되었다. 첨가된 글루코오스 42g/L는 발효 28시간에 모두 소모되어 세포성장과 에탄올 생성이 이루어졌다.

도 9는 발효저해제 푸르푸랄 1.9g/L가 첨가된 배지에 내성유전자 ROG1이 도입된 플라스미드 pH-ROG1으로 형질전환된 재조합 사카로마이세스 세레비지애 LJE001(실시예 6)을 회분식 발효한 결과이다. 세포성장은 첨가된 푸르푸랄이 모두 소모된 12 시간에서 시작되었다. 첨가된 글루코오스 40g/L는 발효 24시간에 모두 소모되어 세포성장과 에탄올 생성이 이루어졌다.

도 10는 발효저해제 푸르푸랄 1.9g/L가 첨가된 배지에 내성유전자 PEP4가 도입된 플라스미드 pH-PEP4으로 형질전환된 재조합 사카로마이세스 세레비지애 LJE002(실시예 7)를 회분식 발효한 결과이다. 세포성장은 첨가된 푸르푸랄이 모두 소모된 12시간에서 시작되었다. 첨가된 글루코오스 38g/L는 발효 16시간에 모두 소모되어 세포성장과 에탄올 생성이 이루어졌다.

도 11은 발효저해제 푸르푸랄 1.9g/L가 첨가된 배지에 내성유전자 TRP1이 도입된 플라스미드 pH-TPR1으로 형질전환된 재조합 사카로마이세스 세레비지애 LJE008(실시예 13)을 회분식 발효한 결과이다. 세포성장은 첨가된 푸르푸랄이 모두 소모된 12시간에서 시작되었다. 첨가된 글루코오스 40g/L는 발효 20시간에 모두 소모되어 세포성장과 에탄올 생성이 이루어졌다.

[실험예 3]

액체배지의 조성 중 푸르푸랄 대신에 HMF를 첨가하였다는 점을 제외하고는 실험예 2와 동일한 방법으로 제조예 2에서 얻은 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 균주의 발효저해물 내성특성을 규명하기 위해서 회분식 배양을 실시한다.

실험예 1에서와 동일하게, 배양액의 분석을 위해서 고속액체컬럼크로마토그래피(Agilent 1200 series, USA)를 이용하여 배양액을 분석였고, Refractive Index 검출기로 글루코오스, 아세트산, 에탄올, 푸르푸랄을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 10 및 도 12 내지 20에 나타내었다.

[표 10]

도 12는 대조군 2로서 발효저해제 HMF 1.9g/L가 첨가된 배지에 내성유전자가 없는 p426HXT 플라스미드가 도입된 재조합 사카로마이세스 세레비지애(비교예 1)를 회분식 발효한 결과이다. 세포성장은 첨가된 HMF 이 모두 소모된 16시간에서 시작되었다. 첨가된 글루코오스는 발효 28시간에 모두 소모되어 세포성장과 에탄올 생성이 이루어졌다.

도 13 내지 20은 각각 발효저해제 HMF 1.9g/L가 첨가된 배지에 내성유전자 도입된 플라스미드로 형질전환된 재조합 사카로마이세스 세레비지애 LJE001 내지 8(실시예 6 내지 13)을 회분식 발효한 결과이다. 세포성장은 첨가된 HMF이 모두 소모된 약 12 ~ 16시간에서 시작되었다. 첨가된 글루코오스는 발효 20 내지 28시간에 모두 소모되어 세포성장과 에탄올 생성이 이루어졌다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

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<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO.LTD. <120> Isolated Polynucleotides Increasing Tolerance For Alcohol Fermentation Inhibitive Compound, Recombinant Vector and Alcohol Producing Transformed Cell Containing the Same, and Method of Producing Bio-Alcohol Using the Same <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1015 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of Rog1 gene <400> 1 atgtacgctc tttcaggtaa aggaggaagg agaattgagc ttgctgactc gaaaaatgat 60 actttaggaa tttcggaacc attctccgta ggaaactttt gtggcgccag tatactcaac 120 attttagtca gaggcgaaat gaaagtttta ttgaagaaat cttgattcac aggtgttgaa 180 gcatcattta ttagcggtga ttttttgctg ttctccttta gtttctgtaa ttgctccaag 240 atatcattat agtctaggaa caatagcgat gcggtataca atgggacaat tccgtcatta 300 atagcgttcg catatactgt cctccttttg aacctacgca aaatctctat caagggcaga 360 ccagatagca agtagagaag cggtttgcct acttcaacat cattttccaa acccaagtct 420 tgacctgttt ttccaataac cccgaatgaa agtagtactt taatataggc gggattatct 480 gtgactatac ctaaaagcgg tgaagctaaa gtaataaaat 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gagatgatac tactgtttct 1800 aatatttctg aagatgaaat gagtactttt tcagcctacc catttttaca tttaacaaca 1860 aaactaatta tggaattagc cgttaacagt caaagcaatt ga 1902 <210> 9 <211> 2121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIP2 gene <400> 9 atgattcaaa aaatgagccc aagcttaagg aggccatcaa cgaggtctag ttctggttca 60 agtaatatcc cacaatcgcc ctctgtacga tcaacttcat cgttttctaa tctgacaaga 120 aactccatac ggagcacctc taattcgggt tctcagtcga tttctgcatc ttccactaga 180 agtaactccc cactaagatc cgtatcagcc aaatccgatc ccttccttca cccaggtagg 240 ataaggatca ggcggagcga cagtattaac aacaactcga gaaaaaacga tacatatact 300 gggtcaatca ctgtgaccat ccggccgaaa ccacggagcg ttggaacttc ccgtgaccat 360 gtggggctaa aatcgcccag gtactctcaa ccaagatcca actcacatca cggtagcaat 420 acatttgtta gagacccctg gtttattact aatgacaaaa caatagtgca tgaagaaatt 480 ggagagttca agttcgatca tgtttttgct tcccattgca ctaatttgga agtttatgaa 540 agaaccagta aaccaatgat tgataagtta ttgatggggt ttaatgccac catatttgcg 600 tacggtatga ccgggtcagg taaaacgttt acaatgagcg gaaatgaaca agagctaggc 660 ctaattcctt tatctgtgtc gtatttattt accaatatca tggaacaatc aatgaatggc 720 gataaaaagt tcgacgttat aatatcgtac ctcgaaattt acaatgaaag gatttacgac 780 ctgttagaaa gcggattaga agaatccggt agtagaatca gtactccttc aaggttatat 840 atgagcaaga gcaacagcaa tggattgggc gtagaattaa aaatcagaga tgactctcag 900 tatggggtca aagttatcgg tctcaccgaa agaagatgtg aaagtagtga agaattattg 960 aggtggattg cagttggtga caaaagtagg aaaattggcg aaactgacta caatgcaaga 1020 agctcacgat ctcatgccat tgtactgatt cgtttaacaa gtactaacgt aaagaacggc 1080 acctcaagat cgagtacatt gtcgttgtgt gacctagcag gttcggaaag ggctacgggg 1140 caacaagaga ggagaaagga aggttcattc atcaacaaat ccttacttgc tttggggact 1200 gtgatatcca aactcagtgc cgacaagatg aactcagtag gctcaaacat tccctcgcca 1260 tctgcaagtg gcagtagcag cagtagtgga aatgctacca ataacggcac tagcccaagc 1320 aaccacattc catatcgtga ttctaaattg actagattat tgcagccggc actaagcggt 1380 gacagcatag tgacaacgat atgtacagtc gacaccagaa atgatgcggc agcggaaact 1440 atgaatacgc tgaggtttgc atcaagagcg aaaaacgtcg cacttcatgt atccaaaaaa 1500 tccatcatca gtaacgggaa taacgatgga gataaagatc gcaccattga gctactgaga 1560 cgccaattgg aagaacaacg taggatgatc tctgaattga agaaccgttc aaacattggc 1620 gagcccttaa ccaaatcttc caatgaaagt acttataaag acattaaagc caccggcaat 1680 gatggtgatc cgaatttggc tctaatgaga gcggagaatc gagtattaaa atataaacta 1740 gagaattgtg aaaaactact agataaagat gtggttgatt tgcaagattc tgagattatg 1800 gaaattgtag aaatgcttcc ctttgaggtc ggcacccttt tggaaacaaa gttccaaggt 1860 ttggaatcac aaataaggca atataggaaa tacactcaaa aacttgaaga caagatcatg 1920 gcgctagaaa aaagtggtca tactgcaatg tcgctaactg ggtgtgacgg cactgaagtg 1980 atcgaattac agaagatgct cgagaggaag gataaaatga ttgaggccct gcagagtgcc 2040 aaacgactgc gggatagggc tttgaaacca ctcattaata cacagcaatc accgcaccct 2100 gtcgtggata acgataaatg a 2121 <210> 10 <211> 1944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SKO1 gene <400> 10 atgtcaagcg aggaacgctc gagacaacca agtactgttt caactttcga tttagaaccc 60 aatccttttg aacaaagctt cgcctcttcc aagaaggctt tgtcacttcc aggcacgatc 120 tcccatccgt ctctaccaaa agagctttca 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tcaaaatgga taatccggca 1020 gagttcaatg ccatcgagca ctccgctcat aatcacaagg agaatgaaaa tttaacgact 1080 caaattgaga acaatgacca gttcaataac aaaacacgaa aaagaaagag aaggatgtct 1140 agcacaagtt ctacttctaa ggcttcaaga aaaaattcca tatcaagaaa aaactcagca 1200 gttacgactg caccagcaca aaaagatgat gttgaaaata ataaaatttc aaacaacgta 1260 acacttgatg agaatgaaga gcaagaaaga aaaagaaagg agtttttaga aagaaataga 1320 gtagctgcat ctaaatttag aaaaagaaag aaagagtaca tcaagaaaat tgaaaatgat 1380 ctacaattct atgaatctga atatgacgat ctaactcagg tcattgggaa gctatgcggc 1440 ataataccct caagctcctc gaattcccaa ttcaatgtga atgtttcaac tccgtcatca 1500 tcatcaccac catctacatc tttaatagca ttgttagaga gtagcatttc aaggagtgat 1560 tattcaagtg caatgtcagt attatcaaac atgaagcaat tgatatgtga aacgaatttt 1620 taccgaaggg gaggcaaaaa cccaagggac gacatggatg gccaagaaga cagcttcaat 1680 aaggacacta acgttgtcaa aagcgaaaat gcgggctatc cttccgttaa ttcaagacca 1740 ataattctag ataaaaaata ctcactgaac tctggagcaa atatcagcaa aagtaacaca 1800 actactaata atgtgggaaa tagtgcacag aatataatca 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ttgaagacca gtatggtcgt ttaccccctg gttgggagag aaggaccgat 720 aactttggtc gtacatatta cgtcgatcat aacacaagga ctaccacttg gaaacgtcca 780 acgctcgatc aaacagaagc cgaacgtggc aaccaattaa atgcaaatac tgagttagag 840 agaaggcagc ataggggaag aactttacct ggtggatcat cagataattc ctctgtaaca 900 gttcaagtgg gaggtggttc caatatacct cctgttaatg gtgcagcagc agcagcgttt 960 gcagctacag gtggtaccac atctggttta ggcgaattac cttcaggctg ggagcagcga 1020 tttactccag aaggaagagc ttatttcgtt gaccataata ctagaacaac cacttgggtg 1080 gatccaagga gacaacagta tatacgtact tatggcccta caaataccac cattcagcaa 1140 caaccggtct cccaattagg tcctttgcct tctggatggg aaatgagatt gaccaatacg 1200 gcacgtgtat atttcgttga ccacaataca aaaacaacga cctgggatga cccaagactt 1260 ccatcatcgc tagaccaaaa tgttccacaa tacaagcgtg acttcagacg taaggttatt 1320 tatttcaggt cccagcccgc tcttagaata ttgccgggac aatgtcatat taaagtacgt 1380 agaaagaaca tttttgagga tgcttatcaa gaaattatga gacaaacccc agaagattta 1440 aagaaaagat taatgatcaa gtttgatggt gaggaaggtt tagattacgg tggtgtttcc 1500 agagaatttt tctttttatt 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1560 gcaattcaca atattcaaaa cctatatata tcggatagta acaatagcaa taatcctatt 1620 ttggcaccaa atcctcaaat caagattgaa gatgatagcc taaataattg tgactctcga 1680 ggggacagcg ttaacaatag taacctgaat ctggttaata gtaatctaac aattagtgaa 1740 aattggaaca ataactctcc ttctgcaaat agatataata acatcattaa tgctggattg 1800 aatagtcctt cactgacacc aagctttgca catttatcta ggcgtaactc atatagtcgc 1860 caaacatctt ctacatcgct gaagaacgat ttggaactga cagatttaag cagagttccc 1920 tcgtatgata aagcaatgaa atctgatatg attggtgagg atcttccacc ggcttatccc 1980 gaggaagaac ttggagttca agaaaataaa aaaattgaac tagaaaggcc acaaattctt 2040 catcacaagt ctacatcctc tttgttgcca cttccaggct cgagcaagag ttccaataat 2100 ctgaaaagat cgtctagtag gacacattta tcccactctc cattaccaag gaataatagc 2160 ggatcctcag tatcattgca gcagttggcg agaaacaaca cagatagttc atttaatcta 2220 aatctctctt tcacttcagc aaaaagcagc acaggaagca gacattttcc gtttaatatg 2280 acaacatctt tcactagtaa ttcaagttcc aagaacaatt cacattttga taaaactgat 2340 tctacatctg acgctaataa gccaagagaa gaggaaaact atacgagcgc aacccacaat 2400 cgaaggtcac gctcatcgtc agttcggagc aacaatagca actcaccatt aagacaagga 2460 acaggttcat ttgctaattt aatggagatg ttcacaaaac gggatcgctc atag 2514 <210> 13 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP1 gene <400> 13 atgtctgtta ttaatttcac aggtagttct ggtccattgg tgaaagtttg cggcttgcag 60 agcacagagg ccgcagaatg tgctctagat tccgatgctg acttgctggg tattatatgt 120 gtgcccaata gaaagagaac aattgacccg gttattgcaa ggaaaatttc aagtcttgta 180 aaagcatata aaaatagttc aggcactccg aaatacttgg ttggcgtgtt tcgtaatcaa 240 cctaaggagg atgttttggc tctggtcaat gattacggca ttgatatcgt ccaactgcat 300 ggagatgagt cgtggcaaga ataccaagag ttcctcggtt tgccagttat taaaagactc 360 gtatttccaa aagactgcaa catactactc agtgcagctt cacagaaacc tcattcgttt 420 attcccttgt ttgattcaga agcaggtggg acaggtgaac ttttggattg gaactcgatt 480 tctgactggg ttggaaggca agagagcccc gaaagcttac attttatgtt agctggtgga 540 ctgacgccag aaaatgttgg tgatgcgctt agattaaatg gcgttattgg tgttgatgta 600 agcggaggtg tggagacaaa tggtgtaaaa gactctaaca aaatagcaaa tttcgtcaaa 660 aatgctaaga aatag 675

Claims

서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 푸르푸랄 또는 5-하이드록시메틸-2-푸랄데하이드(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF)에 대한 저항성을 증가시키는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서,
사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 유래한, 단리된 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제 3 항에 있어서,
상기 단리된 폴리뉴클레오티드, 발현 조절서열 및 헥소오스 트랜스포터 7(HXT7) 프로모터가 작동가능하게 융합된 플라스미드인, 재조합 벡터.
제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 과발현하는 알코올 생산성 형질전환 균주.
제 3 항 또는 제 4 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)인, 알코올 생산성 형질전환 균주.
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제 5 항에 있어서,
(i) 기탁번호 KCTC11642BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE001;
(ii) 기탁번호 KCTC11643BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE002;
(iii) 기탁번호 KCTC11644BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE003;
(iv) 기탁번호 KCTC11645BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae)CEN.PK2-1D/pLJE004;
(v) 기탁번호 KCTC11646BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pLJE005;
(vi) 기탁번호 KCTC11647BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-ROG1;
(vii) 기탁번호 KCTC11648BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-PEP4;
(viii) 기탁번호 KCTC11649BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-SNF1;
(ix) 기탁번호 KCTC11650BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-KIP2;
(x) 기탁번호 KCTC11651BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-SKO1;
(xi) 기탁번호 KCTC11652BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-RSP5;
(xii) 기탁번호 KCTC11653BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-ROD1; 및
(xiii) 기탁번호 KCTC11654BP 의 사카로마이세스 세레비시애(S.cerevisiae) CEN.PK2-1D/pH-TRP1;
로 이루어진 군에서 선택된, 알코올 생산성 형질전환 균주.
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