KR101703439B1 - 미생물의 알코올 저항성 증가 방법 및 알코올 저항성 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알코올 저항성 증가 방법 및 알코올 저항성이 증가된 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물 체외로의 알코올 배출을 촉진시켜, 체내의 알코올에 의한 미생물의 손상을 최소화시킬 수 있다. 이에, 알코올 저항성을 현저히 개선할 수 있어, 알코올을 보다 지속적으로 대량 생산할 수 있는 알코올 저항성 증가 방법 및 알코올 저항성이 증가된 미생물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 미생물의 알코올 저항성 증가 방법 및 알코올 저항성 미생물에 관한 것이다.
화석연료의 고갈과 지구온난화에 따른 친환경적이고 지속가능한 바이오 연료 생산 미생물개발에 대한 필요성이 증대되고 있다. 에탄올에 비해서 에너지 함량이 높고, 기존 인프라에도 적합한 중사슬 알코올[Medium-chain (C4-C9) alcohols (CmOHs)]은 가솔린(C4-C12)과 혼합 형태 또는 단독 형태의 드랍-인 바이오 연료로도 활용될 수가 있다. 하지만 중사슬 알코올(CmOHs)은 숙주 미생물에 대한 독성이 커서 이들의 대량생산에 걸림돌이 되고 있다. 이들은 세포 내에서 단백질 변성, DNA 및 지질 손상, RNA 분해 등의 세포독성을 유발한다.
이러한 세포독성에 대처하기 위해서 세포가 갖고 있는 세포막 조성변화, 스트레스 내성 유전자 활성화, 배출펌프 과발현 등의 다양한 방어전략들을 이용해서 중사슬 알코올에 대해 저항성을 갖는 생산균주를 개발할 수 있다. 그러나 이들 물질들이 세포 내에서 만들어지고, 그 안에서 독성을 미치기 때문에 이들을 밖으로 퍼내는 배출펌프를 이용하는 것이 가장 효율적인 전략이 될 것이다(도 1A). 그러나 숙주 세포가 갖고 있는 배출펌프들이 어떤 물질을 어떻게 배출하는 것에 대한 정보가 부족하고, 역할이 규명된 외래 펌프들의 이종숙주 발현의 경우에는 유전자 코돈의 상이성과 막 단백질 발현의 난이함 때문에 배출펌프를 이용한 저항성 균주 개발전략은 어려움이 있다.
한국공개특허 제2011-0106145호에는 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 알코올 생산성 형질전환 균주 및 이를 이용한 알코올의 제조방법이 개시되어 있다.
본 발명은 미생물 체외로의 알코올 배출을 촉진시켜 미생물의 알코올 저항성 증가 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 그러한 방법에 의해 알코올 저항성이 증가된 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 미생물의 알코올 저항성 증가 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물의 알코올 저항성 증가 방법은 AcrA 및 AcrB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 감쇄 또는 결실시켜, TolC를 통한 알코올 배출을 촉진시킴으로써 미생물의 알코올 저항성을 증가시킬 수 있다.
AcrAB-TolC 배출 펌프(AcrAB-TolC efflux pump)는 미생물에게 항균제에 대한 저항성을 부여하는 펌프로서, 외부막 채널인 TolC, 내부막에 존재하는 이차 운반자인 AcrB, 그리고, 이들 두 막 관통 단백질을 연결하는 주변세포질의(periplasmic) AcrA를 포함한다. AcrAB-TolC efflux pump는 다양한 화합물질을 수송함으로써 넓은 범위의 항균제에 대해서 저항성을 부여한다.
본 발명자들은 AcrA 및 AcrB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질의 발현이 저해되는 경우, TolC 의존적인 경로로의 알코올 배출이 촉진되어, 알코올 저항성이 증가되는 것에 기초하여 본 발명을 착안하였다.
상기 미생물은 AcrAB-TolC 배출 펌프는 그람 음성 박테리아에 존재하는 것으로서, 상기 미생물은 이를 구비한 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 에세리키아속, 살모넬라속, 시겔라속, 엔테로박터속, 프로테우스속, 슈도모나스속, 모락셀라속, 헬리코박터속, 스테노트로포모나스속, 델로비브리오속, 레지오넬라속, 나이세리아속, 에르위니아속 균주 등을 들 수 있다.
바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 엔테로박터 애로진스(Enterobacter aerogenes)일 수 있고, 상기 대장균은 구체적으로 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
AcrA는 전술한 미생물에 내재된 AcrA의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자로 코딩되는 것일 수 있다.
AcrB도 전술한 미생물에 내재된 AcrB의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 예를 들면 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자로 코딩되는 것일 수 있다.
TolC도 전술한 미생물에 내재된 AcrB의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 예를 들면 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "감쇄(attenuation)"는 대상 유전자의 발현이 모균주에 비하여 감소한 것을 나타낸다. 용어 "결실(deletion)"은 대상 유전자의 발현이 상실된 것을 나타낸다.
상기 감쇄 또는 결실은 유전자 서열의 변이, 예를 들면, 치환, 결실, 삽입 또는 그들의 조합에 의하여 발생할 수 있다. 상기 감쇄 또는 결실은 유전자 조절부의 서열의 변이, 예를 들면, 치환, 결실, 삽입 또는 그들의 조합에 의하여 발생할 수 있다.
본 발명의 미생물의 알코올 저항성 증가 방법은 AcrA 및 AcrB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 감쇄 또는 결실시켜, TolC를 통한 알코올 배출을 촉진시킨다.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 AcrA 및 AcrB가 TolC에 결합하여, 그 외의 다약물 수송자가 TolC에 결합할 수 없어 TolC 의존적인 경로로 알코올을 배출할 수 없지만, AcrA 또는 AcrB가 감쇄 또는 결실되는 경우 다른 다약물 수송자가 TolC에 결합하여, TolC를 통한 알코올 배출이 촉진됨을 발견하였다.
상기 다약물 수송자는 예를 들면 AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI, YdiM 등일 수 있다. 다약물 수송자는 전술한 미생물에 내재된 단백질의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 예를 들면 AcrD는 서열번호 6의 아미노산 서열, EmrAB는 서열번호 7의 아미노산 서열, MacAB는 서열번호 8의 아미노산 서열, MdtBC는 서열번호 9의 아미노산 서열, MdtJI는 서열번호 10의 아미노산 서열, YdiM는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물은 상기 다약물 수송자를 내재한 미생물이거나, 상기 수송자를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물일 수 있다. 예를 들면 AcrD를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열, EmrAB를 코딩하는 유전자는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열, MacAB를 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열, MdtBC를 코딩하는 유전자는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열, MdtJI를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열, YdiM를 코딩하는 유전자는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 알코올은 예를 들면 탄소수 4 내지 6의 알코올, 바람직하게는 탄소수 5 또는 6의 알코올일 수 있다.
또한, 본 발명은 AcrA 및 AcrB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 감쇄 또는 결실된 알코올 저항성 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 AcrAB-TolC efflux pump를 구비한 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 공지된 그람 음성 박테리아일 수 있다. 예를 들면 에세리키아속, 살모넬라속, 시겔라속, 엔테로박터속, 프로테우스속, 슈도모나스속, 모락셀라속, 헬리코박터속, 스테노트로포모나스속, 델로비브리오속, 레지오넬라속, 나이세리아속, 에르위니아속 균주 등을 들 수 있다.
바람직하게는 대장균일 수 있고, 구체적으로 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
AcrA는 전술한 미생물에 내재된 AcrA의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자로 코딩되는 것일 수 있다.
AcrB도 전술한 미생물에 내재된 AcrB의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 예를 들면 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자로 코딩되는 것일 수 있다.
본 발명의 알코올 저항성 미생물은 AcrA 및 AcrB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 결실 또는 감쇄되어, 미생물 내부의 다약물 수송자가 free TolC에 결합하여 TolC를 통해 알코올을 배출시킬 수 있으므로, 우수한 알코올 저항성을 나타낼 수 있다.
TolC도 전술한 미생물에 내재된 AcrB의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 예를 들면 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 다약물 수송자는 예를 들면 AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI, YdiM 등일 수 있다. 다약물 수송자는 전술한 미생물에 내재된 단백질의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 예를 들면 AcrD는 서열번호 6의 아미노산 서열, EmrAB는 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열(Emr A는 서열번호 7, EmrB는 서열번호 8), MacAB는 서열번호 9 및 10의 아미노산 서열(MacA는 서열번호 9, MacB는 서열번호 10), MdtBC는 서열번호 11 및 12의 아미노산 서열(MdtB는 서열번호 11, MdtC는 서열번호 12), MdtJI는 서열번호 13 및 14의 아미노산 서열(MdtJ는 서열번호 13, MdtI는 서열번호 14), YdiM는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 미생물은 상기 다약물 수송자를 내재한 미생물이거나, 상기 수송자를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물일 수 있다. 예를 들면 AcrD를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열, EmrAB를 코딩하는 유전자는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열, MacAB를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열, MdtBC를 코딩하는 유전자는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열, MdtJI를 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열, YdiM를 코딩하는 유전자는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 알코올은 예를 들면 탄소수 4 내지 6의 알코올, 바람직하게는 탄소수 5 또는 6의 알코올일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 알코올 저항성이 증가된 미생물을 이용한 알코올 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 알코올 생산 방법은 상기 미생물을 단당체 함유 영양원(nutrient source)에서 배양하여 상기 단당체를 발효시키는 단계를 포함한다.
상기 단당체는 예를 들어, 글루코오스, 갈락토오스, 갈락토오스 유도체, 3,6-무수갈락토오스(3,6-anhydrogalactose), 푸코오스(fucose), 람노오스(rhamnose), 자일로오스, 글루콘산(Glucuronic acid), 아라비노오스, 만노오스(mannose) 및 이들의 혼합물 또는 복합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
이러한 단당체 함유 영양원은 당질계 바이오매스, 리그노셀룰로오스계 바이오매스, 또는 해조류 바이오매스의 가수분해물일 수 있고 알코올 발효저해물을 포함할 수 있다. 상기 셀룰로오스계 또는 리그노셀룰로오스계 바이오매스의 원료는 예를 들어 볏짚, 하드 우드, 소프트 우드, 초본류, 재생지(recycled paper), 폐지(waste paper), 목편, 펄프 및 종이 폐기물, 폐목재, 간벌목, 옥수수대, 옥수수심, 볏짚, 왕겨, 밀짚, 사탕수수대, 팜나무부산물, 바가스, 농부산물, 농폐기물, 가축분뇨, 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 알코올은 예를 들어, 탄소수 4 내지 6의 알코올, 바람직하게는 탄소수 5 또는 6의 알코올일 수 있다.
하나의 예에서, 상기 발효 과정을 수행하기에 앞서 단당체 함유 영양원을 생산하기 위한 당화 과정을 거칠 수 있다. 상기 당화 과정은 황산 등의 가수분해 촉매 또는 가수분해 효소를 이용하여 바이오매스 또는 다당체를 단당체로 가수분해하는 공정이다.
한편, 상기 당화과정과 발효과정은 각각 별도의 반응기에서 수행하는 분리 당화발효(Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF) 공정으로 수행될 수도 있고, 하나의 반응기에서 당화와 발효를 동시에 수행하는 동시당화발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF) 공정으로 수행될 수도 있다.
상기 분리당화발효 공정은 당화과정과 발효과정에 각각 최적화된 조건 하에 반응시킬 수 있다는 장점이 있는 반면, 중간생성물과 최종생성물 사이에서 가수분해효소 반응의 억제 영향이 일어날 수 있는 바, 이를 극복하기 위해 효소의 양을 늘려야만 하므로 비경제적이다. 예를 들어 셀룰로오스를 당화하는 과정에서 중간생성물인 셀로비오스와 최종생성물인 글루코오스는 억제 영향에 의해 반응이 진행됨에 따라 축적된 글루코오스의 농도가 높아지면 반응이 종결되는 단점이 있다.
반면에, 동시당화발효 공정에서는 당화과정에서 글루코오스가 생성되자마자 미생물이 발효과정을 통해 글루코오스를 바로 제거하고 반응기 내에 당의 축적을 최소화할 수 있으므로, 분리 당화발효 공정에서 나타나는 최종 생성물의 억제작용을 방지할 수 있고 효소의 가수분해 반응을 향상시킬 수 있다. 또한, 설비비용 저감과 낮은 효소 투입량에 의한 비용절감을 할 수 있고, 반응기 내에 알코올이 존재하므로 오염문제를 감소시킬 수 있는 장점이 있다.
상기 알코올은 예를 들어, 탄소수 4 내지 6의 알코올, 바람직하게는 탄소수 5 또는 6의 알코올일 수 있다.
상기 발효 공정 조건은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 초기 글루코오스 농도 2∼60 %(w/v)에서, 25~37℃의 온도, 5.0~8.0의 pH 조건으로 50~250 rpm의 속도로 교반하면서 반응을 수행할 수 있다.
본 발명의 알코올 저항성 증가 방법은 미생물 체외로의 알코올 배출을 촉진시켜, 체내의 알코올에 의한 미생물의 손상을 최소화시킬 수 있다. 이에, 알코올 저항성을 현저히 개선할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 알코올 저항성이 개선된 미생물을 알코올, 특히 독성이 높은 중사슬 알코올 생산에 이용하면, 우수한 저항성을 바탕으로 보다 지속적인 대량 생산이 가능하다.
도 1. 수송자 결손 라이브러리 탐색을 통한 이소프레놀 배출 수송자 발굴. (A) 수송자에 의한 세포 내 이소프레놀 배출 개념도. 배출펌프는 이소프레놀 배출을 통해서 세포 내에서 합성되었거나 외부에서 확산을 통해서 들어온 이소프레놀의 독성을 경감시킴. “MBO”로 표시한 육각형은 이소프레놀(isoprenol, 3M-3=C4OH)을 지칭함. 이소프레놀 생합성 플라스미드는 pISO로 표시함. (B) 이소프레놀 저항성 관련 다약물 수송자[multidrug transporter (MDT)] 탐색 전략. 다약물 수송자 결손주들을 이소프레놀 존재하에서 배양하면 3가지 생육패턴을 예상할 수 있음 - (i) 이소프레놀 배출 수송자가 결손되면 세포생육은 야생형에 비해 낮음; (ii) 결손된 수송자가 이소프레놀 배출과 무관하면 세포생육은 야생형과 차이가 없음; (iii) 미지의 기작에 의한 결손주에서의 저항성 및 생육의 증가. (C) 이소프레놀에 의한 결손주들의 생육 저해. 결손주들을 0.5% (v/v)의 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 30℃ 온도에서 12 시간 배양함. 결손주들의 생육저해(%)는 야생형 균주의 생육저해(약 50%) 정도와 비교해서 이소프레놀에 대한 민감도를 5 그룹으로 분류함: 매우 민감(> 57.5%, 검정), 민감(52.5% - 57.5%, 진한 회색), 동일(47.5% - 52.5%, 회색), 저항(42.5% - 47.5%, 밝은 회색), 매우 저항(< 42.5%, 흰색).
도 2. 이소프레놀 민감성 및 저항성 결손주들의 생육양상 검증. (A) 수송자 결손주들의 세포생육 곡선. (B) 수송자 결손주들의 생육저해(Growth inhibition, %). 민감성 결손주 BWΔacrD, BWΔemrA, BWΔmacB, BWΔmdtC, BWΔmdtJ 및 BWΔydiM; 저항성 결손주 BWΔacrA, BWΔacrB 및 BWΔtolC; 야생형 대장균 BW25113. 상기 균주들은 0.5% (v/v)의 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 30℃ 온도에서 배양하면서 6시간 마다 세포생육을 측정하였다. 세포생육 저해도는 실험방법에 기술한대로 계산함. 배양초기 저해도를 모든 균주들에 대해 50%로 표시함.
도 3. 이소프레놀 민감성 및 저항성 결손주들의 세포생육. 민감성 결손주 BWΔacrD, BWΔemrA, BWΔmacB, BWΔmdtC, BWΔmdtJ, BWΔydiM와 저항성 결손주 BWΔacrA, BWΔacrB, BWΔtolC 및 야생형 대장균 BW25113을 2YT 배지와 30℃에서 배양하고 세포생육을 6시간 마다 측정함.
도 4. 이소프레놀 저항성을 부여하는 수송자들의 전사량 정량 PCR 분석과 그들의 과발현을 통한 기능 검증. (A) 이소프레놀 첨가에 따른 전사량 변화. 대장균 BW25113를 0.5% (v/v) 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 6 시간 배양함. 전사량 변화는 이소프레놀 무첨가 배양에서의 전사량을 기준으로 표시함. (B) 결손주 BWΔacrA, BWΔacrB, BWΔtolC에서의 전사체 변화 양상. 상기 결손주들을 0.5% (v/v) 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 6 시간 배양함. 결손주 전사체 변화는 야생형 균주 BW25113에서의 전사를 기준으로 표시함. (C) 이소프레놀 배출과 관련된 수송자들의 과발현. 상기 수송자들의 유전자가 들어간 플라스미드를 갖는 야생형 균주 BW25113(사각형)와 결손주 BWΔacrAB(원형)에서의 생육저해를 비교함. 상기 균주에서 수송자 플라스미드 대신에 공벡터인 pTrc99A로 형질전환 된 균주의 생육저해는 위 점선(야생형 균주)과 아래 점선(결손주)으로 표시함. 모든 균주들은 0.5% (v/v) 이소프레놀과 0.1 mM IPTG가 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함.
도 5. IPTG 무첨가 조건에서 이소프레놀 저항성과 관련된 수송자 발현 플라스미드로 형질전환된 야생형 균주 BW25113 (사각형)와 결손주 BWΔacrAB (원형)의 이소프레놀에 대한 생육저해. 대조구로 공벡터인 pTrc99A로 형질전환 된 야생형 균주(위 점선)과 결손주(아래 점선)를 사용함. 모든 균주들은 0.5% (v/v) 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함.
도 6. 이소프레놀 저항성과 관련된 수송자 단백질들의 SDS-PAGE를 발현 분석. (A) IPTG 발현유도 안함, (B) 배양초기에 0.2 mM IPTG로 발현 유도. 하기의 플라스미드들로 형질전환 된 야생형 균주 BW25113을 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함; pTrc99A (lane 1), pT-acrD (lane 2) pT-emrAB (lane 3), pT-ydiM (lane 4), pT-mdtJI (lane 5), pT-macAB (lane 6) pT-mdtBC (lane 7), pT-tolC (lane 8). 발현 대상 단백질들의 이론 분자량: 113 kDa (AcrD), 43 kDa (EmrA), 57 kDa (EmrB), 45 kDa (YdiM), 41kDa (MacA), 70 kDa (MacB), 112 kDa (MdtB), 110 kDa (MdtC), and 54 kDa (TolC). 글자 M은 PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific, IL)를 표시함.
도 7. 이소프레놀 배출에서의 TolC의 역할. 모든 결손주들은 0.5% (v/v) (회색 막대) 또는 0.75% (v/v) (검정 막대)의 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함. 대조구로 야생형 균주 BW25113의 0.5% (v/v) (아래 점선)와 0.75% (v/v) (위 점선) 이소프레놀에 대한 생육저해를 사용함.
도 8. 이소프레놀 저항성 관련 유전자들의 acrB 유전자를 기준으로 한 상대적인 전사수준 비교. 야생형 균주 BW25113을 이소프레놀 무첨가(회색 막대) 또는 이소프레놀 0.5% (v/v) 첨가(검정 막대) 2YT 배지와 온도 30℃에서 6 시간 배양함.
도 9. AcrAB 결손을 통한 다양한 중사슬 알코올들에 대한 저항성 향상. 야생형 균주 BW25113 (회색 막대)와 결손주 BWΔacrAB (검정 막대)을 다양한 중사슬 알코올들이 표기된 양 만큼 첨가된 2YT 배지에서 온도 30℃로 12 시간 배양하고 생육저해 정도를 측정함.
도 10. 대장균에서의 이소프레놀 배출 기작 가설. (A) 야생형 대장균 BW25113에서의 이소프레놀 배출 제한. 세포내막(IM)의 주요 수송자인 AcrAB가 세포외막(OM) 통로 단백질인 TolC와 삼중 복합체를 형성해서 이소프레놀 배출능력을 갖는 AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI, YdiM와 같은 수송자들의 TolC와의 결합 제한. (B) 결손주 BWΔacrAB에서의 이소프레놀 배출. AcrAB 결손으로 AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI, YdiM 수송자들의 TolC와의 기능적 복합체 형성 및 이소프레놀 배출 증가. (C) 결손주 BWΔtolC에서의 이소프레놀 배출. TolC 결손으로 TolC-비의존적 경로를 통해서 이소프레놀이 배출되고 TolC-의존적 경로에 비해서 비효율적임. TolC 결손주에서 AcrD 등의 수송자들에 의해서 이소프레놀이 일단 periplasm으로 배출이 되고, 결손된 TolC를 대체하는 다른 세포외막 통로단백질 (question mark)에 의해 2단계에 걸쳐서 최종 세포 밖으로 배출되는 것으로 추정.
도 2. 이소프레놀 민감성 및 저항성 결손주들의 생육양상 검증. (A) 수송자 결손주들의 세포생육 곡선. (B) 수송자 결손주들의 생육저해(Growth inhibition, %). 민감성 결손주 BWΔacrD, BWΔemrA, BWΔmacB, BWΔmdtC, BWΔmdtJ 및 BWΔydiM; 저항성 결손주 BWΔacrA, BWΔacrB 및 BWΔtolC; 야생형 대장균 BW25113. 상기 균주들은 0.5% (v/v)의 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 30℃ 온도에서 배양하면서 6시간 마다 세포생육을 측정하였다. 세포생육 저해도는 실험방법에 기술한대로 계산함. 배양초기 저해도를 모든 균주들에 대해 50%로 표시함.
도 3. 이소프레놀 민감성 및 저항성 결손주들의 세포생육. 민감성 결손주 BWΔacrD, BWΔemrA, BWΔmacB, BWΔmdtC, BWΔmdtJ, BWΔydiM와 저항성 결손주 BWΔacrA, BWΔacrB, BWΔtolC 및 야생형 대장균 BW25113을 2YT 배지와 30℃에서 배양하고 세포생육을 6시간 마다 측정함.
도 4. 이소프레놀 저항성을 부여하는 수송자들의 전사량 정량 PCR 분석과 그들의 과발현을 통한 기능 검증. (A) 이소프레놀 첨가에 따른 전사량 변화. 대장균 BW25113를 0.5% (v/v) 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 6 시간 배양함. 전사량 변화는 이소프레놀 무첨가 배양에서의 전사량을 기준으로 표시함. (B) 결손주 BWΔacrA, BWΔacrB, BWΔtolC에서의 전사체 변화 양상. 상기 결손주들을 0.5% (v/v) 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 6 시간 배양함. 결손주 전사체 변화는 야생형 균주 BW25113에서의 전사를 기준으로 표시함. (C) 이소프레놀 배출과 관련된 수송자들의 과발현. 상기 수송자들의 유전자가 들어간 플라스미드를 갖는 야생형 균주 BW25113(사각형)와 결손주 BWΔacrAB(원형)에서의 생육저해를 비교함. 상기 균주에서 수송자 플라스미드 대신에 공벡터인 pTrc99A로 형질전환 된 균주의 생육저해는 위 점선(야생형 균주)과 아래 점선(결손주)으로 표시함. 모든 균주들은 0.5% (v/v) 이소프레놀과 0.1 mM IPTG가 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함.
도 5. IPTG 무첨가 조건에서 이소프레놀 저항성과 관련된 수송자 발현 플라스미드로 형질전환된 야생형 균주 BW25113 (사각형)와 결손주 BWΔacrAB (원형)의 이소프레놀에 대한 생육저해. 대조구로 공벡터인 pTrc99A로 형질전환 된 야생형 균주(위 점선)과 결손주(아래 점선)를 사용함. 모든 균주들은 0.5% (v/v) 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함.
도 6. 이소프레놀 저항성과 관련된 수송자 단백질들의 SDS-PAGE를 발현 분석. (A) IPTG 발현유도 안함, (B) 배양초기에 0.2 mM IPTG로 발현 유도. 하기의 플라스미드들로 형질전환 된 야생형 균주 BW25113을 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함; pTrc99A (lane 1), pT-acrD (lane 2) pT-emrAB (lane 3), pT-ydiM (lane 4), pT-mdtJI (lane 5), pT-macAB (lane 6) pT-mdtBC (lane 7), pT-tolC (lane 8). 발현 대상 단백질들의 이론 분자량: 113 kDa (AcrD), 43 kDa (EmrA), 57 kDa (EmrB), 45 kDa (YdiM), 41kDa (MacA), 70 kDa (MacB), 112 kDa (MdtB), 110 kDa (MdtC), and 54 kDa (TolC). 글자 M은 PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific, IL)를 표시함.
도 7. 이소프레놀 배출에서의 TolC의 역할. 모든 결손주들은 0.5% (v/v) (회색 막대) 또는 0.75% (v/v) (검정 막대)의 이소프레놀이 첨가된 2YT 배지와 온도 30℃에서 12 시간 배양함. 대조구로 야생형 균주 BW25113의 0.5% (v/v) (아래 점선)와 0.75% (v/v) (위 점선) 이소프레놀에 대한 생육저해를 사용함.
도 8. 이소프레놀 저항성 관련 유전자들의 acrB 유전자를 기준으로 한 상대적인 전사수준 비교. 야생형 균주 BW25113을 이소프레놀 무첨가(회색 막대) 또는 이소프레놀 0.5% (v/v) 첨가(검정 막대) 2YT 배지와 온도 30℃에서 6 시간 배양함.
도 9. AcrAB 결손을 통한 다양한 중사슬 알코올들에 대한 저항성 향상. 야생형 균주 BW25113 (회색 막대)와 결손주 BWΔacrAB (검정 막대)을 다양한 중사슬 알코올들이 표기된 양 만큼 첨가된 2YT 배지에서 온도 30℃로 12 시간 배양하고 생육저해 정도를 측정함.
도 10. 대장균에서의 이소프레놀 배출 기작 가설. (A) 야생형 대장균 BW25113에서의 이소프레놀 배출 제한. 세포내막(IM)의 주요 수송자인 AcrAB가 세포외막(OM) 통로 단백질인 TolC와 삼중 복합체를 형성해서 이소프레놀 배출능력을 갖는 AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI, YdiM와 같은 수송자들의 TolC와의 결합 제한. (B) 결손주 BWΔacrAB에서의 이소프레놀 배출. AcrAB 결손으로 AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI, YdiM 수송자들의 TolC와의 기능적 복합체 형성 및 이소프레놀 배출 증가. (C) 결손주 BWΔtolC에서의 이소프레놀 배출. TolC 결손으로 TolC-비의존적 경로를 통해서 이소프레놀이 배출되고 TolC-의존적 경로에 비해서 비효율적임. TolC 결손주에서 AcrD 등의 수송자들에 의해서 이소프레놀이 일단 periplasm으로 배출이 되고, 결손된 TolC를 대체하는 다른 세포외막 통로단백질 (question mark)에 의해 2단계에 걸쳐서 최종 세포 밖으로 배출되는 것으로 추정.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 실험재료 및 방법
(1) 화합물 및 시약
제한효소와 T4 DNA ligase는 New England Biolabs (Beverly, MA); Oligodeoxynucleotides는 Bioneer (Daejoen, Korea); RNA extraction and quantitative PCR kits는 Qiagen (Seoul, Korea)에서 구입하였다. Isoprenol, 1-butanol, 1-isopentanol, 1-pentanol and 1-hexanol은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
(2) 균주와 배양조건
유전자 클로닝을 위한 숙주로 대장균 DH5α(F-, λ-, endA1, glnV44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96, deoR, φ80, dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF) U169, hsdR17(rK mK+), supE44)를 이용하였다. 다약물 수송자 결손 실험에는 대장균 BW25113 (F-, λ-, rrnB-3, ΔlacZ4787, Δ(araD-araB)567, hsdR514, Δ(rhaD-rhaB) 568, rph-1)와 이 균주에서 다약물 수송 유전자들을 제거한 결손주들을 이용했다. 상기 유전자들의 결손은 λ Red recombinase 기반 재조합방법을 이용해서 대장균 BW25113으로부터 제거하였다. 미생물 배양은 온도 37℃ 또는 30℃에서 2YT 배지(Bacto-tryptone 16 g, Bacto-yeast extract 10 g, and sodium chloride 5 g per liter, adjust to pH 7.0)를 이용해서 진행하였고, 필요에 따라서 항생제 Kanamycin (50 ㎍/L)과 chloramphenicol (40㎍/L)을 첨가하였다. 균체 농도는 분광광도계 DU 730 (Beckman Coulter, Seoul, Korea)을 이용해서 600 nm(OD600)에서 측정하였다.
45종의 다약물 수송자 결손주는 하기 표 1에 나타내었다. 각 균주는 명칭에 표지된 macA, macB 등 수송자가 결손된 균주로서, 각 수송자를 코딩하는 유전자의 Gene Synonym은 Keio collection의 Keio No로 나타내었다.
| 명칭 | Keio No. | MDT Families |
명칭 | Keio No. | MDT families |
| BWΔmacA | JW0862 | ABC | BWΔcmr | JW0826 | MFS |
| BWΔmacB | JW0863 | ABC | BWΔemrA | JW2660 | MFS |
| BWΔmdlA | JW0438 | ABC | BWΔemrB | JW2661 | MFS |
| BWΔmdlB | JW5061 | ABC | BWΔemrD | JW5634 | MFS |
| BWΔmglB | JW2137 | ABC | BWΔemrK | JW2364 | MFS |
| BWΔrbbA | JW5676 | ABC | BWΔemrY | JW2365 | MFS |
| BWΔyddA | JW5242 | ABC | BWΔfsr | JW0468 | MFS |
| BWΔyojI | JW2199 | ABC | BWΔhsrA | JW3733 | MFS |
| BWΔacrA | JW0451 | RND | BWΔmdtD | JW2077 | MFS |
| BWΔacrB | JJW0452 | RND | BWΔmdtG | JW1040 | MFS |
| BWΔacrD | JW2454 | RND | BWΔmdtH | JW1052 | MFS |
| BWΔacrE | JW3233 | RND | BWΔmdtL | JW3688 | MFS |
| BWΔacrF | JW3234 | RND | BWΔyajR | JW5059 | MFS |
| BWΔcusA | JW0564 | RND | BWΔydeA | JW1521 | MFS |
| BWΔmdtA | JW5338 | RND | BWΔydeE | JW1527 | MFS |
| BWΔmdtB | JW2060 | RND | BWΔydiM | JW1680 | MFS |
| BWΔmdtC | JW2061 | RND | BWΔydhC | JW1652 | MFS |
| BWΔmdtE | JW3481 | RND | BWΔyebQ | JW5299 | MFS |
| BWΔmdtF | JW3482 | RND | BWΔyjiO | JW4300 | MFS |
| BWΔemrE | JW0531 | SMR | BWΔynfM | JW1588 | MFS |
| BWΔmdtI | JW1591 | SMR | BWΔmdtK | JW1655 | MATE |
| BWΔmdtJ | JW1592 | SMR | BWΔtoC | JW5503 | OMP |
| BWΔsugE | JW5738 | SMR | BWΔacrAB | - | - |
| BWΔbcr | JW5363 | MFS | BWΔABC | - | - |
(3)
중사슬
알코올에 대한 생육저해
, 상대적 감수성, 저항성 측정
4 mL의 생육배지가 담긴 배양시험관에 이소프레놀과 다른 중사슬 알코올들을 다양한 농도로 각각 첨가한 것과 첨가하지 않은 것에 밤새 키운 종 배양액을 균체 탁도 (OD600)가 0.1이 되게 접종하고 균체 생육량의 변화를 관찰하였다. 생육저해 정도[Growth inhibition (%)]을 (1 - OD600 with CmOHs / OD600 without CmOHs) × 100으로 정의하였다. 상대적 감수성[Relative susceptibility (Strain A to Strain B, %)]는 (growth inhibition of Strain A / growth inhibition of Strain B) × 100으로 계산하였다. 상대적 저항성은 [(1- growth inhibition of Strain A) / (1- growth inhibition of Strain B)] × 100으로 계산하였다.
(4) 정량
PCR
분석(Quantitative
PCR
analysis)
대장균 BW25113과 그의 결손주들의 전체 RNA를 RNeasy® mini Kit (Qiagen, Seoul, Korea)를 이용해서 분리하고, RNase-Free DNase Set (Qiagen, Seoul, Korea)를 이용해서 잔존 DNA들 을 제거하였다. Rotor-gene® Q cycler (Qiagen, Seoul, Korea) 장비와 Rotor-GeneTM SYBR® Green RT-PCR Kit (Qiagen, Seoul, Korea)를 이용해서 상기 추출 총 RNA 시료들의 역전사와 정량 PCR을 진행하였다. 하우스키핑 유전자인 cysG를 타겟 유전자들의 전사량 변화를 측정하는 기본 유전자로 사용했다. 정량 PCR에 사용된 프라이머들은 표 2에 표시하였다.
| 명칭 | 서열(5' to 3') | 서열번호 | Amplicon Sizes | References |
| QacrA-F | CTTAGCCCTAACAGGATGTG | 22 | 189 bp | (Viveiros et al., 2007) |
| QacrA-R | TTGAAATTACGCTTCAGGAT | 23 | ||
| QacrB-F | CGTACACAGAAAGTGCTCAA | 24 | 183 bp | (Viveiros et al., 2007) |
| QacrB-R | CGCTTCAACTTTGTTTTCTT | 25 | ||
| QtolC-F | CCGGGATTTCTGACACCTCTT | 26 | 89 bp | (Lamikanra et al., 2011) |
| QtolC-R | TTTGTTCTGGCCCATATTGCT | 27 | ||
| QemrA-F | CACCGGTAAAGTGGTTGGTC | 28 | 156 bp | (Bohnert et al., 2007) |
| QemrA-R | ATACGCAGCGGATATTGCTC | 29 | ||
| QmacB-F | GGCTGGAAGACCGTACAGAG | 30 | 118 bp | (Bohnert et al., 2007) |
| QmacB-R | GTTGGTTCATCGGCAAGAAT | 31 | ||
| QmdtC-F | ATCTCGATCCCGAAAACCTT | 32 | 167 bp | (Bohnert et al., 2007) |
| QmdtC-R | CCTGTAAAGCCGGTGACATT | 33 | ||
| QmdtJ-F | ATTAGGTCTGGCTATTGCTA | 34 | 137 bp | (Zhou et al., 2012) |
| QmdtJ-R | TAACGGCGAAAGAGAGAA | 35 | ||
| QacrD-F | TCCTTGCTGGTGGTATTCCT | 36 | 223 bp | (Bohnert et al., 2007) |
| QacrD-R | TGGCCTTTTTGGTTCATCTC | 37 | ||
| QydiM-F | TTAGCCAGTTATACCTTATATGG | 38 | 114 bp | This study |
| QydiM-R | GATCGACATAGTGTATGACATGC | 39 | ||
| QcysG-F | TTGTCGGCGGTGGTGATGTC | 40 | 105 bp | (Zhou et al., 2011) |
| QcysG-R | ATGCGGTGAACTGTGGAATAAACG | 41 |
(5) 플라스미드 구축
대장균 BW25113의 게놈 DNA로부터 AcrD(서열번호 16), EmrAB(서열번호 17), MacAB(서열번호 18), MdtBC(서열번호 19), MdtJI(서열번호 20), YdiM(서열번호 21) 유전자들을 표 3에 나타낸 PCR 프라이머들을 이용해서 증폭하였다. acrD, emrAB, mdtJI, ydiM 유전자들의 PCR 산물을 제한효소 BamHI과 SalI을 이용해서 절단하고, 발현벡터 pTrc99A (Amersham Biosciences (Piscataway, NJ), GenBank 번호 U13872.1)의 해당 제한효소 부위에 도입해서 pT-acrD, pT-emrAB, pT-mdtJI, pT-ydiM를 만들었다. mdtBC 유전자 PCR 산물은 BglII과 XhoI으로 절단하고 상기 벡터의 BamHI-SalI 제한효소 부위에 도입해서 pT-mdtBC를 구축하였다. macAB 유전자 PCR 산물은 KpnI과 XbaI 을 이용해서 절단하고, 발현벡터 pTrc99A의 해당 제한효소 부위에 도입해서 pT-macAB을 구축하였다. 이 발명에 이용된 모든 플라스미드들은 표 4에 표시하였다.
| 명칭 | 서열(5' to 3') | 서열번호 |
| acrD-BamH-F | GACGGATCCAAGAGGTCCTCTTTTAATGGCGAATTTC | 42 |
| acrD-Sal-R | GATGTCGAC TTATTCCGGGCGCGGCTTCAGCGG | 43 |
| emrAB-BamH-F | AGGATCCAGGAGAACAATATGAGCGCAAATGCG | 44 |
| emrAB-Sal-R | GATGTCGAC TTAGTGCGCACCGCCTCCGCCG | 45 |
| macAB-Kpn-F | GTGGTACCAGGGAGAAAATTTATGAAAAAGCGGAAAAC | 46 |
| macAB-Xba-R | CTTCTAGAGAAGCGGCAGTCGCATAGC | 47 |
| mdtBC-Bgl-F | TCGAGATCT AAGGAGCACGCTCCTGATGCAGGTGTTAC | 48 |
| mdtBC-Xho-R | CTACTCGAG TTACTCGGTTACCGTTTGTTTAGGTTTACGC | 49 |
| mdtJI-BamH-F | GACGGATCCTTGCAGGAGAAGGACAATGTATATTTATTG | 50 |
| mdtJI-Sal-R | GATGTCGAC TTATCAGGCAAGTTTCACCATGATC | 51 |
| ydiM-BamH-F | GACGGATCCAAGAGGTAGAACCTATGAAAAATCCCTATTTC | 52 |
| ydiM-Sal-R | GATGTCGAC TGCATTACCCACCCGGAGCGAC | 53 |
| 명칭 | 설명 | References |
| pTrc99A | P trc promoter, pBR322 origin, lacI q, and Ampr | - |
| pT-acrD | pTrc99A containing acrD gene | - |
| pT-emrAB | pTrc99A containing emrAB operon | - |
| pT-macAB | pTrc99A containing macAB operon | - |
| pT-mdtBC | pTrc99A containing mdtBC operon | - |
| pT-mdtJI | pTrc99A containing mdtJI operon | - |
| pT-ydiM | pTrc99A containing ydiM gene | - |
| pT-tolC | pTrc99A containing tolC gene | (Shah et al., 2013) |
| pKD13 | Template plasmid for gene disruption | (Datsenko and Wanner, 2000) |
| pCP 20 | Removal of kanamycin resistance cassette | (Datsenko and Wanner, 2000) |
2. 결과
(1)
이소프레놀
저항성 감소를 유발하는
다약물
수송자 결손
이소프레놀은 1.14의 octanol/water partition coefficient (logPo/w)를 갖는 불포화 5탄소 알코올이다. logPo/w 값이 1 - 5 인 화합물들은 세포에 독성을 갖는다. 야생형 대장균 BW 25113은 0.5 % (v/v) 이소프레놀 농도에서 세포생육이 약 50% 정도 저해를 받는다. 이소프레놀 배출에 관련된 수송자를 발굴하기 위해서 44개의 다약물 수송자 결손주들의 생육을 0.5 % (v/v) 이소프레놀 농도에서 12시간 동안 관찰하였다(도 1C). 어떤 결손주가 야생형 균주에 비해서 감소된 생육을 보인다면 그 감쇄 또는 결실된 수송자는 이소프레놀 배출과 관련이 있을 것이다.
야생형 균주에 비해서 약 52.5% 이상의 세포생육 저해를 보이는 결손주가 17개가 동정되었다. 이들 중에서 특히 AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI, YdiM가 감쇄 또는 결실된 6개의 결손주에서는 세포생육이 약 57.5% 이상 감소하였다. 즉 이소프레놀에 대한 감수성이 야생형에 비해서 약 15% 이상 높은 것이다. 이들 결손이 세포생육에 미치는 영향을 시간별로 보면 이소프레놀 존재 하에서 심각한 생육저해를 관찰할 수 있다(도 2). 반면에 이소프레놀이 없는 조건에서는 야생형과 결손주간의 생육 차이는 거의 없었다(도 3).
이소프레놀 존재 하에서의 야생형 대장균 BW 25113의 유전자 발현 변화를 정량 PCR로 분석하였다. 이소프레놀 존재 하에서 상기 발굴된 6개의 다약물 수송 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 특히 약 2.3배 전사량(transcription level)이 증가하였다(도 4A).
결과를 종합하면 상기 6개의 다약물 수송자는 이소프레놀을 배출해서 대장균에 대한 이소프레놀의 독성을 경감시키는 것으로 추정된다. 따라서 이들 다약물 수송자들을 대장균 BW25113에서 과발현시키고 이소프레놀 저항성의 증가를 관찰하였다(도 4C, 도 5).
EmrAB 과발현 균주에서 0.5% (v/v) 이소프레놀에 의한 생육저해는 32.4%로 저항성이 약 1.4 배 증가하였다. 그러나, 다른 과발현 균주들에서는 저항성의 증가가 크지 않았다. 그것은 세포막이라는 제한된 공간에서 막 단백질들의 과발현이 제한이 되기 때문이다. 실제 상기 수송자들을 과발현시킨 균주들에서 수송자 단백질들의 명확한 발현량 증가가 관찰되지 않았다(도 6).
(2)
AcrAB
결손을 통한
이소프레놀
저항성 향상
다약물 수송자 결손 실험에서 흥미로운 것은 예상과는 반대로 11개의 결손주들에서 야생형 균주보다 이소프레놀 저항성이 증가하였다(도 1C). 가장 저항성이 큰 결손주 BWΔacrA와 BWΔacrB의 경우에 생육저해는 0.5% (v/v)의 이소프레놀 첨가에서 약 23% 정도로 매우 낮았다(도 1C, 도 2).
이러한 저항성 증가가 유전자 acrA와 acrB 결손이 이소프레놀 배출과 관련된 실시예 1의 6개의 다약물 수송자의 발현을 증가시키는 것에 기인하는 것을 조사하기 위해서 상기 6개 수송자의 mRNA 양, 즉 전사수준을 측정하였다(도 4B). 하지만 acrD 유전자의 전사량이 0.8 배 증가한 것을 제외하고는 다른 5개의 유전자들에서는 큰 변화가 없었다. 아울러 유전자 acrA와 acrB의 이중 결손주인 BWΔacrAB의 저항성은 단일 결손주인 BWΔacrA와 BWΔacrB에 비해서 큰 차이가 없었다(도 7).
이상의 결과들로 볼 때에 결손주 BWΔacrA 및 BWΔacrB에서의 저항성의 증가는 AcrAB 수송자의 불활성화에 기인하는 것이고, 실시예 1에서 규명된 6개의 다약물 수송자의 발현량과는 관계가 없음을 알았다.
(3)
이소프레놀의
TolC
-의존 및
TolC
-비의존적 경로에 의한 배출
RND 계열 수송자인 AcrAB는 세포외막 통로 단백질인 TolC와 복합체(tripartite AcrAB-TolC complex )를 형성해서 세포내의 독성물질을 배출하는 역할을 한다. 하지만 TolC는 다양한 다른 수송자들(AcrD, MacAB, EmrAB, MdtBC 등)과도 복합체를 형성해서 독성물질을 배출하는 역할을 한다. 따라서 TolC는 독성물질 배출에서 중요한 역할을 담당할 것으로 추정되어서 결손주인 BWΔtolC의 저항성을 0.5% (v/v)의 이소프레놀 농도에서 조사하였다(도 1C, 도 2). 예상과는 반대로 tolC 결손주의 생육저해는 33.9%로 이소프레놀 저항성이 증가하였다. 이것은 tolC가 결손되었을 때에 활성화 되는 TolC-비의존적인 경로에 의해서 이소프레놀이 배출되는 것으로 추정된다. 그러나 tolC 결손이 acrA 또는 acrB 결손보다는 저항성이 낮았기 때문에 TolC-의존적 경로가 TolC-비의존적 경로 보다 이소프레놀 배출에 효과적인 것으로 추정된다(도 2, 도 4).
0.5% (v/v) 이소프레놀 농도에서 결손주 BWΔtolC의 저항성은 결손주 BWΔacrB 보다 약 88.3%로 낮았고, 0.75% (v/v) 이소프레놀 농도에서는 69.6%로 더 낮아졌다(도 7). 그리고 AcrAB와 TolC 결손에 의한 저항성 증가가 각각 독립적인 기작에 의한 것인가를 보기 위해서 이들 유전자들이 모두 결손 된 삼중 결손주 BWΔABC를 만들고 AcrAB 결손주 및 TolC 결손주와 비교하였다. 삼중 결손주의 저항성은 개별 결손주들의 저항성 보다 높지 않았고, 결손주 BWΔtolC와 유사했다(도 7). 이것은 AcrAB 결손에 의한 저항성 증가가 TolC-의존적 배출기작에 의한 것임을 시사한다.
TolC는 다양한 수송자들과 역동적으로 상호작용을 하면서 세포 밖으로 물질을 배출하는 것으로 알려져 있다. TolC가 다양한 수송자들 중에서 어떤 수송자와 결합을 하느냐 하는 것은 수송자와의 친화도 및 수송자의 분포량과 관계가 있다. AcrAB는 주요 다약물 수송자(a major MDT)로 세포 내에서 항상 고발현 되고 있다. 정량 PCR 분석결과에 따르면 acrB는 상기 규명된 6개의 다약물 수송자들보다 항상 약 6.5 배 이상 높은 전사량을 보여준다(도 8). 특히, 이소프레놀 존재 하에서 acrAB 오페론의 전사량은 더 증가하였다(도 4A). 따라서, 야생형 대장균 BW25113에서 TolC는 주요 수송자인 AcrAB에 의해 과도하게 점유되어 다른 수송자들과 결합을 할 수 없지만, AcrAB 결손주에서는 이소프레놀 배출능력이 있는 수송자들인 AcrD, MacAB, EmrAB와도 복합체를 형성하게 되는 것으로 추정된다. TolC가 이소프레놀 저항성에 중요하기 때문에 TolC를 BW25113와 결손주 BWΔacrAB에서 과발현을 시킨 결과 저항성의 향상은 없었다(도 4C). 이것은 이미 TolC가 과발현을 유도하지 않아도 고발현 되고 있기 때문이다(도 8). 결손주 BWΔacrAB에서 실시예 1에서 규명된 6개의 다약물 수송자들의 과발현도 저항성을 추가적으로 향상시키지는 못했다(도 4C). 이것은 세포막(내막 및 외막)에서 막단백질의 과발현은 세포막이라는 제한된 공간에서 충분하게 발현될 수 없기 때문이다.
상기 결과를 종합하면 이소프레놀 배출과 관련이 없는 AcrAB 수송자를 제거함으로써 이소프레놀 배출관 관련이 있는 수송자들을 위한 세포막에서 공간 및 TolC에 대한 접근성이 증가하기 때문인 것으로 결론 내려진다.
(4)
AcrAB
수송자 결손주의 일반적인
중사슬
알코올들에 대한 저항성 증가
결손주 BWΔacrAB가 이소프레놀 뿐만 아니라 다른 중사슬 알코올들에 대해서도 보편적으로 저항성을 갖는가를 조사하기 위해서 표 5에 나타낸 바와 같은 다양한 화학적 구조와 성질을 갖는 중사슬 알코올들을 이용해서 실험을 수행했다.
실험 결과 결손주 BWΔacrAB는 모든 중사슬 알코올에 대해서 야생형 균주 BW25113 보다 높은 저항성을 가졌다(도 9). 수송자들은 각자의 기질 특이성을 갖고 있기 때문에 특정 수송자를 조작해서 다양한 중사슬 알코올에 대한 저항성을 얻는 것은 불가능하다. 그러나 이들 수송자들은 일반적으로 TolC와 함께 작용을 하기 때문에 AcrAB 결손은 중사슬 알코올 배출에 관련된 다양한 수송자들에 대한 TolC의 이용성을 증가시켜서 저항성 향상을 유도하는 것으로 추정할 수 있다. 즉 상시 발현되는 주요 수송자 AcrAB를 결손시킴으로써 특정 알코올에 의해 발현이 유도된 수송자가 TolC와 기능적인 복합체를 더 용이하게 형성할 수 있는 것이다.
| 명칭 | 화학식 | 화학 구조 | 분자량 (g/몰) |
API gravitiesa | Heat combustionb (MJ/L) |
logPO / W c | Fuel in water (%) |
| 가솔린 | - | - | 100-105 | 50-65 | 34.8 | - | ND |
| 에탄올 | C2OH |
 |
46.1 | 48 | 23.4 | - | 100 |
| n-부탄올 | C4OH |
 |
74.1 | 43 | 29.3 | 1.12 | 7.3 |
| n-펜탄올 | C5OH |
 |
88.2 | 43 | 30.6 | 1.62 | 2.2 |
| i-펜탄올 | 3M-C4OH |
 |
88.2 | 43 | 30.5 | 1.33 | 2.8 |
| n-헥산올 | C6OH |
 |
102.2 | 42 | 31.7 | 2.13 | 0.6 |
| 이소프레놀 | 3M-3=C4OH |
 |
86.1 | 34 | 30.7 | 1.14 | ND |
| 이소프레놀 이성질체 1 | 3M-2=C4OH |
 |
86.1 | 35 | 30.5 | 1.36 | 17 |
| 이소프레놀 이성질체 2 | 2M-3=C4OH |
 |
86.1 | 38 | 30.0 | 1.07 | ND |
<110> GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY OFFICE OF ACADEMY AND INDUSTRY COLLABORATION
<120> METHOD FOR INCREASING ALCOHOL TOLERANCE OF MICROORGANISM AND
MICROORGANISM PREPARING THE SAME
<130> 15P05046
<160> 53
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 397
<212> PRT
<213> AcrA from E.coli BW5113
<400> 1
Met Asn Lys Asn Arg Gly Phe Thr Pro Leu Ala Val Val Leu Met Leu
1 5 10 15
Ser Gly Ser Leu Ala Leu Thr Gly Cys Asp Asp Lys Gln Ala Gln Gln
20 25 30
Gly Gly Gln Gln Met Pro Ala Val Gly Val Val Thr Val Lys Thr Glu
35 40 45
Pro Leu Gln Ile Thr Thr Glu Leu Pro Gly Arg Thr Ser Ala Tyr Arg
50 55 60
Ile Ala Glu Val Arg Pro Gln Val Ser Gly Ile Ile Leu Lys Arg Asn
65 70 75 80
Phe Lys Glu Gly Ser Asp Ile Glu Ala Gly Val Ser Leu Tyr Gln Ile
85 90 95
Asp Pro Ala Thr Tyr Gln Ala Thr Tyr Asp Ser Ala Lys Gly Asp Leu
100 105 110
Ala Lys Ala Gln Ala Ala Ala Asn Ile Ala Gln Leu Thr Val Asn Arg
115 120 125
Tyr Gln Lys Leu Leu Gly Thr Gln Tyr Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp
130 135 140
Gln Ala Leu Ala Asp Ala Gln Gln Ala Asn Ala Ala Val Thr Ala Ala
145 150 155 160
Lys Ala Ala Val Glu Thr Ala Arg Ile Asn Leu Ala Tyr Thr Lys Val
165 170 175
Thr Ser Pro Ile Ser Gly Arg Ile Gly Lys Ser Asn Val Thr Glu Gly
180 185 190
Ala Leu Val Gln Asn Gly Gln Ala Thr Ala Leu Ala Thr Val Gln Gln
195 200 205
Leu Asp Pro Ile Tyr Val Asp Val Thr Gln Ser Ser Asn Asp Phe Leu
210 215 220
Arg Leu Lys Gln Glu Leu Ala Asn Gly Thr Leu Lys Gln Glu Asn Gly
225 230 235 240
Lys Ala Lys Val Ser Leu Ile Thr Ser Asp Gly Ile Lys Phe Pro Gln
245 250 255
Asp Gly Thr Leu Glu Phe Ser Asp Val Thr Val Asp Gln Thr Thr Gly
260 265 270
Ser Ile Thr Leu Arg Ala Ile Phe Pro Asn Pro Asp His Thr Leu Leu
275 280 285
Pro Gly Met Phe Val Arg Ala Arg Leu Glu Glu Gly Leu Asn Pro Asn
290 295 300
Ala Ile Leu Val Pro Gln Gln Gly Val Thr Arg Thr Pro Arg Gly Asp
305 310 315 320
Ala Thr Val Leu Val Val Gly Ala Asp Asp Lys Val Glu Thr Arg Pro
325 330 335
Ile Val Ala Ser Gln Ala Ile Gly Asp Lys Trp Leu Val Thr Glu Gly
340 345 350
Leu Lys Ala Gly Asp Arg Val Val Ile Ser Gly Leu Gln Lys Val Arg
355 360 365
Pro Gly Val Gln Val Lys Ala Gln Glu Val Thr Ala Asp Asn Asn Gln
370 375 380
Gln Ala Ala Ser Gly Ala Gln Pro Glu Gln Ser Lys Ser
385 390 395
<210> 2
<211> 1049
<212> PRT
<213> AcrB from E.coli BW5113
<400> 2
Met Pro Asn Phe Phe Ile Asp Arg Pro Ile Phe Ala Trp Val Ile Ala
1 5 10 15
Ile Ile Ile Met Leu Ala Gly Gly Leu Ala Ile Leu Lys Leu Pro Val
20 25 30
Ala Gln Tyr Pro Thr Ile Ala Pro Pro Ala Val Thr Ile Ser Ala Ser
35 40 45
Tyr Pro Gly Ala Asp Ala Lys Thr Val Gln Asp Thr Val Thr Gln Val
50 55 60
Ile Glu Gln Asn Met Asn Gly Ile Asp Asn Leu Met Tyr Met Ser Ser
65 70 75 80
Asn Ser Asp Ser Thr Gly Thr Val Gln Ile Thr Leu Thr Phe Glu Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Ala Asp Ile Ala Gln Val Gln Val Gln Asn Lys Leu Gln
100 105 110
Leu Ala Met Pro Leu Leu Pro Gln Glu Val Gln Gln Gln Gly Val Ser
115 120 125
Val Glu Lys Ser Ser Ser Ser Phe Leu Met Val Val Gly Val Ile Asn
130 135 140
Thr Asp Gly Thr Met Thr Gln Glu Asp Ile Ser Asp Tyr Val Ala Ala
145 150 155 160
Asn Met Lys Asp Ala Ile Ser Arg Thr Ser Gly Val Gly Asp Val Gln
165 170 175
Leu Phe Gly Ser Gln Tyr Ala Met Arg Ile Trp Met Asn Pro Asn Glu
180 185 190
Leu Asn Lys Phe Gln Leu Thr Pro Val Asp Val Ile Thr Ala Ile Lys
195 200 205
Ala Gln Asn Ala Gln Val Ala Ala Gly Gln Leu Gly Gly Thr Pro Pro
210 215 220
Val Lys Gly Gln Gln Leu Asn Ala Ser Ile Ile Ala Gln Thr Arg Leu
225 230 235 240
Thr Ser Thr Glu Glu Phe Gly Lys Ile Leu Leu Lys Val Asn Gln Asp
245 250 255
Gly Ser Arg Val Leu Leu Arg Asp Val Ala Lys Ile Glu Leu Gly Gly
260 265 270
Glu Asn Tyr Asp Ile Ile Ala Glu Phe Asn Gly Gln Pro Ala Ser Gly
275 280 285
Leu Gly Ile Lys Leu Ala Thr Gly Ala Asn Ala Leu Asp Thr Ala Ala
290 295 300
Ala Ile Arg Ala Glu Leu Ala Lys Met Glu Pro Phe Phe Pro Ser Gly
305 310 315 320
Leu Lys Ile Val Tyr Pro Tyr Asp Thr Thr Pro Phe Val Lys Ile Ser
325 330 335
Ile His Glu Val Val Lys Thr Leu Val Glu Ala Ile Ile Leu Val Phe
340 345 350
Leu Val Met Tyr Leu Phe Leu Gln Asn Phe Arg Ala Thr Leu Ile Pro
355 360 365
Thr Ile Ala Val Pro Val Val Leu Leu Gly Thr Phe Ala Val Leu Ala
370 375 380
Ala Phe Gly Phe Ser Ile Asn Thr Leu Thr Met Phe Gly Met Val Leu
385 390 395 400
Ala Ile Gly Leu Leu Val Asp Asp Ala Ile Val Val Val Glu Asn Val
405 410 415
Glu Arg Val Met Ala Glu Glu Gly Leu Pro Pro Lys Glu Ala Thr Arg
420 425 430
Lys Ser Met Gly Gln Ile Gln Gly Ala Leu Val Gly Ile Ala Met Val
435 440 445
Leu Ser Ala Val Phe Val Pro Met Ala Phe Phe Gly Gly Ser Thr Gly
450 455 460
Ala Ile Tyr Arg Gln Phe Ser Ile Thr Ile Val Ser Ala Met Ala Leu
465 470 475 480
Ser Val Leu Val Ala Leu Ile Leu Thr Pro Ala Leu Cys Ala Thr Met
485 490 495
Leu Lys Pro Ile Ala Lys Gly Asp His Gly Glu Gly Lys Lys Gly Phe
500 505 510
Phe Gly Trp Phe Asn Arg Met Phe Glu Lys Ser Thr His His Tyr Thr
515 520 525
Asp Ser Val Gly Gly Ile Leu Arg Ser Thr Gly Arg Tyr Leu Val Leu
530 535 540
Tyr Leu Ile Ile Val Val Gly Met Ala Tyr Leu Phe Val Arg Leu Pro
545 550 555 560
Ser Ser Phe Leu Pro Asp Glu Asp Gln Gly Val Phe Met Thr Met Val
565 570 575
Gln Leu Pro Ala Gly Ala Thr Gln Glu Arg Thr Gln Lys Val Leu Asn
580 585 590
Glu Val Thr His Tyr Tyr Leu Thr Lys Glu Lys Asn Asn Val Glu Ser
595 600 605
Val Phe Ala Val Asn Gly Phe Gly Phe Ala Gly Arg Gly Gln Asn Thr
610 615 620
Gly Ile Ala Phe Val Ser Leu Lys Asp Trp Ala Asp Arg Pro Gly Glu
625 630 635 640
Glu Asn Lys Val Glu Ala Ile Thr Met Arg Ala Thr Arg Ala Phe Ser
645 650 655
Gln Ile Lys Asp Ala Met Val Phe Ala Phe Asn Leu Pro Ala Ile Val
660 665 670
Glu Leu Gly Thr Ala Thr Gly Phe Asp Phe Glu Leu Ile Asp Gln Ala
675 680 685
Gly Leu Gly His Glu Lys Leu Thr Gln Ala Arg Asn Gln Leu Leu Ala
690 695 700
Glu Ala Ala Lys His Pro Asp Met Leu Thr Ser Val Arg Pro Asn Gly
705 710 715 720
Leu Glu Asp Thr Pro Gln Phe Lys Ile Asp Ile Asp Gln Glu Lys Ala
725 730 735
Gln Ala Leu Gly Val Ser Ile Asn Asp Ile Asn Thr Thr Leu Gly Ala
740 745 750
Ala Trp Gly Gly Ser Tyr Val Asn Asp Phe Ile Asp Arg Gly Arg Val
755 760 765
Lys Lys Val Tyr Val Met Ser Glu Ala Lys Tyr Arg Met Leu Pro Asp
770 775 780
Asp Ile Gly Asp Trp Tyr Val Arg Ala Ala Asp Gly Gln Met Val Pro
785 790 795 800
Phe Ser Ala Phe Ser Ser Ser Arg Trp Glu Tyr Gly Ser Pro Arg Leu
805 810 815
Glu Arg Tyr Asn Gly Leu Pro Ser Met Glu Ile Leu Gly Gln Ala Ala
820 825 830
Pro Gly Lys Ser Thr Gly Glu Ala Met Glu Leu Met Glu Gln Leu Ala
835 840 845
Ser Lys Leu Pro Thr Gly Val Gly Tyr Asp Trp Thr Gly Met Ser Tyr
850 855 860
Gln Glu Arg Leu Ser Gly Asn Gln Ala Pro Ser Leu Tyr Ala Ile Ser
865 870 875 880
Leu Ile Val Val Phe Leu Cys Leu Ala Ala Leu Tyr Glu Ser Trp Ser
885 890 895
Ile Pro Phe Ser Val Met Leu Val Val Pro Leu Gly Val Ile Gly Ala
900 905 910
Leu Leu Ala Ala Thr Phe Arg Gly Leu Thr Asn Asp Val Tyr Phe Gln
915 920 925
Val Gly Leu Leu Thr Thr Ile Gly Leu Ser Ala Lys Asn Ala Ile Leu
930 935 940
Ile Val Glu Phe Ala Lys Asp Leu Met Asp Lys Glu Gly Lys Gly Leu
945 950 955 960
Ile Glu Ala Thr Leu Asp Ala Val Arg Met Arg Leu Arg Pro Ile Leu
965 970 975
Met Thr Ser Leu Ala Phe Ile Leu Gly Val Met Pro Leu Val Ile Ser
980 985 990
Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gln Asn Ala Val Gly Thr Gly Val Met
995 1000 1005
Gly Gly Met Val Thr Ala Thr Val Leu Ala Ile Phe Phe Val Pro Val
1010 1015 1020
Phe Phe Val Val Val Arg Arg Arg Phe Ser Arg Lys Asn Glu Asp Ile
1025 1030 1035 1040
Glu His Ser His Thr Val Asp His His
1045
<210> 3
<211> 493
<212> PRT
<213> TolC from E.coli BW5113
<400> 3
Met Lys Lys Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe
1 5 10 15
Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln Gln Ala
20 25 30
Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg Asp Ala
35 40 45
Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro Gln Leu
50 55 60
Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp Ala Asn
65 70 75 80
Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gln Ser
85 90 95
Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu Lys Ala
100 105 110
Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr Leu Ile
115 120 125
Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile Asp Val
130 135 140
Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Leu Asp
145 150 155 160
Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr Asp Val
165 170 175
Gln Asn Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu Val Thr
180 185 190
Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln Ile Thr
195 200 205
Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn Phe Lys
210 215 220
Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Lys
225 230 235 240
Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu Ala Arg
245 250 255
Glu Gln Ile Arg Gln Ala Gln Asp Gly His Leu Pro Thr Leu Asp Leu
260 265 270
Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Thr
275 280 285
Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly Gln Asn
290 295 300
Lys Val Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Met Val
305 310 315 320
Asn Ser Gln Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala Ser Glu
325 330 335
Gln Leu Glu Ser Ala His Arg Ser Val Val Gln Thr Val Arg Ser Ser
340 345 350
Phe Asn Asn Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Ala Val Val Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala Gly Tyr
370 375 380
Ser Val Gly Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Thr Thr
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn Ala Arg Tyr Asn Tyr Leu
405 410 415
Ile Asn Gln Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn Glu Gln
420 425 430
Asp Leu Leu Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Val Ser Thr Asn
435 440 445
Pro Glu Asn Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile Ala Asp
450 455 460
Gly Tyr Ala Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr Ser Ala
465 470 475 480
Arg Thr Thr Thr Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn
485 490
<210> 4
<211> 1194
<212> DNA
<213> AcrA from E.coli BW5113
<400> 4
atgaacaaaa acagagggtt tacgcctctg gcggtcgttc tgatgctctc aggcagctta 60
gccctaacag gatgtgacga caaacaggcc caacaaggtg gccagcagat gcccgccgtt 120
ggcgtagtaa cagtcaaaac tgaacctctg cagatcacaa ccgagcttcc gggtcgcacc 180
agtgcctacc ggatcgcaga agttcgtcct caagttagcg ggattatcct gaagcgtaat 240
ttcaaagaag gtagcgacat cgaagcaggt gtctctctct atcagattga tcctgcgacc 300
tatcaggcga catacgacag tgcgaaaggt gatctggcga aagcccaggc tgcagccaat 360
atcgcgcaat tgacggtgaa tcgttatcag aaactgctcg gtactcagta catcagtaag 420
caagagtacg atcaggctct ggctgatgcg caacaggcga atgctgcggt aactgcggcg 480
aaagctgccg ttgaaactgc gcggatcaat ctggcttaca ccaaagtcac ctctccgatt 540
agcggtcgca ttggtaagtc gaacgtgacg gaaggcgcat tggtacagaa cggtcaggcg 600
actgcgctgg caaccgtgca gcaacttgat ccgatctacg ttgatgtgac ccagtccagc 660
aacgacttcc tgcgcctgaa acaggaactg gcgaatggca cgctgaaaca agagaacggc 720
aaagccaaag tgtcactgat caccagtgac ggcattaagt tcccgcagga cggtacgctg 780
gaattctctg acgttaccgt tgatcagacc actgggtcta tcaccctacg cgctatcttc 840
ccgaacccgg atcacactct gctgccgggt atgttcgtgc gcgcacgtct ggaagaaggg 900
cttaatccaa acgctatttt agtcccgcaa cagggcgtaa cccgtacgcc gcgtggcgat 960
gccaccgtac tggtagttgg cgcggatgac aaagtggaaa cccgtccgat cgttgcaagc 1020
caggctattg gcgataagtg gctggtgaca gaaggtctga aagcaggcga tcgcgtagta 1080
ataagtgggc tgcagaaagt gcgtcctggt gtccaggtaa aagcacaaga agttaccgct 1140
gataataacc agcaagccgc aagcggtgct cagcctgaac agtccaagtc ttaa 1194
<210> 5
<211> 3150
<212> DNA
<213> AcrB from E.coli BW5113
<400> 5
atgcctaatt tctttatcga tcgcccgatt tttgcgtggg tgatcgccat tatcatcatg 60
ttggcagggg ggctggcgat cctcaaactg ccggtggcgc aatatcctac gattgcaccg 120
ccggcagtaa cgatctccgc ctcctacccc ggcgctgatg cgaaaacagt gcaggacacg 180
gtgacacagg ttatcgaaca gaatatgaac ggtatcgata acctgatgta catgtcctct 240
aacagtgact ccacgggtac cgtgcagatc accctgacct ttgagtctgg tactgatgcg 300
gatatcgcgc aggttcaggt gcagaacaaa ctgcagctgg cgatgccgtt gctgccgcaa 360
gaagttcagc agcaaggggt gagcgttgag aaatcatcca gcagcttcct gatggttgtc 420
ggcgttatca acaccgatgg caccatgacg caggaggata tctccgacta cgtggcggcg 480
aatatgaaag atgccatcag ccgtacgtcg ggcgtgggtg atgttcagtt gttcggttca 540
cagtacgcga tgcgtatctg gatgaacccg aatgagctga acaaattcca gctaacgccg 600
gttgatgtca ttaccgccat caaagcgcag aacgcccagg ttgcggcggg tcagctcggt 660
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acctctactg aagagttcgg caaaatcctg ctgaaagtga atcaggatgg ttcccgcgtg 780
ctgctgcgtg acgtcgcgaa gattgagctg ggtggtgaga actacgacat catcgcagag 840
tttaacggcc aaccggcttc cggtctgggg atcaagctgg cgaccggtgc aaacgcgctg 900
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<212> PRT
<213> AcrD from E.coli BW5113
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1 5 10 15
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Ser Ala Met Arg Lys Leu Pro Gln Ala Val Gln Asn Gln Gly Val Thr
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Thr Asp Gly Ser Met Asp Lys Gln Asp Ile Ala Asp Tyr Val Ala Ser
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<213> EmrB from E.coli BW5113
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Ala Asn Val Ala Ile Pro Thr Ile Ala Gly Asn Leu Gly Ser Ser Leu
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Gly Ile Val Ala Gly Pro Leu Ile Pro Leu Ser Gln Ser Leu Leu Leu
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130 135 140
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195 200 205
Leu Val Ile Gly Ile Gly Ser Leu Gln Ile Met Leu Asp Arg Gly Lys
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Glu Leu Asp Trp Phe Ser Ser Gln Glu Ile Ile Ile Leu Thr Val Val
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Ala Val Val Ala Ile Cys Phe Leu Ile Val Trp Glu Leu Thr Asp Asp
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275 280 285
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Ser Pro Ile Ile Gly Arg Phe Ala His Lys Leu Asp Met Arg Arg Leu
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Val Thr Phe Ser Phe Ile Met Tyr Ala Val Cys Phe Tyr Trp Arg Ala
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Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Val Ser Ile Ala Arg Ala Leu Met
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Leu Leu Thr Met Leu Gly Ile Ile Ile Gly Ile Ala Ser Val Val Ser
275 280 285
Ile Val Val Val Gly Asp Ala Ala Lys Gln Met Val Leu Ala Asp Ile
290 295 300
Arg Ser Ile Gly Thr Asn Thr Ile Asp Val Tyr Pro Gly Lys Asp Phe
305 310 315 320
Gly Asp Asp Asp Pro Gln Tyr Gln Gln Ala Leu Lys Tyr Asp Asp Leu
325 330 335
Ile Ala Ile Gln Lys Gln Pro Trp Val Ala Ser Ala Thr Pro Ala Val
340 345 350
Ser Gln Asn Leu Arg Leu Arg Tyr Asn Asn Val Asp Val Ala Ala Ser
355 360 365
Ala Asn Gly Val Ser Gly Asp Tyr Phe Asn Val Tyr Gly Met Thr Phe
370 375 380
Ser Glu Gly Asn Thr Phe Asn Gln Glu Gln Leu Asn Gly Arg Ala Gln
385 390 395 400
Val Val Val Leu Asp Ser Asn Thr Arg Arg Gln Leu Phe Pro His Lys
405 410 415
Ala Asp Val Val Gly Glu Val Ile Leu Val Gly Asn Met Pro Ala Arg
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Val Ile Gly Val Ala Glu Glu Lys Gln Ser Met Phe Gly Ser Ser Lys
435 440 445
Val Leu Arg Val Trp Leu Pro Tyr Ser Thr Met Ser Gly Arg Val Met
450 455 460
Gly Gln Ser Trp Leu Asn Ser Ile Thr Val Arg Val Lys Glu Gly Phe
465 470 475 480
Asp Ser Ala Glu Ala Glu Gln Gln Leu Thr Arg Leu Leu Ser Leu Arg
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500 505 510
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Ala Val Ile Ser Leu Val Val Gly Gly Ile Gly Val Met Asn Ile Met
530 535 540
Leu Val Ser Val Thr Glu Arg Thr Arg Glu Ile Gly Ile Arg Met Ala
545 550 555 560
Val Gly Ala Arg Ala Ser Asp Val Leu Gln Gln Phe Leu Ile Glu Ala
565 570 575
Val Leu Val Cys Leu Val Gly Gly Ala Leu Gly Ile Thr Leu Ser Leu
580 585 590
Leu Ile Ala Phe Thr Leu Gln Leu Phe Leu Pro Gly Trp Glu Ile Gly
595 600 605
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Gly Ile Leu Phe Gly Trp Leu Pro Ala Arg Asn Ala Ala Arg Leu Asp
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Pro Val Asp Ala Leu Ala Arg Glu
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<210> 11
<211> 1040
<212> PRT
<213> MdtB from E.coli BW5113
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Met Gln Val Leu Pro Pro Ser Ser Thr Gly Gly Pro Ser Arg Leu Phe
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Asp Pro Pro Ile Met Thr Leu Ala Val Thr Ser Thr Ala Met Pro Met
145 150 155 160
Thr Gln Val Glu Asp Met Val Glu Thr Arg Val Ala Gln Lys Ile Ser
165 170 175
Gln Ile Ser Gly Val Gly Leu Val Thr Leu Ser Gly Gly Gln Arg Pro
180 185 190
Ala Val Arg Val Lys Leu Asn Ala Gln Ala Ile Ala Ala Leu Gly Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Thr Val Arg Thr Ala Ile Thr Gly Ala Asn Val Asn Ser
210 215 220
Ala Lys Gly Ser Leu Asp Gly Pro Ser Arg Ala Val Thr Leu Ser Ala
225 230 235 240
Asn Asp Gln Met Gln Ser Ala Glu Glu Tyr Arg Gln Leu Ile Ile Ala
245 250 255
Tyr Gln Asn Gly Ala Pro Ile Arg Leu Gly Asp Val Ala Thr Val Glu
260 265 270
Gln Gly Ala Glu Asn Ser Trp Leu Gly Ala Trp Ala Asn Lys Glu Gln
275 280 285
Ala Ile Val Met Asn Val Gln Arg Gln Pro Gly Ala Asn Ile Ile Ser
290 295 300
Thr Ala Asp Ser Ile Arg Gln Met Leu Pro Gln Leu Thr Glu Ser Leu
305 310 315 320
Pro Lys Ser Val Lys Val Thr Val Leu Ser Asp Arg Thr Thr Asn Ile
325 330 335
Arg Ala Ser Val Asp Asp Thr Gln Phe Glu Leu Met Met Ala Ile Ala
340 345 350
Leu Val Val Met Ile Ile Tyr Leu Phe Leu Arg Asn Ile Pro Ala Thr
355 360 365
Ile Ile Pro Gly Val Ala Val Pro Leu Ser Leu Ile Gly Thr Phe Ala
370 375 380
Val Met Val Phe Leu Asp Phe Ser Ile Asn Asn Leu Thr Leu Met Ala
385 390 395 400
Leu Thr Ile Ala Thr Gly Phe Val Val Asp Asp Ala Ile Val Val Ile
405 410 415
Glu Asn Ile Ser Arg Tyr Ile Glu Lys Gly Glu Lys Pro Leu Ala Ala
420 425 430
Ala Leu Lys Gly Ala Gly Glu Ile Gly Phe Thr Ile Ile Ser Leu Thr
435 440 445
Phe Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Pro Leu Leu Phe Met Gly Asp Ile
450 455 460
Val Gly Arg Leu Phe Arg Glu Phe Ala Ile Thr Leu Ala Val Ala Ile
465 470 475 480
Leu Ile Ser Ala Val Val Ser Leu Thr Leu Thr Pro Met Met Cys Ala
485 490 495
Arg Met Leu Ser Gln Glu Ser Leu Arg Lys Gln Asn Arg Phe Ser Arg
500 505 510
Ala Ser Glu Lys Met Phe Asp Arg Ile Ile Ala Ala Tyr Gly Arg Gly
515 520 525
Leu Ala Lys Val Leu Asn His Pro Trp Leu Thr Leu Ser Val Ala Leu
530 535 540
Ser Thr Leu Leu Leu Ser Val Leu Leu Trp Val Phe Ile Pro Lys Gly
545 550 555 560
Phe Phe Pro Val Gln Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Thr Leu Gln Ala
565 570 575
Pro Gln Ser Ser Ser Phe Ala Asn Met Ala Gln Arg Gln Arg Gln Val
580 585 590
Ala Asp Val Ile Leu Gln Asp Pro Ala Val Gln Ser Leu Thr Ser Phe
595 600 605
Val Gly Val Asp Gly Thr Asn Pro Ser Leu Asn Ser Ala Arg Leu Gln
610 615 620
Ile Asn Leu Lys Pro Leu Asp Glu Arg Asp Asp Arg Val Gln Lys Val
625 630 635 640
Ile Ala Arg Leu Gln Thr Ala Val Asp Lys Val Pro Gly Val Asp Leu
645 650 655
Phe Leu Gln Pro Thr Gln Asp Leu Thr Ile Asp Thr Gln Val Ser Arg
660 665 670
Thr Gln Tyr Gln Phe Thr Leu Gln Ala Thr Ser Leu Asp Ala Leu Ser
675 680 685
Thr Trp Val Pro Gln Leu Met Glu Lys Leu Gln Gln Leu Pro Gln Leu
690 695 700
Ser Asp Val Ser Ser Asp Trp Gln Asp Lys Gly Leu Val Ala Tyr Val
705 710 715 720
Asn Val Asp Arg Asp Ser Ala Ser Arg Leu Gly Ile Ser Met Ala Asp
725 730 735
Val Asp Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Phe Gly Gln Arg Leu Ile Ser Thr
740 745 750
Ile Tyr Thr Gln Ala Asn Gln Tyr Arg Val Val Leu Glu His Asn Thr
755 760 765
Glu Asn Thr Pro Gly Leu Ala Ala Leu Asp Thr Ile Arg Leu Thr Ser
770 775 780
Ser Asp Gly Gly Val Val Pro Leu Ser Ser Ile Ala Lys Ile Glu Gln
785 790 795 800
Arg Phe Ala Pro Leu Ser Ile Asn His Leu Asp Gln Phe Pro Val Thr
805 810 815
Thr Ile Ser Phe Asn Val Pro Asp Asn Tyr Ser Leu Gly Asp Ala Val
820 825 830
Gln Ala Ile Met Asp Thr Glu Lys Thr Leu Asn Leu Pro Val Asp Ile
835 840 845
Thr Thr Gln Phe Gln Gly Ser Thr Leu Ala Phe Gln Ser Ala Leu Gly
850 855 860
Ser Thr Val Trp Leu Ile Val Ala Ala Val Val Ala Met Tyr Ile Val
865 870 875 880
Leu Gly Ile Leu Tyr Glu Ser Phe Ile His Pro Ile Thr Ile Leu Ser
885 890 895
Thr Leu Pro Thr Ala Gly Val Gly Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ile Ala
900 905 910
Gly Ser Glu Leu Asp Val Ile Ala Ile Ile Gly Ile Ile Leu Leu Ile
915 920 925
Gly Ile Val Lys Lys Asn Ala Ile Met Met Ile Asp Phe Ala Leu Ala
930 935 940
Ala Glu Arg Glu Gln Gly Met Ser Pro Arg Glu Ala Ile Tyr Gln Ala
945 950 955 960
Cys Leu Leu Arg Phe Arg Pro Ile Leu Met Thr Thr Leu Ala Ala Leu
965 970 975
Leu Gly Ala Leu Pro Leu Met Leu Ser Thr Gly Val Gly Ala Glu Leu
980 985 990
Arg Arg Pro Leu Gly Ile Gly Met Val Gly Gly Leu Ile Val Ser Gln
995 1000 1005
Val Leu Thr Leu Phe Thr Thr Pro Val Ile Tyr Leu Leu Phe Asp Arg
1010 1015 1020
Leu Ala Leu Trp Thr Lys Ser Arg Phe Ala Arg His Glu Glu Glu Ala
1025 1030 1035 1040
<210> 12
<211> 1025
<212> PRT
<213> MdtC from E.coli BW5113
<400> 12
Val Lys Phe Phe Ala Leu Phe Ile Tyr Arg Pro Val Ala Thr Ile Leu
1 5 10 15
Leu Ser Val Ala Ile Thr Leu Cys Gly Ile Leu Gly Phe Arg Met Leu
20 25 30
Pro Val Ala Pro Leu Pro Gln Val Asp Phe Pro Val Ile Ile Val Ser
35 40 45
Ala Ser Leu Pro Gly Ala Ser Pro Glu Thr Met Ala Ser Ser Val Ala
50 55 60
Thr Pro Leu Glu Arg Ser Leu Gly Arg Ile Ala Gly Val Ser Glu Met
65 70 75 80
Thr Ser Ser Ser Ser Leu Gly Ser Thr Arg Ile Ile Leu Gln Phe Asp
85 90 95
Phe Asp Arg Asp Ile Asn Gly Ala Ala Arg Asp Val Gln Ala Ala Ile
100 105 110
Asn Ala Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ser Gly Met Pro Ser Arg Pro Thr
115 120 125
Tyr Arg Lys Ala Asn Pro Ser Asp Ala Pro Ile Met Ile Leu Thr Leu
130 135 140
Thr Ser Asp Thr Tyr Ser Gln Gly Glu Leu Tyr Asp Phe Ala Ser Thr
145 150 155 160
Gln Leu Ala Pro Thr Ile Ser Gln Ile Asp Gly Val Gly Asp Val Asp
165 170 175
Val Gly Gly Ser Ser Leu Pro Ala Val Arg Val Gly Leu Asn Pro Gln
180 185 190
Ala Leu Phe Asn Gln Gly Val Ser Leu Asp Asp Val Arg Thr Ala Val
195 200 205
Ser Asn Ala Asn Val Arg Lys Pro Gln Gly Ala Leu Glu Asp Gly Thr
210 215 220
His Arg Trp Gln Ile Gln Thr Asn Asp Glu Leu Lys Thr Ala Ala Glu
225 230 235 240
Tyr Gln Pro Leu Ile Ile His Tyr Asn Asn Gly Gly Ala Val Arg Leu
245 250 255
Gly Asp Val Ala Thr Val Thr Asp Ser Val Gln Asp Val Arg Asn Ala
260 265 270
Gly Met Thr Asn Ala Lys Pro Ala Ile Leu Leu Met Ile Arg Lys Leu
275 280 285
Pro Glu Ala Asn Ile Ile Gln Thr Val Asp Ser Ile Arg Ala Lys Leu
290 295 300
Pro Glu Leu Gln Glu Thr Ile Pro Ala Ala Ile Asp Leu Gln Ile Ala
305 310 315 320
Gln Asp Arg Ser Pro Thr Ile Arg Ala Ser Leu Glu Glu Val Glu Gln
325 330 335
Thr Leu Ile Ile Ser Val Ala Leu Val Ile Leu Val Val Phe Leu Phe
340 345 350
Leu Arg Ser Gly Arg Ala Thr Ile Ile Pro Ala Val Ser Val Pro Val
355 360 365
Ser Leu Ile Gly Thr Phe Ala Ala Met Tyr Leu Cys Gly Phe Ser Leu
370 375 380
Asn Asn Leu Ser Leu Met Ala Leu Thr Ile Ala Thr Gly Phe Val Val
385 390 395 400
Asp Asp Ala Ile Val Val Leu Glu Asn Ile Ala Arg His Leu Glu Ala
405 410 415
Gly Met Lys Pro Leu Gln Ala Ala Leu Gln Gly Thr Arg Glu Val Gly
420 425 430
Phe Thr Val Leu Ser Met Ser Leu Ser Leu Val Ala Val Phe Leu Pro
435 440 445
Leu Leu Leu Met Gly Gly Leu Pro Gly Arg Leu Leu Arg Glu Phe Ala
450 455 460
Val Thr Leu Ser Val Ala Ile Gly Ile Ser Leu Leu Val Ser Leu Thr
465 470 475 480
Leu Thr Pro Met Met Cys Gly Trp Met Leu Lys Ala Ser Lys Pro Arg
485 490 495
Glu Gln Lys Arg Leu Arg Gly Phe Gly Arg Met Leu Val Ala Leu Gln
500 505 510
Gln Gly Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Trp Val Leu Asn His Thr Arg Leu
515 520 525
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545 550 555 560
Met Gly Gly Ile Gln Ala Asp Gln Ser Ile Ser Phe Gln Ala Met Arg
565 570 575
Gly Lys Leu Gln Asp Phe Met Lys Ile Ile Arg Asp Asp Pro Ala Val
580 585 590
Asp Asn Val Thr Gly Phe Thr Gly Gly Ser Arg Val Asn Ser Gly Met
595 600 605
Met Phe Ile Thr Leu Lys Pro Arg Asp Glu Arg Ser Glu Thr Ala Gln
610 615 620
Gln Ile Ile Asp Arg Leu Arg Val Lys Leu Ala Lys Glu Pro Gly Ala
625 630 635 640
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Ser Asn Ala Ser Tyr Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Asp Asp Leu Ala Ala
660 665 670
Leu Arg Glu Trp Glu Pro Lys Ile Arg Lys Lys Leu Ala Thr Leu Pro
675 680 685
Glu Leu Ala Asp Val Asn Ser Asp Gln Gln Asp Asn Gly Ala Glu Met
690 695 700
Asn Leu Val Tyr Asp Arg Asp Thr Met Ala Arg Leu Gly Ile Asp Val
705 710 715 720
Gln Ala Ala Asn Ser Leu Leu Asn Asn Ala Phe Gly Gln Arg Gln Ile
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Asp Pro Arg Tyr Thr Gln Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Met Phe Val
755 760 765
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785 790 795 800
Ala Ser Thr Ile Ser Phe Asn Leu Pro Thr Gly Lys Ser Leu Ser Asp
805 810 815
Ala Ser Ala Ala Ile Asp Arg Ala Met Thr Gln Leu Gly Val Pro Ser
820 825 830
Thr Val Arg Gly Ser Phe Ala Gly Thr Ala Gln Val Phe Gln Glu Thr
835 840 845
Met Asn Ser Gln Val Ile Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ala Thr Val Tyr
850 855 860
Ile Val Leu Gly Ile Leu Tyr Glu Ser Tyr Val His Pro Leu Thr Ile
865 870 875 880
Leu Ser Thr Leu Pro Ser Ala Gly Val Gly Ala Leu Leu Ala Leu Glu
885 890 895
Leu Phe Asn Ala Pro Phe Ser Leu Ile Ala Leu Ile Gly Ile Met Leu
900 905 910
Leu Ile Gly Ile Val Lys Lys Asn Ala Ile Met Met Val Asp Phe Ala
915 920 925
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930 935 940
Gln Ala Cys Leu Leu Arg Phe Arg Pro Ile Met Met Thr Thr Leu Ala
945 950 955 960
Ala Leu Phe Gly Ala Leu Pro Leu Val Leu Ser Gly Gly Asp Gly Ser
965 970 975
Glu Leu Arg Gln Pro Leu Gly Ile Thr Ile Val Gly Gly Leu Val Met
980 985 990
Ser Gln Leu Leu Thr Leu Tyr Thr Thr Pro Val Val Tyr Leu Phe Phe
995 1000 1005
Asp Arg Leu Arg Leu Arg Phe Ser Arg Lys Pro Lys Gln Thr Val Thr
1010 1015 1020
Glu
102
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> MdtJ from E.coli BW5113
<400> 13
Met Tyr Ile Tyr Trp Ile Leu Leu Gly Leu Ala Ile Ala Thr Glu Ile
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20 25 30
Gly Phe Ile Leu Met Leu Val Met Ile Ser Leu Ser Tyr Ile Phe Leu
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Ser Phe Ala Val Lys Lys Ile Ala Leu Gly Val Ala Tyr Ala Leu Trp
50 55 60
Glu Gly Ile Gly Ile Leu Phe Ile Thr Leu Phe Ser Val Leu Leu Phe
65 70 75 80
Asp Glu Ser Leu Ser Leu Met Lys Ile Ala Gly Leu Thr Thr Leu Val
85 90 95
Ala Gly Ile Val Leu Ile Lys Ser Gly Thr Arg Lys Ala Arg Lys Pro
100 105 110
Glu Leu Glu Val Asn His Gly Ala Val
115 120
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> MdtI from E.coli BW5113
<400> 14
Met Ala Gln Phe Glu Trp Val His Ala Ala Trp Leu Ala Leu Ala Ile
1 5 10 15
Val Leu Glu Ile Val Ala Asn Val Phe Leu Lys Phe Ser Asp Gly Phe
20 25 30
Arg Arg Lys Ile Phe Gly Leu Leu Ser Leu Ala Ala Val Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Ser Ala Leu Ser Gln Ala Val Lys Gly Ile Asp Leu Ser Val Ala
50 55 60
Tyr Ala Leu Trp Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Thr Leu Ala Ala Gly
65 70 75 80
Trp Ile Leu Phe Gly Gln Arg Leu Asn Arg Lys Gly Trp Ile Gly Leu
85 90 95
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100 105
<210> 15
<211> 404
<212> PRT
<213> YdiM from E.coli BW5113
<400> 15
Met Lys Asn Pro Tyr Phe Pro Thr Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Asn Tyr
1 5 10 15
Leu Val His Gly Met Gly Val Leu Leu Met Ser Leu Asn Met Ala Ser
20 25 30
Leu Glu Thr Leu Trp Gln Thr Asn Ala Ala Gly Val Ser Ile Val Ile
35 40 45
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50 55 60
Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Pro Phe Ile Met Leu Gly Met Cys
65 70 75 80
Cys Tyr Met Ala Phe Phe Phe Gly Ile Leu Gln Thr Asn Asn Ile Ile
85 90 95
Ile Ala Tyr Val Phe Gly Phe Leu Ala Gly Met Ala Asn Ser Phe Leu
100 105 110
Asp Ala Gly Thr Tyr Pro Ser Leu Met Glu Ala Phe Pro Arg Ser Pro
115 120 125
Gly Thr Ala Asn Ile Leu Ile Lys Ala Phe Val Ser Ser Gly Gln Phe
130 135 140
Leu Leu Pro Leu Ile Ile Ser Leu Leu Val Trp Ala Glu Leu Trp Phe
145 150 155 160
Gly Trp Ser Phe Met Ile Ala Ala Gly Ile Met Phe Ile Asn Ala Leu
165 170 175
Phe Leu Tyr Arg Cys Thr Phe Pro Pro His Pro Gly Arg Arg Leu Pro
180 185 190
Val Ile Lys Lys Thr Thr Ser Ser Thr Glu His Arg Cys Ser Ile Ile
195 200 205
Asp Leu Ala Ser Tyr Thr Leu Tyr Gly Tyr Ile Ser Met Ala Thr Phe
210 215 220
Tyr Leu Val Ser Gln Trp Leu Ala Gln Tyr Gly Gln Phe Val Ala Gly
225 230 235 240
Met Ser Tyr Thr Met Ser Ile Lys Leu Leu Ser Ile Tyr Thr Val Gly
245 250 255
Ser Leu Leu Cys Val Phe Ile Thr Ala Pro Leu Ile Arg Asn Thr Val
260 265 270
Arg Pro Thr Thr Leu Leu Met Leu Tyr Thr Phe Ile Ser Phe Ile Ala
275 280 285
Leu Phe Thr Val Cys Leu His Pro Thr Phe Tyr Val Val Ile Ile Phe
290 295 300
Ala Phe Val Ile Gly Phe Thr Ser Ala Gly Gly Val Val Gln Ile Gly
305 310 315 320
Leu Thr Leu Met Ala Glu Arg Phe Pro Tyr Ala Lys Gly Lys Ala Thr
325 330 335
Gly Ile Tyr Tyr Ser Ala Gly Ser Ile Ala Thr Phe Thr Ile Pro Leu
340 345 350
Ile Thr Ala His Leu Ser Gln Arg Ser Ile Ala Asp Ile Met Trp Phe
355 360 365
Asp Thr Ala Ile Ala Ala Ile Gly Phe Leu Leu Ala Leu Phe Ile Gly
370 375 380
Leu Arg Ser Arg Lys Lys Thr Arg His His Ser Leu Lys Glu Asn Val
385 390 395 400
Ala Pro Gly Gly
<210> 16
<211> 3114
<212> DNA
<213> AcrD from E.coli BW5113
<400> 16
atggcgaatt tctttattga tcgccccatt tttgcctggg tgctggcaat cctgttgtgt 60
ctgacaggta ccctggcgat tttttcattg cccgttgaac aataccccga tctcgcgcca 120
ccgaatgtgc gagtgaccgc taactatccc ggcgcatcgg cccagacgct ggaaaacacc 180
gtgacccagg ttatcgagca aaatatgacc ggcctcgata atctcatgta tatgtcatct 240
cagagcagtg gcaccggtca ggcatctgtc actttaagtt ttaaagcagg caccgatccg 300
gacgaagccg tgcagcaagt acaaaaccag ctgcaatcag ccatgcgaaa gttaccgcag 360
gcggtgcaaa atcagggcgt gacggtgcgt aaaaccggcg ataccaacat tctgaccatt 420
gccttcgtct ctaccgatgg ttcgatggat aaacaggata ttgctgatta tgttgccagt 480
aatattcagg acccgttaag ccgcgtgaat ggcgtcgggg atatcgatgc ctatggttcg 540
caatattcca tgcgtatctg gctggacccg gcgaaactca acagtttcca gatgacggct 600
aaagatgtca ctgatgccat tgagtcacag aacgcgcaga ttgcggttgg gcaacttggt 660
ggtacacctt ccgtcgataa gcaggcgctc aacgccacca ttaacgccca gtcactgctg 720
caaacaccag aacagttccg cgatatcacc ttgcgggtca atcaggacgg ctcagaggta 780
aggctgggcg atgtcgccac cgtcgaaatg ggggcggaga aatacgatta tcttagccgc 840
ttcaatggta agccagcctc cgggctgggg gtaaaactgg cctccggcgc taacgaaatg 900
gcgacagcgg agctggtgct caatcgtctc gacgagctgg cgcagtattt cccgcatgga 960
ctggaataca aggtggcgta tgaaaccacc tcgtttgtta aagcctccat tgaagacgtg 1020
gtgaaaacgc tgctggaagc tatcgctctg gttttcctcg ttatgtatct gttcctgcaa 1080
aacttccgcg ccacgctgat acccactatc gccgtgccgg tggtgttgat gggaaccttc 1140
tccgtacttt acgccttcgg ttacagcgtc aacaccttaa ccatgttcgc gatggtgctg 1200
gcgatcggtc tgctggtgga tgacgccatc gtggtggtgg aaaacgtcga acgtattatg 1260
agtgaggaag gactcactcc tcgcgaagcc acacgtaaat cgatggggca gatccagggg 1320
gcactggtcg ggattgcgat ggttctttcg gcggtatttg taccaatggc cttcttcggc 1380
ggcaccaccg gtgccatcta tcgccagttc tctattacca ttgttgcggc gatggtgctg 1440
tcagtactgg tagcgatgat cctcactccg gctctgtgtg ccacactact taagccactg 1500
aaaaaaggtg agcatcatgg gcaaaaaggc ttttttgcct ggtttaacca gatgtttaac 1560
cgcaacgccg aacgctacga aaaaggggtg gcgaaaattc tccaccgtag cctgcgctgg 1620
attgtgattt atgtcctgct gcttggcggc atggtgttcc tgttcctgcg tttgccgacg 1680
tcgttcttac cgctggaaga ccgtggcatg tttactacct cggtacagtt gcccagcggt 1740
tcaacgcaac aacagaccct gaaagtcgtt gagcaaatcg agaaatacta cttcacccat 1800
gaaaaagaca acatcatgtc ggtgtttgcc accgttggtt ctggccctgg gggtaacggg 1860
caaaacgtgg cgcgaatgtt tatccgcctg aaagactgga gcgaacgcga cagtaagacc 1920
ggcacctcgt ttgccattat cgagcgtgca acgaaggcgt ttaaccaaat taaagaagct 1980
cgcgttatcg ccagcagccc gccagcaatt agcggtcttg gtagttctgc aggttttgat 2040
atggagttgc aggaccacgc tggagcgggt cacgatgcgc tgatggcagc acgtaatcag 2100
ttgctggcgc tggcggcgga aaacccggag ctaacccgtg tgcgccataa cggcctcgac 2160
gacagtccgc agttgcagat tgatatcgac cagcgtaaag ctcaggcgct gggcgttgct 2220
atcgacgata ttaacgacac actgcaaacc gcctggggtt cgagctatgt gaatgacttt 2280
atggatcgcg gtcgcgtgaa gaaagtctat gtgcaggcag ctgcgccgta tcgcatgctg 2340
ccagatgaca tcaatctctg gtatgtccga aataaagatg gcggcatggt gcccttctct 2400
gctttcgcga cctcacgctg ggaaacaggc tcgccgcgtc tggaacgcta taacggttat 2460
tctgcggttg agattgttgg ggaagccgca ccgggggtca gtaccggtac ggcgatggat 2520
attatggaat cgttagtgaa gcagctgcca aacggctttg gtctggagtg gacggcgatg 2580
tcgtatcagg agcggctttc cggcgcgcag gctccggcgc tgtacgccat ttccttgctg 2640
gtggtattcc tgtgtctggc tgcgttgtat gaaagctggt cggtgccgtt ctcggtaatg 2700
ctggtcgtgc cgctgggggt aatcggcgcg ctgctggcaa cctggatgcg cgggctggaa 2760
aacgacgttt acttccaggt gggcctgtta acggtcattg gtttatcggc gaaaaacgcc 2820
atcctgatcg tcgagtttgc taacgagatg aaccaaaaag gccacgacct gtttgaagcg 2880
acgctccacg cctgccgtca gcgtttacgc ccgattctga tgacctcgct ggcatttatc 2940
ttcggcgtat tgccaatggc aaccagcacg ggtgccggtt ccggtggtca gcatgcggtg 3000
ggtactggcg taatgggcgg gatgatttcg gccactattc tggctattta cttcgtgccg 3060
ctgttctttg tgctggtgcg ccgccgcttc ccgctgaagc cgcgcccgga ataa 3114
<210> 17
<211> 2728
<212> DNA
<213> EmrAB from E.coli BW5113
<400> 17
atgagcgcaa atgcggagac tcaaaccccg cagcaaccgg taaagaagag cggcaaacgt 60
aagcgtctgc tcctccttct caccttgctc tttataatta ttgccgtagc gatagggatt 120
tattggtttt tggtactgcg tcacttcgaa gaaaccgatg acgcatacgt ggcagggaat 180
caaattcaaa ttatgtctca ggtgtctggc agcgtgacga aagtctgggc cgataacacc 240
gattttgtaa aagaaggcga cgtgctggtc actctcgacc cgacagatgc tcgccaggcg 300
tttgaaaaag ccaaaactgc actggcttcc agcgttcgcc aaacccacca gctgatgatt 360
aacagcaagc agttgcaggc gaatattgag gtgcagaaaa tcgccctcgc gaaagcacaa 420
agcgactaca accgccgtgt gccgctgggc aatgccaacc tgattggtcg cgaagagctg 480
caacacgccc gcgacgccgt caccagtgcc caggcgcaac tggacgtcgc gattcaacaa 540
tacaatgcca atcaggcgat gattctgggg actaaactgg aagatcagcc agccgtgcaa 600
caggctgcca ccgaagtacg taacgcctgg ctggcgctgg agcgtactcg tattatcagt 660
ccgatgaccg gttatgtctc ccgccgcgcg gtacagcctg gggcgcaaat tagcccaacg 720
acgccgctga tggcggtcgt tccagccacc aatatgtggg tggatgccaa ctttaaagag 780
acgcagattg ccaatatgcg tatcggtcag ccggtcacta tcaccacgga tatttacggc 840
gatgatgtga aatacaccgg taaagtggtt ggtctggata tgggcacagg tagcgcgttc 900
tcactgcttc cagcgcaaaa tgcgaccggt aactggatca aagtcgttca gcgtctgcct 960
gtgcgtatcg aactggacca gaaacagctg gagcaatatc cgctgcgtat cggtttgtcc 1020
acgctggtga gcgtcaatac cactaaccgt gacggtcagg tactggcaaa taaagtacgt 1080
tccactccgg tagcggtaag caccgcgcgt gaaatcagcc tggcacctgt caataaactg 1140
atcgacgata tcgtaaaagc taacgctggc taatccagag gtgcgtgtga tgcaacagca 1200
aaaaccgctg gaaggcgcgc aactggtcat tatgacgatt gcgctgtcac tggcgacatt 1260
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QemrA-R
<400> 29
atacgcagcg gatattgctc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> QmacB-F
<400> 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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taacggcgaa agagagaa 18
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<223> QcysG-F
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gatgtcgact tattccgggc gcggcttcag cgg 33
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aggatccagg agaacaatat gagcgcaaat gcg 33
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<213> Artificial Sequence
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<223> emrAB-Sal-R
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gatgtcgact tagtgcgcac cgcctccgcc g 31
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mdtBC-Bgl-F
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tcgagatcta aggagcacgc tcctgatgca ggtgttac 38
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<220>
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ctactcgagt tactcggtta ccgtttgttt aggtttacgc 40
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<213> Artificial Sequence
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gatgtcgact tatcaggcaa gtttcaccat gatc 34
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<223> ydiM-BamH-F
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gacggatcca agaggtagaa cctatgaaaa atccctattt c 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ydiM-Sal-R
<400> 53
gatgtcgact gcattaccca cccggagcga c 31
Claims (14)
- AcrA 및 AcrB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 감쇄 또는 결실시켜, TolC를 통한 탄소수 5 또는 6의 알코올 배출을 촉진시키는, 미생물의 알코올 저항성 증가 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 AcrAB-TolC 배출 펌프를 내재한 그람 음성 박테리아인, 미생물의 알코올 저항성 증가 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 AcrA는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, AcrB는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 미생물의 알코올 저항성 증가 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 TolC는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 미생물의 알코올 저항성 증가 방법.
- 청구항 1에 있어서, AcrD, EmrAB, MacAB, MdtBC, MdtJI 및 YdiM로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 TolC에 결합시켜, TolC를 통한 알코올 배출을 촉진시키는, 미생물의 알코올 저항성 증가 방법.
- 삭제
- 삭제
- AcrA 및 AcrB로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 감쇄 또는 결실된 탄소수 5 또는 6의 알코올 저항성 미생물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 미생물은 AcrAB-TolC 배출 펌프를 내재한 그람 음성 박테리아인, 알코올 저항성 미생물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 AcrA는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, AcrB는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 알코올 저항성 미생물.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 8 내지 10 중 어느 한 항의 미생물을 단당체 함유 영양원(nutrient source)에서 배양하여 상기 단당체를 발효시키는 단계를 포함하는 알코올의 생산 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 알코올은 탄소수 5 또는 6의 알코올인, 알코올의 생산 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020150115374A KR101703439B1 (ko) | 2015-08-17 | 2015-08-17 | 미생물의 알코올 저항성 증가 방법 및 알코올 저항성 미생물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150115374A KR101703439B1 (ko) | 2015-08-17 | 2015-08-17 | 미생물의 알코올 저항성 증가 방법 및 알코올 저항성 미생물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101703439B1 true KR101703439B1 (ko) | 2017-02-06 |
Family
ID=58108773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150115374A KR101703439B1 (ko) | 2015-08-17 | 2015-08-17 | 미생물의 알코올 저항성 증가 방법 및 알코올 저항성 미생물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101703439B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090162911A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-25 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Strain for butanol production |
| KR20110106145A (ko) | 2010-03-22 | 2011-09-28 | 삼성전자주식회사 | 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 알코올 생산성 형질전환 균주 및 이를 이용한 알코올의 제조방법 |
-
2015
- 2015-08-17 KR KR1020150115374A patent/KR101703439B1/ko active Search and Examination
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090162911A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-25 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Strain for butanol production |
| KR20110106145A (ko) | 2010-03-22 | 2011-09-28 | 삼성전자주식회사 | 알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 알코올 생산성 형질전환 균주 및 이를 이용한 알코올의 제조방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PNAS. Vol. 106, No. 38, 페이지 16416-16421 (2009.09.02.) * |
| PNAS. Vol. 106, No. 38, 페이지 16416-16421 (2009.09.02.)* |
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