KR101641655B1 - 스퍼미딘 또는 스퍼민을 이용함으로써 생육 저해제에 대한 내성이 증진된 효모의 배양방법 - Google Patents

스퍼미딘 또는 스퍼민을 이용함으로써 생육 저해제에 대한 내성이 증진된 효모의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스퍼미딘 또는 스퍼민을 이용함으로써, 생육 저해제에 대한 내성이 증진된 효모의 배양방법에 관한 것으로, 대부분의 생육 저해제에 대해 저항성이 증가하였고, 포도당과 자일로스의 혼합당에서 배양을 하여도 저항성 증대의 효과가 지속적으로 유지되었다.

Description

스퍼미딘 또는 스퍼민을 이용함으로써 생육 저해제에 대한 내성이 증진된 효모의 배양방법{Method for cultivation of yeast with the tolerance against growth inhibitor by using spermidine or spermine}
본 발명은 생육 저해제에 대한 내성이 증진된 효모의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스퍼미딘 (spermidine) 또는 스퍼민 (spermine)을 이용함으로써, 생육 저해제에 대한 내성이 증진되어, 그렇지 않은 경우에 비해 생육능이 한층 증진된 효모의 배양방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 화석 연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환경오염에 대한 우려가 증가하고 있다. 따라서, 안정적이고 지속적으로 에너지를 생산할 수 있는 신재생 대체에너지에 대한 관심이 많이 증가하고 있는데, 비 식량 바이오매스 자원으로부터 알코올을 생산하는 기술도 많은 주목을 받고 있다.
바이오매스 자원을 이용하여 에탄올을 제조하는 과정은 일반적으로 바이오매스를 당화공정에 적용이 용이하도록 전처리하는 과정, 전처리된 바이오매스를 당화하여 단당체로 전환하는 당화과정, 단당체를 발효하여 알코올을 제조하는 발효과정으로 이루어진다.
상기 과정 중 전처리 과정에서는 경제적인 측면을 고려하여 강산에 의한 산가수분해 방법을 많이 사용한다. 이 방법은 바이오매스로부터 포도당과 자일로스 등을 비교적 높은 수율로 얻을 수 있지만, 동시에 퍼퓨랄 (furfural), HMF (hydroxymethylfurfural), 초산 (acetic aicd) 등과 같은 발효 저해제(생육 저해제)가 많이 생성되는 문제점을 지닌다. 따라서, 효과적인 에탄올 발효를 위해서는 생육 저해제에 대한 내성이 증가된 효모 균주를 개발할 필요가 있다.
종래의 생육 저해제에 대한 효모의 저항성을 증가시키는 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째 방법은 퍼퓨랄 (furfural)과 HMF을 효모 내에서 독성이 약한 물질로 변환시키는데 관여하는 산화환원효소들을 과발현하는 방법이다. 두 번째 방법은 퍼퓨랄 (furfural)과 HMF로 인해 유발되는 세포 내 손상을 완화시키는데 관여하는 스트레스 저항성 유전자들을 과발현하는 방법이다.
그런데, 이러한 방법들은 기존에 알려진 유전자들에 한정되어 있어, 신규한 유전자들의 네트워크에 의한 내성증가에 대해서는 효율적이지 못한 단점이 있다. 또한, 생육 저해제에는 퍼퓨랄 (furfural), HMF 이외에도 초산, 포름산, 에탄올 등이 존재하지만, 종래 연구들은 일부의 발효저해제에 대한 저항성에 관한 것으로, 실재로 산업적으로 적용하는데 한계가 있는 단점이 있다. 또한, 전처리된 당화액에는 포도당 이외에도 다량의 자일로스 당이 포함되어 있기 때문에, 포도당과 자일로스 혼합당에서의 내성증대 효과가 확인되어야지만 산업적인 의미를 가질 수 있는데, 종래기술들은 단일 포도당 조건에서만 실험을 수행하였다는 한계점을 지닌다.
대한민국 특허공개번호 제10-2011-0106145호 (공개일자 2011. 09. 28)에는, "알코올 발효저해물에 대한 저항성을 증대시키는 단리된 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터, 알코올 생산성 형질전환 균주 및 이를 이용한 알코올의 제조방법"이 기재되어 있다.
본 발명에서는 생육 저해제로 알려진 대부분의 구성성분에 대해 포괄적으로 저항성을 부여할 수 있는 새로운 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
또한, 포도당 외에 다른 당이 추가적으로 첨가되어 있는 혼합당 상태에서도 생육 저해제에 대해 저항성을 유지할 수 있는 새로운 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 제1형태로 배지에 스퍼미딘 (spermidine) 또는 스퍼민 (spermine)을 첨가하고, 효모를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 효모의 배양방법을 제공한다. 생육 저해물질이 첨가된 배지에 효모를 배양하면, 효모의 생육이 저해되어 효모가 생육되지 못하나, 본 발명처럼 스퍼미딘 또는 스퍼민을 배지에 첨가하고 배양하는 경우, 생육 저해물질이 존재하는 상태에서도 효모가 생장할 수 있음이 본 발명을 통해 확인되었다. 본 발명의 제1형태는 생육 저해물질에 의한 효모의 생육 억제를 해소하고자, 배지에 스퍼미딘 또는 스퍼민을 첨가하는 것을 특징으로 하는데, 이와 같은 특징적 사항 외에 효모의 배양을 위한 기타의 방법은 널리 알려진 공지의 기술을 활용할 수 있다. 따라서, 효모의 배양에 관한 구체적인 기술의 기재는 생략하기로 한다.
상기 본 발명의 제1형태에 따른 효모 배양방법에 있어서, 상기 배지는, 일 예로서, 생육 저해물질을 포함하고 있는 것일 수 있는데, 생육 저해물질의 예로는,퍼퓨랄 (furfural), HMF, 아세트산, 포름산, 에탄올 등이 있을 수 있다.
상기 본 발명의 제1형태에 따른 효모 배양방법에 있어서, 상기 효모는 일 예로 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 이외에, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속의 다른 균주, 피키아 (Pichia) 속의 균주, 캔디다 (Candida) 속의 균주 등이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 제1형태에 따른 효모 배양방법에 있어서, 상기 배지는 일 예로, 당을 복수 개 포함할 수 있고, 상기 당은, 일 예로, 포도당 및 자일로스일 수 있다. 본 발명의 실험에 의할 경우, 포도당과 자일로스가 혼합되어 있는 혼합당에서도 생육 억제물질에 대한 저항성이 지속적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명은 제2형태로, 스퍼미딘 생합성에 관련된 SPE1, SPE2 및 SPE3 효소 중 어느 하나 이상이 과발현되도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 재조합 효모를 제공한다. SPE1은 오르니틴 데카르복실라아제 (Ornithine decarboxylase)을 암호화하는 유전자이고, SPE2는 S-아데노실메티오닌 데카르복실라아제 (S-adenosylmethione decarboxylase)를 암호화하는 유전자이며, SPE3는 스퍼미딘 신타아제 (Spermidine synthase)를 암호화하는 유전자이다. 상기 유전자들 중 어느 하나 이상을 과발현함으로써 세포 내 폴리아민 (예로서, 스퍼미딘, 스퍼민)의 함량을 높일 수 있기 때문이다.
상기 본 발명의 제2형태에 따른 재조합 효모에 있어서, 상기 재조합 효모는, 바람직하게 오르니틴 데카르복실라아제 안티자임 (Ornithine decarboxylase antizyme) 효소의 기능이 실활되어 있는 것이 좋다. 오르니틴 데카르복실라아제 안티자임의 효소 기능을 실활시키면, 이미 생산된 스퍼미딘에 의한 음성되먹임작용 (feedback inhibition)을 해제시켜 스퍼미딘의 지속적인 생합성을 유지할 수 있기 때문이다. 이때, 상기 오르니틴 데카르복실라아제 안티자임 (Ornithine decarboxylase antizyme)의 기능 실활은 바람직하게 OAZ1 유전자가 일부 파쇄되거나 또는 전부 제거됨으로써 달성되는 것이 좋다. OAZ1 유전자는 오르니틴 데카르복실라아제 안티자임 (Ornithine decarboxylase antizyme)을 암호화하는 유전자이다.
상기 본 발명의 제2형태에 따른 재조합 효모에 있어서, 상기 재조합 효모는, 바람직하게 폴리아민 트랜스포터 (Polyamine transporter) 효소의 기능이 실활되어 있는 것이 좋다. 폴리아민 트랜스포터 (Polyamine transporter)의 기능을 실활시키면, 폴리아민 (예로서, 스퍼미딘, 스퍼민)이 세포 외로 빠져나가는 것을 막을 수 있어 세포 내 폴리아민 (예로서, 스퍼미딘, 스퍼민)의 농도를 높일 수 있기 때문이다. 이때, 상기 폴리아민 트랜스포터의 기능 소실은 바람직하게 TPO1 유전자의 일부가 파쇄되거나 또는 전부 제거됨으로써 달성되는 것이 좋다. TPO1는 폴리아민 트랜스포터를 암호화하는 유전자이다.
상기 본 발명의 제2형태에 따른 재조합 효모에 있어서, 상기 효모는, 일 예로, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 그 외에, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속의 다른 균주, 피키아 (Pichia) 속의 균주, 캔디다 (Candida) 속의 균주 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 제3형태로, 배지에 본 발명의 제2형태에 따른 재조합 효모를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 효모의 배양방법을 제공한다. 생육억제 물질이 첨가된 배지에 효모를 배양하면, 효모의 생육이 저해되어 효모가 생육하지 못하나, 본 발명의 제2형태에 따른 재조합 효모를 배양하는 경우, 자체적으로 폴리아민(예로서, 스퍼미딘, 스퍼민)을 생산하여 생장할 수 있다.
상기 본 발명의 제1형태에 따른 효모 배양방법에 있어서, 상기 배지는, 일 예로서, 생육 저해물질을 포함하고 있는 것일 수 있는데, 생육 저해물질의 예로는,퍼퓨랄 (furfural), HMF, 아세트산, 포름산, 에탄올 등이 있을 수 있다.
상기 본 발명의 제3형태에 따른 효모의 배양방법에 있어서, 상기 효모는 일 예로, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 그 외에, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속의 다른 균주, 피키아 (Pichia) 속의 균주, 캔디다 (Candida) 속의 균주 등이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 제3형태에 따른 효모의 배양방법에 있어서, 상기 배지는 일 예로, 당을 복수 개 포함할 수 있고, 상기 당은, 일 예로, 포도당 및 자일로스일 수 있다. 본 발명의 실험에 의할 경우, 포도당과 자일로스가 혼합되어 있는 혼합당에서도 생육 억제물질에 대한 저항성이 지속적으로 유지됨을 확인할 수 있었다.
종래의 연구에서는 기존에 알려진 유전자들을 이용하여 일부 생육 저해제에 대한 저항성을 향상시켰다. 그러나 본 발명에서는 내성을 증가시키는 신규한 물질 (스퍼미딘, 스퍼민)과 유전자들(SPE1, SPE2 , SPE3 , OAZ1 , TPO1)의 조합을 발굴하였으며, 생육 저해제 대부분의 구성성분에 대한 저항성을 증가시켰다. 또한, 최종적으로 자일로스 대사를 도입한 후에도 효과가 유지되어 포도당과 자일로스 혼합당의 발효에서도 저항성을 증대시켰다.
도 1은 퍼퓨랄, HMF 저항성에 대한 스퍼미딘, 스퍼민, 푸트레신의 효과를 보여준다.
도 2는 아세트산 저항성에 대한 스퍼미딘의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 포름산 저항성에 대한 스퍼미딘의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 에탄올 저항성에 대한 스퍼미딘의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 효모 내 스퍼미딘 생합성 및 배출 경로를 보여주는 모식도이다.
도 6은 OAZ1 유전자 파쇄와 SPE1 , SPE2 , SPE3 유전자의 과발현을 조합하였을 경우, 효모 세포 내 폴리아민 농도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 TPO1 유전자를 파쇄하였을 경우, 효모 세포 내 폴리아민 농도를 보여주는 그래프이다.
도 8은 퍼퓨랄과 HMF의 저항성에 대한 OAZ1 유전자 파쇄와 SPE1 , SPE2 , SPE3 유전자 과발현의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 퍼퓨랄과 HMF의 저항성에 대한 TPO1 유전자 파쇄의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 스퍼미딘 농도가 향상된 재조합 효모의 아세트산에 대한 내성 효과를 보여주는 그래프이다.
본 발명에서는 발효저해제 성분인 퍼퓨랄 (furfural), HMF, 초산, 포름산, 에탄올 등의 성분에 대해서 포괄적으로 효모의 저항성을 증가시키는 물질인 폴리아민 (스퍼미딘, 스퍼민)을 발굴하였다.
또한, 값비싼 폴리아민을 발효배지에 직접 첨가하는 것은 경제성이 떨어지므로, 본 발명에서는 세포 내 폴리아민 농도를 대사공학적 기법을 이용하여 증대시키고자 하였다. 구체적으로는 스퍼미딘의 생합성에 직접적으로 관여된 유전자인 SPE1, SPE2 , SPE3를 과발현하였으며, 음성되먹임작용 (feedback inhibition)에 관여된 유전자인 OAZ1을 파쇄하였다. 또한, 세포 내 폴리아민의 배출에 관여된 유전자인 TPO1을 추가적으로 파쇄하여 보았다.
이러한 유전적 변화의 다양한 조합 중 특히나 OAZ1이 파쇄되고, SPE3이 과발현된 균주 (oaz1SPE3), TPO1이 파쇄된 균주 (tpo1), TPO1과 OAZ1이 파쇄되고 SPE3이 과발현된 균주 (tpo1oaz1SPE3)가 퍼퓨랄 (furfural), HMF이 첨가된 발효조건에서 정지기 (lag phase)가 2배가량 감소하여 우수한 생육능을 보이는 것을 확인하였다. 또한, tpo1oaz1SPE3 균주는 4 g/L의 아세트산이 첨가된 발효조건에서도 비생장속도 (specific growth rate)가 2배가량 향상되는 효과를 나타냈다.
이러한 저항성 증대의 효과는 자일로스 대사를 도입시킨 후의 포도당과 자일로스의 혼합당 발효조건에서도 유지되어 1.4배의 생산성 향상 효과를 나타내었다. 이는 본 발명의 시스템이 실험실 수준이 아닌 혼합당 형태로 존재하는 실제 모델에서도 적용 가능함을 명확히 시사하는 것이다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1. 폴리아민의 배지 내 첨가에 따른 퍼퓨랄 ( furfural ), HMF 에 대해 저항성 효과]
생육 저해물질인 2 g/L의 퍼퓨랄과 HMF (5-Hydroxy Methylfurfural)가 첨가되어 있는 배지에 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) D452-2 효모 균주를 접종한 후, 발효 (배양)를 수행함으로써 실험을 진행하였다. 본 실시예를 포함한 이하 모든 실시예 또는 실험예에서 수행한 발효는 YNB 배지, 30℃, 80 rpm 조건에서 수행하였다.
실험군에는 폴리아민의 일종인 스퍼미딘 (spermidine), 스퍼민 (spermine), 푸트레신 (putrescine)을 각각 2 mM 첨가하여 발효를 수행하였고 대조군에는 이들 성분을 첨가하지 않았다.
실험 결과, 이들을 첨가하지 않은 대조군과 푸트레신 첨가 실험군에서는 균주가 생장하지 않았으나, 스퍼미딘, 스퍼민 첨가 실험군에서는 균주가 생장하는 것을 관찰할 수 있었다. 발효 프로파일을 확인해보면, 스퍼미딘, 스퍼민 첨가 실험군은 퍼퓨랄과 HMF가 빠른 속도로 모두 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 대조군과 푸트레신 첨가 실험군의 경우에는 퍼퓨랄과 HMF를 분해하지 못하고, 결과적으로 균주의 생장이 멈추는 것을 확인할 수 있었다.
도 1은 퍼퓨랄, HMF 저항성에 대한 스퍼미딘, 스퍼민, 푸트레신의 효과를 보여준다.
[ 실시예 2. 스퍼미딘의 배지 내 첨가에 따른 아세트산에 대한 저항성 효과]
생육 저해물질로, 1 g/L, 2 g/L, 4 g/L의 초산 (acetic acid)이 첨가되어 있는 배지에 D452-2 효모 균주를 접종하여 발효시킴으로써 실험을 진행하였다.
실험 결과, 2 mM의 스퍼미딘을 배지에 첨가한 경우, 4 g/L의 초산첨가 조건에서 정지기가 2배가량 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 2 g/L, 4 g/L 초산 첨가 조건에서 각각의 비생장속도가 각각 1.3배, 1.4배 증가하는 효과를 나타냈다.
도 2는 아세트산 저항성에 대한 스퍼미딘의 효과를 보여주는 그래프이다.
[ 실시예 3. 스퍼미딘의 배지 내 첨가에 따른 포름산에 대한 저항성 효과]
생육 저해물질로 0.2 g/L, 0.5 g/L, 0.8 g/L의 포름산이 각각 첨가되어 있는 배지에 D452-2 효모 균주를 접종하여 발효시킴으로써 실험을 진행하였다.
실험 결과, 2 mM의 스퍼미딘을 첨가한 경우, 대조군 (스퍼미딘 무첨가)의 균주가 전혀 생장하지 못하는 0.8 g/L의 초산 첨가 조건에서도, 실험군 (스퍼미딘 첨가)의 효모 균주가 생장하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 0.2 g/L, 0.5 g/L 포름산 첨가 조건에서 각각의 비생장속도가 각각 1.3배, 1.4배 증가하는 효과를 나타냈다.
도 3은 포름산 저항성에 대한 스퍼미딘의 효과를 보여주는 그래프이다.
[ 실시예 4. 스퍼미딘의 배지 내 첨가에 따른 에탄올에 대한 저항성 효과]
생육 저해물질로 3%, 5%, 8%의 에탄올이 각각 첨가되어 있는 배지에 D452-2 효모 균주를 접종하고 발효시킴으로써 실험을 진행하였다.
실험 결과, 2 mM의 스퍼미딘을 첨가한 경우, 3%, 5%, 8%의 에탄올 첨가 조건에서, 최대 균체량이 각각 1.2배, 1.2배, 2.2배 증가하는 효과를 나타냈다. 또한, 8%의 에탄올 첨가 조건에서 비생장속도 역시 2배가량 증가하였다.
도 4는 에탄올 저항성에 대한 스퍼미딘의 효과를 보여주는 그래프이다.
[ 실시예 5. 스퍼미딘의 농도가 향상된 재조합 균주의 구축]
도 5는 효모 내 스퍼미딘 생합성 및 배출 경로를 보여주는 모식도인데, 스퍼미딘의 농도가 향상된 재조합 효모를 구축하고자 하기의 실험을 진행하였다.
스퍼미딘 생합성에 관련된 유전자인 SPE1 , SPE2 , SPE3 유전자를 각각 류신 (Leucine), 히스티딘 (Histidine), 우라실 (Uracil)을 마커로 하는 pRS40X 인테그레이션 (integration) 벡터에 클로닝하였다 (Sikorski et al., Genetics, 122:19-27, 1989). 이러한 유전자들의 프로모터와 터미네이터는 각각 GPD1 프로모터 (promoter)와 CYC1 터미네이터 (terminator)로 하였다.
또한, OAZ1과 TPO1 유전자의 파쇄를 위해 각각의 유전자 일부를 pAUR101 벡터에 클로닝하였다 (Lee et al., Journal of Biotechnology, 158(4):184-191, 2002). 이렇게 제작된 벡터들을 제한효소로 선형화한 후 D452-2균주에 형질전환하여 각각 유전자형이 조합된 균주들을 제작하였다 (Lee et al., Journal of Biotechnology, 158(4):184-191, 2002).
[ 실시예 6. 재조합 균주의 세포 내 폴리아민 농도 측정]
상기에서 제작한 효모 균주들의 세포 내 폴리아민 농도를 하기과 같은 방법에 의해 측정하였다.
1) 배양한 세포를 원심분리를 이용하여 포집한 후 g 균체 당 5 ml의 5% 트리클로로아세틱 에시드 (Trichloroacetic acid) 용액을 이용하여 1시간 동안 교반하였다. (총 부피 = 1.6 ml)
2) 원심분리 후에 상등액을 100 μl의 2 M K2HPO4 용액으로 중화시켰다.
3) 800 μl의 시료, 400 μl의 포화 NaHCO3 용액, 800 μl의 5% 단실 클로라이드 (Dansyl chloride) 용액을 혼합 후, 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
4) 스피드백 기기를 이용하여 용매를 증발시킨 후, 1 ml의 아세토나이트릴 (Acetonitrile) 용액으로 교반하였다.
5) 이 용액을 Capcell Pak C18 MG 컬럼을 이용해 30°C, 0.8 ml/min, UV (254 nm) 조건에서 아세토나이트릴과 HPLC 정제수를 이동상으로 하여 아래와 같은 변화 조건에서 HPLC 분석하였다.
하기 표 1은 시간에 따른 이동상의 변화조건을 보여준다.
[표 1]
Figure 112014001880242-pat00001
실험 결과, 음성되먹임작용에 관여하는 OAZ1 유전자 파쇄와 SPE1 , SPE2 , SPE3 유전자 과발현을 조합한 경우, D452-2 모균주에 비해 세포 내 스퍼미딘 농도가 증대된 것을 확인할 수 있었다. 특히, 이러한 유전자의 변화를 모두 조합한 경우에는 2 mM의 스퍼미딘을 배지 중에 첨가한 경우보다 세포 내 스퍼미딘 농도가 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 OAZ1 유전자 파쇄와 SPE1 , SPE2 , SPE3 유전자의 과발현을 조합하였을 경우, 효모 세포 내 폴리아민 농도를 보여주는 그래프이다. 도 6에서 가로축은 유전자 조작의 조합을 나타내며, 2 mM SPD는 2 mM의 스퍼미딘을 배지에 직접 첨가한 경우이다.
한편, 효모 세포 내 폴리아민의 세포 외 배출에 관련된 유전자인 TPO1을 파쇄하였을 경우, 대조군에 비해 스퍼미딘 농도가 두 배가량 향상되었다. 또한, OAZ1 유전자가 파쇄되고, SPE3 유전자가 과발현된 균주에 TPO1 유전자 파쇄를 도입하였을 경우에 스퍼미딘 농도가 1.4배가량 증가하였다.
도 7은 TPO1 유전자를 파쇄하였을 경우, 효모 세포 내 폴리아민 농도를 보여주는 그래프이다. 도 7에서 가로축은 유전자 조작의 조합을 나타낸다.
[ 실시예 7. OAZ1 유전자 파쇄와 SPE1 , SPE2 , SPE3 유전자 과발현의 조합에 따른 퍼퓨랄 , HMF 에 대한 저항성 효과]
상기 실시예 5에서 제작한 효모 균주들의 세포 성장을 생육 저해물질로 2 g/L의 퍼퓨랄과 HMF가 첨가된 YNB 배지에서 측정하였다.
실험 결과, OAZ1 유전자가 파쇄된 균주 (oaz1), OAZ1 유전자가 파쇄되고 SPE1 유전자를 과발현하는 균주 (oaz1SPE1), OAZ1 유전자가 파쇄되고 SPE2 유전자를 과발현하는 균주 (oaz1SPE2), OAZ1 유전자가 파쇄되고 SPE3 유전자를 과발현하는 균주 (oaz1SPE3)의 정지기가 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 이 중에서 oaz1SPE3 균주의 정지기가 1.4배가량으로 가장 많이 감소하는 효과를 보였다. 이는 본 발명에서 구축한 균주가 퍼퓨랄 및 HMF에 대해 저항성을 획득함을 의미하는 것이다.
도 8은 퍼퓨랄과 HMF의 저항성에 대한 OAZ1 유전자 파쇄와 SPE1 , SPE2 , SPE3 유전자 과발현의 효과를 보여주는 그래프이다. 도 8에서 색인은 유전자 조작의 조합을 나타낸다.
[ 실시예 8. TPO1 유전자 파쇄의 퍼퓨랄 , HMF 에 대한 저항성 효과]
상기 실시예 5에서 제작한 효모 균주들의 세포성장을 생육 저해물질로 2 g/L의 퍼퓨랄과 HMF 첨가된 YNB 배지에서 측정하였다.
실험 결과, TPO1 유전자가 파쇄된 균주 (tpo1), TPO1과 OAZ1 유전자가 파쇄되고 SPE3 유전자를 과발현하는 균주 (tpo1oaz1SPE3)의 정지기가 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 이때, 정지기 감소 효과는 단일 TPO1 유전자 파쇄 균주가 가장 컸다.
도 9는 퍼퓨랄과 HMF의 저항성에 대한 TPO1 유전자 파쇄의 효과를 보여주는 그래프이다. 도 9에서 각각의 그래프는 각각의 그래프 상단에 기재한 유전자 조작의 조합에 따른 배양 결과를 나타낸다.
한편, 구체적으로는 tpo1 균주의 퍼퓨랄, HMF의 변환 속도가 대조군에 비해 각각 1.3, 1.8배 향상되었으며, 에탄올 생산성은 1.8배 증대하였다.
하기 표 2는 퍼퓨랄과 HMF의 저항성에 대한 TPO1 유전자 파쇄의 효과를 정리한 결과이다. 세로축은 유전자 조작의 조합을 나타낸다.
[표 2]
Figure 112014001880242-pat00002

[ 실시예 9. 아세트산에 대한 내성이 증대된 효모균주의 선별]
상기에서 구축한 균주 중 퍼퓨랄과 HMF에 대한 저항성 증대효과가 컸던 tpo1, oaz1SPE3, tpo1oaz1SPE3 균주에 대해서 추가적으로 아세트산에 대한 내성을 확인해 보았다.
실험 결과, 생육 저해물질로, 3 g/L, 4 g/L 아세트산 조건에서 tpo1 균주와 oaz1SPE3 균주는 대조군과 비슷한 정도의 최대균체량과 비생장속도를 나타냈다.
한편, tpo1oaz1SPE3 균주의 경우, 대조군과 비교하여 3 g/L와 4 g/L 아세트산 조건에서 모두 향상된 최대균체량과 비생장속도를 나타냈다. 구체적으로 tpo1oaz1SPE3 균주는 대조군과 비교하여 3 g/L와 4 g/L의 아세트산 조건에서 각각 1.4배와 1.7배 향상된 비생장속도를 나타냈다.
도 10은 스퍼미딘 농도가 향상된 재조합 효모의 아세트산에 대한 내성효과를 보여주는 그래프이다. 도 10에서 색인은 유전자 조작의 조합을 나타낸다.
[ 실시예 10. 포도당과 자일로스 혼합당에서 퍼퓨랄 , HMF 에 대한 저항성 효과 확인]
상기에서 구축한 균주 중 퍼퓨랄과 HMF에 대한 저항성 증대효과가 가장 컸던 tpo1 균주의 혼합당 발효에서의 효과를 확인해 보았다.
사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) D452-2 모균주는 자일로스를 대사할 수 없기 때문에, 자일로스 대사경로에 관련된 일련의 유전자인 XYL1 , XYL2 , XYL3를 도입하였다 (D452-2/pXyl1,2,3) (Kim et al., Biotechnology Advances, 31(6):851-861, 2013). 그리고 이러한 균주를 대조군으로 하여 TPO1 유전자가 파쇄된 균주를 제작하였다 (D452-2:tpo1/pXyl1,2,3).
상기 두 가지 균주의 발효 양상은 도 11과 같았으며, 발효 결과 포도당과 자일로스 혼합당에서도 TPO1 유전자 파쇄에 의한 퍼퓨랄과 HMF에 대한 저항성 증대효과가 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로는 tpo1 균주의 퍼퓨랄, HMF의 변환 속도가 대조군에 비해 각각 2.2, 1.5배 향상되었으며, 에탄올 생산성은 1.4배 증대하였다.
도 11은 혼합당에서 TPO1 유전자 파쇄의 퍼퓨랄, HMF 저항성에 대한 효과를 보여주는 그래프이다.
하기 표 3은 혼합당에서 퍼퓨랄과 HMF의 저항성에 대한 TPO1 유전자 파쇄의 효과를 정리한 것이다.
[표 3]
Figure 112014001880242-pat00003

Claims (18)

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  7. 스퍼미딘 생합성에 관련된 SPE1, SPE2 및 SPE3 유전자 중 어느 하나 이상이 과발현되도록 형질전환되고, 오르니틴 데카르복실라아제 안티자임 (Ornithine decarboxylase antizyme) 효소의 기능이 실활되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 효모는,
    폴리아민 트랜스포터 (Polyamine transporter) 효소의 기능이 실활되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 재조합 효모는,
    오르니틴 데카르복실라아제 안티자임의 기능을 실활시키기 위해 OAZ1 유전자가 일부 파쇄되거나 또는 전부 제거된 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 재조합 효모는,
    폴리아민 트랜스포터의 기능을 실활시키기 위해, TPO1 유전자의 일부가 파쇄되거나 또는 전부 제거된 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
  12. 제7항 또는 제9항에 있어서,
    상기 효모는,
    사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
  13. 배지에 제7항 또는 제9항의 재조합 효모를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 효모의 배양방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 배지는,
    퍼퓨랄 (furfural), HMF, 아세트산, 포름산 및 에탄올 중 선택되는 어느 하나의 생육 저해물질을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 효모의 배양방법.
  15. 삭제
  16. 제13항에 있어서,
    상기 효모는,
    사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 효모의 배양방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 배지는,
    포도당 및 자일로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모의 배양방법.
  18. 삭제
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