BR112015019777B1 - Método para produzir etanol com o uso de saccharomyces cerevisiae recombinante - Google Patents

Método para produzir etanol com o uso de saccharomyces cerevisiae recombinante Download PDF

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Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR ETANOL COM O USO DE LEVEDURA RECOMBINANTE. A presente invenção refere-se à utilização de xilose em levedura com uma capacidade de metabolização de xilose e à redução da concentração de ácido acético metabolizando-se ácido acético no meio durante a fermentação de etanol, sendo que esse método de produção para etanol compreende uma etapa para realizar a fermentação de etanol por meio de cultura em um meio contendo xilose e levedura recombinante na qual um gene de xilose isomerase e um gene de acetaldeído desidrogenase foram introduzidos.

Description

CAMPO DA TÉCNICA
[0001] A presente invenção refere-se a um método para produzir etanol com o uso de uma cepa de levedura recombinante que tem capacidade de metabolização de xilose.
TÉCNICA ANTERIOR
[0002] Uma biomassa celulósica é um material de partida eficaz para um álcool útil, tal como etanol, ou um ácido orgânico. Com a finalidade de aumentar a quantidade de etanol produzido com o uso de uma biomassa celulósica, as cepas de levedura com capacidade para utilizar uma xilose, a qual é uma pentose, como um substrato tem sido desenvolvido. Por exemplo, a Literatura de patente 1 revela uma cepa de levedura recombinante que resulta a partir da incorporação de um gene de xilose redutase e um gene de xilitol desidrogenase derivado a partir de Pichia stipitis e um gene de xiluloquinase derivado a partir de S. cerevisiae em seu cromossomo.
[0003] É de conhecimento que uma grande quantidade de ácido acético está contida em um hidrolisado de uma biomassa celulósica e que o ácido acético inibe a fermentação de etanol por uma cepa de levedura. No caso de uma cepa de levedura em que um gene de assimilação de xilose foi introduzido, em particular, o ácido acético é conhecido por inibir a fermentação de etanol realizada com o uso de xilose como uma fonte de sacarídeo a um nível significativo (Literatura de não patente 1 e 2).
[0004] Uma massa (moromi) que resulta de uma biomassa celulósica sacarificada com uma celulase é principalmente composta de resíduo não fermentado, resíduo insatisfatoriamente fermentável, enzimas e micro-organismos de fermentação. O uso de uma solução de reação contendo massa para o processo de fermentação subsequente possibilita a reutilização de micro-organismos de fermentação, redução da quantidade de micro-organismos de fermentação a serem introduzidos e redução de custo. Em tal caso, contudo, o ácido acético contido na massa é simultaneamente introduzido, a concentração de ácido acético contido em um meio de fermentação é aumentada como consequência, e isso pode inibir a fermentação de etanol. No caso de uma técnica de fermentação contínua, em que a massa em um tanque de fermentação é transferida para um tanque de vaporização no qual um nível de pressão reduzida é mantido, o etanol é removido do tanque de vaporização, e a massa é retornada para o tanque de fermentação, embora a remoção de ácido acético a partir da massa seja difícil. Desse modo, a inibição da fermentação mediada por ácido acético seria crítica.
[0005] Com a finalidade de evitar a inibição da fermentação pelo ácido acético, existem relatos relacionados à capacidade de fermentação de etanol na presença de ácido acético que foi aperfeiçoara por meio da superexpressão de gene LPP1 ou ENA1 (Literatura de não patente 3) ou rompimento de gene FPS1 (Literatura de não patente 4) de Saccharomyces cerevisiae, o qual é uma cepa usada geralmente para a fermentação de etanol. Contudo, tal literatura relata os resultados relacionados à fermentação de etanol conduzida com o uso de um substrato de glicose, e os efeitos sobre a fermentação de etanol conduzida com o uso de um substrato de xilose, a qual é inibida pelo ácido acético a um nível significante, permanecem desconhecidos. Mesmo se as cepas de levedura mutantes relatadas em tal literatura fossem usadas, a quantidade de ácido acético remanescente, o qual seria problemático no momento da reutilização de micro-organismos de fermentação ou fermentação contínua, não seria reduzida.
[0006] Alternativamente, a inibição da fermentação por ácido acético pode ser evitada pela metabolização de ácido acético em um meio simultaneamente com a fermentação de etanol. Contudo, o metabolismo de ácido acético é uma reação aeróbica, a qual se sobrepõe à via metabólica de etanol. Embora o metabolismo de ácido acético possa ser alcançado conduzindo-se a fermentação sob condições aeróbicas, consequentemente, o etanol como uma substância alvo também seria metabolizado.
[0007] Como um meio para metabolizar ácido acético sob condições anaeróbicas, em que o etanol não é metabolizado, a assimilação de ácido acético alcançada pela introdução do gene mhpF que codifica acetaldeído desidrogenase (EC 1.2.1.10) em uma cepa de Saccharomyces cerevisiae, na qual os genes GPD1 e GPD2 da via de produção de glicerina foram destruídos, tem sido relatada (Literatura de não patente 5 e Literatura de patente 2). O acetaldeído desidrogenase catalisa a reação reversível descrita abaixo.
[0008] Acetaldeído + NAD+ + coenzima A ^ acetil coenzima A + NADH + H+
[0009] A via de produção de glicerina mediada pelos genes GPD1 e GPD2 é uma via que oxida coenzima NADH excessiva que resulta do metabolismo em NAD+, conforme mostrado na seguinte reação química.
[0010] 0,5 de glicose + NADH + H+ + ATP ^ glicerina + NAD+ + ADP + Pi
[0011] A via de reação é destruída pelo rompimento dos genes GPD1 e GPD2, a coenzima NADH excessiva é suprida através da introdução de mhpF e a reação prossegue conforme mostrado abaixo.
[0012] Acetil coenzima A + NADH + H+ ^ acetaldeído + NAD+ + coenzima A
[0013] A acetil coenzima A é sintetizada a partir do ácido acético pela acetil-CoA sintetase, e o acetaldeído é convertido em etanol. Eventualmente, a coenzima NADH excessiva é oxidada e o ácido acético é metabolizado, conforme mostrado em na seguinte reação química.
[0014] Ácido acético + 2NADH + 2H+ + ATP ^ etanol + NAD+ + AMP + Pi
[0015] Conforme descrito acima, é necessário destruir a via de glicerina a fim de conferir a capacidade de metabolização de ácido acético para uma cepa de levedura. Contudo, a cepa rompida por GPD1 e GPD2 é conhecida por ter capacidade de fermentação significativamente reduzida, e a utilidade no nível industrial é baixa. Nem a Literatura de não patente 5 e nem a Literatura de patente 2 se refere à cepa de assimilação de xilose e, consequentemente, se a cepa de interesse seria eficaz ou não no momento da assimilação de xilose é desconhecido.
[0016] Uma cepa que resulta da introdução do gene mhpF em uma cepa que não foi submetida ao rompimento de gene GPD1 ou GPD2 também tem sido relatada (Literatura de não patente 6). Embora a Literatura de não patente 6 relate que a quantidade de produção de ácido acético é reduzida sob a introdução do gene mhpF, a mesma não relata que o ácido acético no meio seria reduzido. Além disso, a Literatura de não patente 6 não se refere a uma cepa de levedura de assimilação de xilose.
[0017] Além disso, existem relatos relacionados a uma cepa de levedura de assimilação de xilose que resulta da introdução de um gene de xilose isomerase (XI) (derivado a partir do protozoário intestinal de térmites) (Literatura de patente 3) e uma cepa que resulta da introdução adicional do gene de acetaldeído desidrogenase (derivado a partir de Bifidobacterium adolescentis) em uma cepa de levedura de assimilação de xilose que compreende um gene XI (derivado a partir de Piromyces sp. E2) introduzido na mesma (Literatura de patente 4), embora a literatura acima não relate a assimilação de ácido acético no momento da assimilação de xilose.
[0018] De acordo com técnicas convencionais, conforme descrito acima, o ácido acético não seria metabolizado ou degradado de modo eficaz sob as condições em que a fermentação de etanol e a assimilação de xilose ocorrem simultaneamente.
LISTA DE CITAÇÃO LITERATURA DE PATENTE
[0019] Literatura de patente 1: JP 2009-195220 A
[0020] Literatura de patente 2: WO 2011/010923
[0021] Literatura de patente 3: JP 2011-147445 A
[0022] Literatura de patente 4: JP 2010-239925 A
LITERATURA DE NÃO PATENTE
[0023] Literatura de não patente 1: FEMS Yeast Research, vol. 9, 2009, páginas 358 a 364
[0024] Literatura de não patente 2: Enzyme and Microbial Technology 33, 2003, páginas 786 a 792
[0025] Literatura de não patente 3: Biotechnol. Bioeng., 2009, 103 (3): páginas 500 a 512
[0026] Literatura de não patente 4: Biotechnol. Lett., 2011, 33: páginas 277 a 284
[0027] Literatura de não patente 5: Appl. Environ. Microbiol., 2010, 76: páginas 190 a 195
[0028] Literatura de não patente 6: Biotechnol. Lett., 2011, 33: páginas 1.375 a 1.380
SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA
[0029] Sob as circunstâncias acima, é um objetivo de a presente invenção fornecer um método para produzir etanol com o uso de uma cepa de levedura recombinante com capacidade para metabolizar ácido acético em um meio para reduzir a concentração de ácido acético na mesma, sob a realização da assimilação de xilose e fermentação de etanol com o uso de uma cepa de levedura que tem capacidade de metabolização de xilose, a fim de aperfeiçoar a produtividade de etanol.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA
[0030] Os presentes inventores conduziram estudos concentrados a fim de alcançar o objetivo acima. Como resultado, constataram que uma cepa de levedura recombinante que resulta da introdução de um gene de acetaldeído desidrogenase particular em uma cepa de levedura que tem capacidade de metabolização de xilose possibilitaria a metabolização de ácido acético em um meio sob a realização da fermentação de etanol em um meio contendo xilose. Isso conduziu à conclusão da presente invenção.
[0031] A presente invenção inclui o seguinte.
[0032] (1) Um método para produzir etanol que compreende etapas de cultivar uma cepa de levedura recombinante que compreende um gene de xilose isomerase e um gene de acetaldeído desidrogenase introduzidos na mesma em um meio contendo xilose para realizar fermentação de etanol.
[0033] (2) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que o gene de xilose isomerase codifica a proteína (a) ou (b) abaixo:
[0034] (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 4; ou
[0035] (b) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 4 e que tem atividade enzimática para converter xilose em xilulose.
[0036] (3) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que o gene de acetaldeído desidrogenase codifica acetaldeído desidrogenase derivado a partir de E. coli.
[0037] (4) O método para produzir etanol de acordo com (3), em que o acetaldeído desidrogenase derivado a partir de E. coli é a proteína (a) ou (b) abaixo:
[0038] (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 2 ou 20; ou
[0039] (b) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 2 ou 20 e que tem atividade de acetaldeído desidrogenase.
[0040] (5) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que o gene de acetaldeído desidrogenase codifica acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii.
[0041] (6) O método para produzir etanol de acordo com (5), em que o acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii é a proteína (a) ou (b) abaixo:
[0042] (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 22; ou
[0043] (b) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 22 e que tem atividade de acetaldeído desidrogenase.
[0044] (7) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que o gene de acetaldeído desidrogenase codifica acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii.
[0045] (8) O método para produzir etanol de acordo com (5), em que o acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii é a proteína (a) ou (b) abaixo:
[0046] (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 24; ou
[0047] (b) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 24 e que tem atividade de acetaldeído desidrogenase.
[0048] (9) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que a cepa de levedura recombinante compreende adicionalmente o gene de xiluloquinase introduzido na mesma.
[0049] (10) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que a cepa de levedura recombinante compreende um gene que codifica uma enzima selecionada a partir do grupo de enzimas que constitui um processo não oxidativo na via de pentose fosfato.
[0050] (11) O método para produzir etanol de acordo com (10), em que o grupo de enzimas que constitui um processo não oxidativo na via de pentose fosfato inclui ribose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato- 3-epimerase, transcetolase e transaldolase.
[0051] (12) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que o meio contém celulose e a fermentação de etanol prossegue simultaneamente com a sacarificação pelo menos pela celulose.
[0052] (13) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que a cepa de levedura recombinante permite a expressão de alto nível do gene de álcool desidrogenase que tem atividade para converter acetaldeído em etanol.
[0053] (14) O método para produzir etanol de acordo com (1), em que a cepa de levedura recombinante mostra um nível de expressão reduzido do gene de álcool desidrogenase que tem atividade para converter etanol em acetaldeído.
[0054] O presente pedido reivindica prioridade dos pedidos de patente japoneses JP 2013-037501 e JP 2014-36652, dos quais os conteúdos estão aqui incorporados a título de referência nesse pedido.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[0055] De acordo com o método para produzir etanol da presente invenção, a concentração de ácido acético em um meio pode ser reduzida, e a inibição da fermentação causada por ácido acético pode ser evitada de modo eficaz. Como resultado, o método para produzir etanol da presente invenção tem capacidade para manter a alta eficiência para fermentação de etanol realizada com o uso de xilose como uma fonte de sacarídeo e alcançar rendimento de etanol excelente. Consequentemente, o método para produzir etanol da presente invenção possibilita a redução da quantidade de ácido acético remanescente no momento, por exemplo, da reutilização da cepa de levedura recombinante ou uso da mesma para cultura contínua, permitindo, assim, a manutenção de um rendimento de etanol excelente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0056] A Figura 1 mostra esquematicamente uma constituição de pUC-HIS3U-P_HOR7-XKS1-T_TDH3-P_TDH2-hph-T_CYC1-HIS3D.
[0057] A Figura 2 mostra esquematicamente uma constituição de pUC-R67-HOR7p-RsXI-T_TDH3-TRP1d-R45.
[0058] A Figura 3 mostra esquematicamente uma constituição de pUC-LEU2U-P_HOR7-TAL1-T_TDH3-P_HOR7-TKL1-T_TDH3-HIS3- LEU2D.
[0059] A Figura 4 mostra esquematicamente uma constituição de pUC-GRE3U-P_HOR7-RPE1-T_TDH3-P_HOR7-RKI1-T_TDH3-LEU2- GRE3D.
[0060] A Figura 5 mostra esquematicamente uma constituição de pCR-ADH2U-URA3-ADH2D.
[0061] A Figura 6 mostra esquematicamente uma constituição de pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-URA3-ADH2D.
[0062] A Figura 7 mostra esquematicamente uma constituição de pCR-ADH2part-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D.
[0063] A Figura 8 mostra esquematicamente uma constituição de pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF- HOR7_P-URA3-ADH2D.
[0064] A Figura 9 mostra esquematicamente uma constituição de pCR-ADH2U-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D.
[0065] A Figura 10 mostra esquematicamente uma constituição de pCR-ADH2U-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P- URA3-ADH2D.
[0066] A Figura 11 mostra esquematicamente uma constituição de pCR-ADH2part-T_CYC1-URA3-ADH2D.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES
[0067] Doravante, a presente invenção é descrita em maiores detalhes com referência aos desenhos e aos exemplos.
[0068] O método para produzir etanol da presente invenção é um método para sintetizar etanol a partir de uma fonte de sacarídeo contida em um meio com o uso de uma cepa de levedura recombinante que tem capacidade de metabolização de xilose, na qual um gene de acetaldeído desidrogenase foi introduzido. De acordo com o método para produzir etanol da presente invenção, uma vez que a cepa de levedura recombinante pode metabolizar ácido acético contido em um meio, a concentração de ácido acético em um meio é reduzida em associação à fermentação de etanol.
CEPA DE LEVEDURA RECOMBINANTE
[0069] Uma cepa de levedura recombinante usada no método para produzir etanol da presente invenção compreende o gene de xilose isomerase e o gene de acetaldeído desidrogenase introduzidos na mesma, a qual é uma cepa de levedura que tem capacidade de metabolização de xilose. O termo “cepa de levedura que tem capacidade de metabolização de xilose” se refere a qualquer uma dentre as seguintes: uma cepa de levedura a qual a capacidade de metabolização de xilose tem sido conferida como resultado da introdução de um gene de xilose isomerase em uma cepa de levedura que não tem inerentemente capacidade de metabolização de xilose; uma cepa de levedura a qual a capacidade de metabolização de xilose tem sido conferida como resultado da introdução de um gene de xilose isomerase e outro gene associado ao metabolismo de xilose em uma cepa de levedura que não tem inerentemente capacidade de metabolização de xilose; e uma cepa de levedura que tem inerentemente capacidade de metabolização de xilose.
[0070] Uma cepa de levedura que tem capacidade de metabolização de xilose tem capacidade para assimilar xilose contida em um meio para produzir etanol. A xilose contida em um meio pode ser obtida pela sacarificação de xilano ou hemicelulose que compreende xilose como um açúcar constituinte. Alternativamente, a mesma pode ser suprida para um meio como resultado da sacarificação de xilano ou hemicelulose contida em um meio por uma enzima de sacarificação. No caso do último, o termo “xilose contida em um meio” se refere ao chamado processo de sacarificação e fermentação simultânea.
[0071] O gene de xilose isomerase (o gene XI) não é particularmente limitado, e um gene que se origina a partir de qualquer espécie de organismo pode ser usado. Por exemplo, uma pluralidade dos genes de xilose isomerase derivados a partir do protozoário intestinal de térmites revelados no documento sob o no. JP 2011-147445 A pode ser usada sem limitação particular. Os exemplos dos genes de xilose isomerase que podem ser usados incluem um gene derivado a partir da cepa E2 do fungo anaeróbico Piromyces sp. (JP 2005-514951 A), um gene derivado a partir do fungo anaeróbico Cyllamyces aberensis, um gene derivado a partir de outra cepa bacteriana (isto é, Bacteroides thetaiotaomicron), um gene derivado a partir de uma cepa bacteriana (isto é, Clostridium phytofermentans) e um gene derivado a partir do cluster de Streptomyces murinus.
[0072] Especificamente, o uso de um gene de xilose isomerase derivado a partir do protozoário intestinal de Reticulitermes speratus como o gene de xilose isomerase é preferencial. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene de xilose isomerase derivado a partir do protozoário intestinal de Reticulitermes speratus e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.
[0073] Os genes de xilose isomerase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 3 e 4. Os mesmos podem ser um gene parálogo ou um gene homólogo no sentido estreito que tem sequências de aminoácidos e nucleotídeos diferentes.
[0074] Os genes de xilose isomerase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 3 e 4. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos que têm 70% ou mais, de preferência, 80% ou mais, com mais preferência, 90% ou mais, e com a máxima preferência, 95% ou mais de identidade ou similaridade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 4 e que codifica uma proteína que tem atividade de xilose isomerase. O grau de identidade ou similaridade de sequência pode ser determinado com o uso do programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (em configurações predefinidas). O grau de similaridade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e resíduos de aminoácido que exibem funções similares do ponto de vista físico-químico, determinando-se o número total de tais resíduos de aminoácido, e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada pelo número total de tais resíduos de aminoácido. O grau de identidade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada por tais resíduos de aminoácido.
[0075] Adicionalmente, os genes de xilose isomerase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 3 e 4. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos derivada a partir da sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 4 por meio de substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que codifica uma proteína que tem atividade de acetaldeído desidrogenase. O termo “vários” usado no presente documento se refere a, por exemplo, 2 a 30, de preferência, 2 a 20, com mais preferência, 2 a 10, e com a máxima preferência, 2 a 5.
[0076] Adicionalmente, os genes de xilose isomerase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 3 e 4. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que hibridiza sob condições rigorosas na sequência de comprimento total ou uma sequência parcial de um filamento complementar de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos conforme mostrado em SEQ ID NO: 3 e que codifica uma proteína que tem atividade de xilose isomerase. Sob “condições rigorosas”, os chamados híbridos específicos são formados, mas os híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser determinadas adequadamente com referência a, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a hibridização Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem na hibridização Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é de 25 a 500 mM e, de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é 42 °C a 68 °C e, de preferência, 42 °C a 65 °C, por exemplo. Ainda especificamente, a concentração de sódio é de 5x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio) e a temperatura é de 42 °C.
[0077] Conforme descrito acima, se um gene que compreende uma sequência de nucleotídeos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 3 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 4 iria funcionar ou não como um gene de xilose isomerase pode ser determinado, por exemplo, preparando-se um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor e um terminador, transformando-se um hospedeiro E. coli com o uso de tal vetor de expressão e avaliando-se a atividade de xilose isomerase da proteína expressada. O termo “atividade de xilose isomerase” se refere à atividade para isomerizar xilose em xilulose. Consequentemente, a atividade de xilose isomerase pode ser avaliada preparando-se uma solução contendo xilose como um substrato, permitindo-se que a proteína alvo reaja a uma temperatura adequada e medindo-se a quantidade de xilose que tem diminuído e/ou a quantidade de xilulose que foi gerada.
[0078] É particularmente preferencial usar, como um gene de xilose isomerase, um gene que codifica xilose isomerase mutante que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 4 que tem uma mutação específica de um resíduo de aminoácido particular e, desse modo, que tem atividade de xilose isomerase aperfeiçoada. Um exemplo específico de um gene que codifica xilose isomerase mutante é um gene que codifica a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 4, em que a asparagina na posição de aminoácido 337 tem sido substituída por cisteína. A xilose isomerase que compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 4, na qual a asparagina na posição de aminoácido 337 tem sido substituída por cisteína, tem atividade de xilose isomerase superior àquela da xilose isomerase do tipo selvagem. Além disso, a xilose isomerase mutante não é limitada à xilose isomerase em que a asparagina na posição de aminoácido 337 tem sido substituída por cisteína. A mesma pode ser xilose isomerase em que a asparagina na posição de aminoácido 337 tem sido substituída por um aminoácido diferente da cisteína, xilose isomerase em que a asparagina na posição de aminoácido 337 tem sido substituída por um aminoácido diferente e a substituição adicional de um resíduo de aminoácido diferente tem ocorrido, ou xilose isomerase em que um resíduo de aminoácido além da asparagina na posição de aminoácido 337 tem sido substituído por um aminoácido diferente.
[0079] Entretanto, os exemplos de genes associados ao metabolismo de xilose diferentes do gene de xilose isomerase incluem um gene de xilose redutase que codifica uma xilose redutase que converte xilose em xilitol, um gene de xilitol desidrogenase que codifica um xilitol desidrogenase que converte xilitol em xilulose e um gene de xiluloquinase que codifica uma xiluloquinase que fosforila xilulose para produzir xilulose 5-fosfato. A xilulose 5-fosfato produzida por uma xiluloquinase entra na via de pentose fosfato e é, então, metabolizada na mesma.
[0080] Os exemplos de genes associados ao metabolismo de xilose incluem, porém não se limitam particularmente, um gene de xilose redutase e um gene de xilitol desidrogenase derivado a partir de Pichia stipitis e um gene de xiluloquinase derivado a partir de Saccharomyces cerevisiae (consulte Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66: 3.381 a 3.386; e Toivari M. N. et al., Metab. Eng., 3: 236 a 249). Além disso, os genes de xilose redutase derivados a partir de Candida tropicalis e Candida prapsilosis, genes de xilitol desidrogenase derivados a partir de Candida tropicalis e Candida prapsilosis, e um gene de xiluloquinase derivado a partir de Pichia stipitis podem ser usados.
[0081] Os exemplos de cepas de levedura que têm inerentemente capacidade de metabolização de xilose incluem, porém não se limitam particularmente, Pichia stipitis, Candida tropicalis e Candida prapsilosis.
[0082] Um gene de acetaldeído desidrogenase a ser introduzido em uma cepa de levedura que tem capacidade de metabolização de xilose não é particularmente limitado, e um gene derivado a partir de qualquer espécie de organismo pode ser usado. Quando genes de acetaldeído desidrogenase derivados a partir de organismos diferentes de um fungo, tal como levedura (por exemplo, genes derivados a partir de bactérias, animais, plantas, insetos ou algas) são usados, é preferencial que a sequência de nucleotídeos do gene seja modificada de acordo com a frequência de uso de códon em uma cepa de levedura na qual o gene de interesse deve ser introduzido.
[0083] Mais especificamente, o gene mhpF de E. coli ou o gene ALDH1 de Entamoeba histolytica, conforme revelado em Applied and Environmental Microbiology, maio de 2004, páginas 2.892 a 2.897, Vol. 70, No. 5, pode ser usado como os genes de acetaldeído desidrogenase. A sequência de nucleotídeos do gene mhpF de E. coli e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene mhpF são mostradas em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.
[0084] Os genes de acetaldeído desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 1 e 2. Os mesmos podem ser um gene parálogo ou um gene homólogo no sentido estreito que tem sequências de aminoácidos e nucleotídeos diferentes, contanto que codifique uma enzima definida com EC No. 1.2.1.10. Os exemplos dos genes de acetaldeído desidrogenase incluem um gene adhE de E. coli, um gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii e um gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii. Aqui, a sequência de nucleotídeos do gene adhE de E. coli e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene adhE são mostradas em SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente. Além disso, a sequência de nucleotídeos do gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente. Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos do gene de acetaldeído desidrogenase derivada a partir de Chlamydomonas reinhardtii e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOs: 23 e 24, respectivamente.
[0085] Os genes de acetaldeído desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 1 e 2, 19 e 20, 21 e 22 ou 23 e 24. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais, de preferência, 80% ou mais, com mais preferência, 90% ou mais, e com a máxima preferência, 95% ou mais identidade ou similaridade de sequência com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 20, 22, ou 24 e que codifica uma proteína que tem atividade de acetaldeído desidrogenase. O grau de identidade ou similaridade de sequência pode ser determinado com o uso do programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (em configurações predefinidas). O grau de similaridade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e resíduos de aminoácido que exibem funções similares do ponto de vista físico-químico, determinando-se o número total de tais resíduos de aminoácido e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada pelo número total dos resíduos de aminoácido mencionados anteriormente. O grau de identidade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada por tais resíduos de aminoácido completamente idênticos.
[0086] Adicionalmente, os genes de acetaldeído desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 1 e 2, 19 e 20, 21 e 22 ou 23 e 24. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos derivada a partir da sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 2, 20, 22, ou 24 por meio de substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que codifica uma proteína que tem atividade de acetaldeído desidrogenase. O termo “vários” usado no presente documento se refere a, por exemplo, 2 a 30, de preferência, 2 a 20, com mais preferência, 2 a 10, e com a máxima preferência, 2 a 5.
[0087] Adicionalmente, os genes de acetaldeído desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 1 e 2, 19 e 20, 21 e 22 ou 23 e 24. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que hibridiza sob condições rigorosas na sequência de comprimento total ou uma sequência parcial de um filamento complementar de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos conforme mostrado em SEQ ID NO: 1, 19, 21, ou 23 e que codifica uma proteína que tem atividade de acetaldeído desidrogenase. Sob “condições rigorosas”, os chamados híbridos específicos são formados, mas os híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser determinadas adequadamente com referência a, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para hibridização Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem na hibridização Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é de 25 a 500 mM e, de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é de 42 °C a 68 °C e, de preferência, 42 °C a 65 °C, por exemplo. Ainda especificamente, a concentração de sódio é de 5x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio), e a temperatura é de 42 °C.
[0088] Conforme descrito acima, se um gene que compreende uma sequência de nucleotídeos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, 19, 21, ou 23 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 2, 20, 22, ou 24 iria funcionar ou não como um gene de acetaldeído desidrogenase pode ser determinado, por exemplo, preparando-se um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor e um terminador, transformando-se um hospedeiro E. coli com o uso de tal vetor de expressão, e avaliando-se a atividade de acetaldeído desidrogenase da proteína expressada. A atividade de acetaldeído desidrogenase pode ser avaliada preparando-se uma solução que contém acetaldeído, CoA, e NAD+ como substratos, permitindo-se que a proteína alvo reaja à temperatura adequada, e convertendo-se o acetil fosfato gerado em acetil fosfato com o auxílio de uma fosfato acetil transferase ou avaliando-se de maneira espectroscópica o NADH gerado.
[0089] Uma cepa de levedura recombinante usada no método para produzir etanol da presente invenção tem capacidade de metabolização de xilose e compreende pelo menos o gene de acetaldeído desidrogenase introduzido na mesma. Uma cepa de levedura recombinante pode compreender adicionalmente outro(s) gene(s) introduzidos na mesma, e tal(is) outro(s) gene(s) não são particularmente limitados. Por exemplo, um gene envolvido no metabolismo de açúcar de glicose pode ser introduzido em tal cepa de levedura recombinante. Por exemplo, uma cepa de levedura recombinante pode ter atividade de β-glicosidase que resulta da introdução do gene de β-glicosidase.
[0090] O termo “atividade de β-glicosidase” usado no presente documento se refere à atividade de catalisar uma reação de hidrólise de uma ligação de β-glicosídeo de um açúcar. Especificamente, a β- glicosidase tem capacidade para degradar um celo-oligossacarídeo, tal como celobiose, em glicose. O gene de β-glicosidase pode ser introduzido sob a forma de um gene de exibição de superfície celular. O termo “gene de exibição de superfície celular” usado no presente documento se refere a um gene que é modificado para exibir uma proteína a ser codificada pelo gene em uma superfície celular. Por exemplo, um gene de β-glicosidase de exibição de superfície celular é um gene que resulta da fusão de um gene de β-glicosidase com um gene de proteína localizada na superfície celular. Uma proteína localizada na superfície celular é fixada e está presente em uma camada de superfície celular da levedura. Os exemplos incluem proteínas aglutinativas, tais como a- ou a-aglutinina e proteínas FLO. Em geral, uma proteína localizada na superfície celular compreende uma sequência de sinal secretório N-terminal e um sinal de reconhecimento de fixação de âncora de GPI C-terminal. Embora uma proteína localizada na superfície celular compartilhe propriedades com uma proteína secretória em termos da presença de um sinal secretório, seu sinal secretório se difere pelo fato de que a proteína localizada na superfície celular é transportada enquanto fixa a uma membrana celular através de uma âncora de GPI. Quando uma proteína localizada na superfície celular passa através de uma membrana celular, uma sequência de sinal de reconhecimento de fixação de âncora de GPI é seletivamente cortada, a mesma se liga a uma âncora de GPI em uma região C-terminal recém-projetada, e é, então, fixa à membrana celular. Posteriormente, a raiz da âncora de GPI é cortada por fosfolipase C dependente de fosfatidilinositol (PI-PLC). Subsequentemente, uma proteína separada da membrana celular é integrada em uma parede celular, fixada sobre uma camada de superfície de célula e, então, localizada em uma camada de superfície de célula (consulte, por exemplo, JP 2006-174767 A).
[0091] O gene de β-glicosidase não é particularmente limitado, e um exemplo é um gene de β-glicosidase derivado a partir de Aspergillus aculeatus (Murai, et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 4.857 a 4.861). Além disso, um gene de β-glicosidase derivado a partir de Aspergillus oryzae, um gene de β-glicosidase derivado a partir de Clostridium cellulovorans, e um gene de β-glicosidase derivado a partir de Saccharomycopsis fibligera podem ser usados.
[0092] Adicionalmente a ou além do gene de β-glicosidase, um gene que codifica outra enzima que constitui celulase pode ter sido introduzido em uma cepa de levedura recombinante usada no método para produzir etanol da presente invenção. Os exemplos de enzimas que constituem celulase além de β-glicosidase incluem exo- celobioidrolases que liberam celobiose a partir da terminação de celulose cristalina (CBH1 e CBH2) e endo-glucanase (EG) que não pode degradar a celulose cristalina, mas cliva uma cadeia de celulose não cristalina (celulose amorfa) aleatoriamente.
[0093] Os exemplos de outros genes a serem introduzidos em uma cepa de levedura recombinante incluem um gene de álcool desidrogenase (o gene ADH1) que tem atividade para converter acetaldeído em etanol, um gene de acetil-CoA sintetase (o gene ACS1) que tem atividade para converter ácido acético em acetil-CoA, e genes que têm atividade para converter acetaldeído em ácido acético (isto é, os genes ALD4, ALD5 e ALD6). O gene de álcool desidrogenase (o gene ADH2) que tem atividade para converter etanol em acetaldeído pode ser rompido.
[0094] Além disso, é preferencial que uma cepa de levedura recombinante usada no método para produzir etanol da presente invenção permita a expressão de alto nível do gene de álcool desidrogenase (o gene ADH1) que tem atividade para converter acetaldeído em etanol. Com a finalidade de realizar a expressão de alto nível de tal gene, por exemplo, um promotor do gene inerente pode ser substituído por um promotor destinado para a expressão de alto nível, ou um vetor de expressão que possibilita a expressão de tal gene pode ser introduzido em uma cepa de levedura.
[0095] A sequência de nucleotídeos do gene ADH1 de Saccharomyces cerevisiae e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente. O gene de álcool desidrogenase a ser expressado em alto nível não é limitado aos genes identificados por SEQ ID NOs: 5 e 6. O mesmo pode ser um gene parálogo ou um gene homólogo no sentido estreito que tem sequências de aminoácidos e nucleotídeos diferentes.
[0096] Os genes de álcool desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 5 e 6. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais, de preferência, 80% ou mais, com mais preferência, 90% ou mais, e com a máxima preferência, 95% ou mais similaridade de sequência ou identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 6 e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. O grau de identidade ou similaridade de sequência pode ser determinado com o uso do programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (em configurações predefinidas). O grau de similaridade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e resíduos de aminoácido que exibem funções similares do ponto de vista físico- químico, determinando-se o número total de tais resíduos de aminoácido, e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada pelo número total de tais resíduos de aminoácido. O grau de identidade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada pelo número total de tais resíduos de aminoácido.
[0097] Adicionalmente, os genes de álcool desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 5 e 6. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos derivada a partir da sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 6 por meio da substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. O termo “vários” usado no presente documento se refere a, por exemplo, 2 a 30, de preferência, 2 a 20, com mais preferência, 2 a 10, e com a máxima preferência, 2 a 5.
[0098] Adicionalmente, os genes de álcool desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 5 e 6. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que hibridiza sob condições rigorosas na sequência de comprimento total ou uma sequência parcial de um filamento complementar de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos conforme mostrado em SEQ ID NO: 5 e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. Sob “condições rigorosas”, os chamados híbridos específicos são formados, mas os híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser determinadas adequadamente com referência a, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para hibridização Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem na hibridização Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é de 25 a 500 mM e de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é de 42 °C a 68 °C e, de preferência, 42°C a 65°C, por exemplo. Ainda especificamente, a concentração de sódio é de 5x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio), e a temperatura é de 42°C.
[0099] Conforme descrito acima, se um gene que compreende uma sequência de nucleotídeos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 5 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 6 iria funcionar ou não como um gene de álcool desidrogenase que tem atividade para converter acetaldeído em etanol pode ser determinado, por exemplo, preparando-se um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor e um terminador, transformando-se um hospedeiro de levedura com o uso de tal vetor de expressão, e avaliando-se a atividade de álcool desidrogenase da proteína expressada. A atividade de álcool desidrogenase para converter acetaldeído em etanol pode ser avaliada preparando-se uma solução que contém aldeído e NADH ou NADPH como substratos, permitindo-se que a proteína alvo reaja em temperatura adequada, e avaliando-se o álcool gerado ou analisando- se de maneira espectroscópica NAD+ ou NADP+.
[00100] Uma cepa de levedura recombinante usada no método para produzir etanol da presente invenção é caracterizada, de preferência, por um nível de expressão reduzido do gene de álcool desidrogenase (o gene ADH2) que tem atividade para converter etanol em aldeído. Com a finalidade de reduzir o nível de expressão de tal gene, um promotor do gene de interesse inerente pode ser modificado, ou tal gene pode ser deletado. Com a finalidade de deletar o gene, cada um ou ambos dentre um par de genes ADH2 presentes em levedura recombinante diploide podem ser deletados. Os exemplos de técnicas para suprimir a expressão de gene incluem a técnica de transposão, a técnica de transgene, silenciamento de gene pós-transcrição, a técnica de RNAi, a técnica de decaimento mediado por sem sentido (NMD), a técnica de ribozima, a técnica antissenso, a técnica de miRNA (micro- RNA) e a técnica de siRNA (RNA de pequena interferência).
[00101] A sequência de nucleotídeos do gene ADH2 de Saccharomyces cerevisiae e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente. Os genes de álcool desidrogenase alvo não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 7 e 8. Os mesmos podem ser um gene parálogo ou um gene homólogo no sentido estreito que tem sequências de aminoácidos e nucleotídeos diferentes.
[00102] Os genes de álcool desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 7 e 8. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos que tem 70% ou mais, de preferência, 80% ou mais, com mais preferência, 90% ou mais, e com a máxima preferência, 95% ou mais similaridade de sequência ou identidade com a sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 8 e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. O grau de identidade ou similaridade de sequência pode ser determinado com o uso do programa BLASTN ou BLASTX equipado com o algoritmo BLAST (em configurações predefinidas). O grau de similaridade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e resíduos de aminoácido que exibem funções similares do ponto de vista físico- químico, determinando-se o número total de tais resíduos de aminoácido, e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada pelo número total de tais resíduos de aminoácido. O grau de identidade de sequência é determinado submetendo-se um par de sequências de aminoácidos à análise de alinhamento por pares, identificando-se resíduos de aminoácido completamente idênticos e calculando-se a porcentagem de todos os resíduos de aminoácido submetidos à comparação representada por tais resíduos de aminoácido.
[00103] Adicionalmente, os genes de álcool desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 7 e 8. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que compreende uma sequência de aminoácidos derivada a partir da sequência de aminoácidos conforme mostrado em SEQ ID NO: 8 por meio da substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. O termo “vários” usado no presente documento se refere a, por exemplo, 2 a 30, de preferência, 2 a 20, com mais preferência, 2 a 10, e com a máxima preferência, 2 a 5.
[00104] Adicionalmente, os genes de álcool desidrogenase não são limitados aos genes identificados por SEQ ID NOs: 7 e 8. Por exemplo, os mesmos podem ser um gene que hibridiza sob condições rigorosas na sequência de comprimento total ou uma sequência parcial de um filamento complementar de DNA que compreende a sequência de nucleotídeos conforme mostrado em SEQ ID NO: 7 e que codifica uma proteína que tem atividade de álcool desidrogenase. Sob “condições rigorosas”, os chamados híbridos específicos são formados, mas os híbridos não específicos não são formados. Tais condições podem ser determinadas adequadamente com referência a, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira edição). Especificamente, o grau de rigor pode ser determinado de acordo com a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para hibridização Southern e a temperatura e a concentração de sal de uma solução usada para a etapa de lavagem na hibridização Southern. Sob condições rigorosas, mais especificamente, a concentração de sódio é de 25 a 500 mM e, de preferência, 25 a 300 mM, e a temperatura é de 42°C a 68°C e, de preferência, 42°C a 65°C, por exemplo. Ainda especificamente, a concentração de sódio é de 5x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio), e a temperatura é de 42°C.
[00105] Conforme descrito acima, se um gene que compreende uma sequência de nucleotídeos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 7 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos que se difere da sequência mostrada em SEQ ID NO: 8 iria funcionar ou não como um gene de álcool desidrogenase que tem atividade para converter etanol em aldeído pode ser determinado, por exemplo, preparando-se um vetor de expressão que compreende o gene de interesse incorporado em um sítio adequado entre um promotor e um terminador, transformando-se um hospedeiro de levedura com o uso de tal vetor de expressão e avaliando-se a atividade de álcool desidrogenase da proteína expressada. A atividade de álcool desidrogenase para converter etanol em aldeído pode ser avaliada preparando-se uma solução que contém álcool e NAD+ ou NADP+ como substratos, permitindo-se que a proteína alvo reaja em temperatura adequada e avaliando-se o aldeído gerado ou avaliando- se de maneira espectroscópica NADH ou NADPH.
[00106] Os exemplos adicionais de outros genes que podem ser introduzidos em uma cepa de levedura recombinante incluem genes associados à via metabólica de L-arabinose, a qual é uma pentose contida em hemicelulose que constitui uma biomassa. Os exemplos de tais genes incluem um gene de L-arabinose isomerase, um gene de L- ribuloquinase e um gene de L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase derivado a partir de procariotos e um gene de L-arabitol-4-desidrogenase e um gene de L-xilose redutase derivados a partir de eucariotos.
[00107] Em particular, um exemplo de outro gene a ser introduzido em uma cepa de levedura recombinante é um gene com capacidade para promover o uso de xilose em um meio. Um exemplo específico do mesmo é um gene que codifica xiluloquinase que tem atividade de gerar xilulose-5-fosfato com o uso de xilulose como um substrato. O fluxo metabólico da via de pentose fosfato pode ser aperfeiçoado através da introdução do gene de xiluloquinase.
[00108] Adicionalmente, um gene que codifica uma enzima selecionada a partir do grupo de enzimas que constitui um processo não oxidativo na via de pentose fosfato pode ser introduzido em uma cepa de levedura recombinante. Os exemplos de enzimas que constituem um processo não oxidativo na via de pentose fosfato incluem ribose-5- fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato-3-epimerase, transcetolase e transaldolase. É preferencial que um ou mais genes que codificam tais enzimas sejam introduzidos. É mais preferencial introduzir dois ou mais tais genes em combinação, adicionalmente preferencial introduzir três ou mais genes em combinação e da máxima preferência introduzir todos os genes acima.
[00109] Mais especificamente, o gene de xiluloquinase (XK) de qualquer origem pode ser usado sem limitação particular. Uma ampla variedade de micro-organismos, tais como cepas de levedura e bacterianas, as quais assimilam xilulose, tem o gene XK. Os exemplos preferenciais de tais genes incluem os genes XK derivados a partir de cepas de levedura, bactérias de ácido lático, bactérias de E. coli, e plantas. As informações relacionadas aos genes XK podem ser obtidas mediante a pesquisa do site da web da NCBI ou outras instituições, de acordo com a necessidade. Um exemplo de um gene XK é XKS1, o qual é um gene XK derivado a partir da cepa S288C de S. cerevisiae (GenBank: Z72979) (a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos na região de codificação CDS).
[00110] Mais especificamente, um gene de transaldolase (TAL), um gene de transcetolase (TKL), um gene de ribulose-5-fosfato epimerase (RPE) e um gene de ribose-5-fosfato cetoisomerase (RKI) de qualquer origem pode ser usado sem limitação particular. Uma ampla variedade de micro-organismos que compreendem a via de pentose fosfato tem tais genes. Por exemplo, uma cepa de levedura comum, tal como S. cerevisiae, tem tais genes. As informações relacionadas a tais genes podem ser obtidas junto ao site da web da NCBI ou outras instituições, de acordo com a necessidade. Os genes que pertencem ao mesmo gênero que as células eucarióticas hospedeiras, tais como as células eucarióticas ou de levedura, são preferenciais, e os genes que se originam a partir da mesma espécie que as células eucarióticas hospedeiras são adicionalmente preferenciais. Um gene TAL1, um gene TKL1 e um gene TKL2, um gene RPE1 e um gene RKI podem ser, de preferência, usados como o gene TAL, os genes TKL, o gene RPE e o gene RKI, respectivamente. Os exemplos de tais genes incluem um gene TAL1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: U19102), um gene TKL1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: X73224), um gene RPE1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: X83571) e um gene RKI1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae (GenBank: Z75003).
PRODUÇÃO DE CEPA DE LEVEDURA RECOMBINANTE
[00111] O gene de xilose isomerase e o gene de acetaldeído desidrogenase são introduzidos em um genoma de levedura hospedeiro, e uma cepa de levedura recombinante que pode ser usada na presente invenção pode ser produzida. O gene de xilose isomerase e o gene de acetaldeído desidrogenase podem ser introduzidos em uma cepa de levedura que não tem capacidade de metabolização de xilose, uma cepa de levedura que tem inerentemente a capacidade de metabolização de xilose ou uma cepa de levedura que não tem capacidade de metabolização de xilose em conjunto com o gene associado ao metabolismo de xilose. Quando o gene de xilose isomerase, o gene de acetaldeído desidrogenase e os genes descritos acima são introduzidos em uma cepa de levedura, tais genes podem ser simultaneamente introduzidos na mesma, ou tais genes podem ser introduzidos sucessivamente com o uso de vetores de expressão diferentes.
[00112] Os exemplos de cepas de levedura hospedeiras que podem ser usadas incluem, porém não se limitam particularmente, Candida Shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccaromyces pombe, sendo que Saccharomyces cerevisiae é particularmente preferencial. As cepas de levedura experimentais também podem ser usadas a partir do ponto de vista de conveniência experimental, ou cepas industriais (práticas) também podem ser usadas a partir do ponto de vista de utilidade prática. Os exemplos de cepas industriais incluem cepas de levedura usadas para a produção de vinho, saquê e shochu.
[00113] O uso de uma cepa de levedura hospedeira que tem propriedades homotálicas é preferencial. De acordo com a técnica revelada no documento sob o no. JP 2009-34036A, múltiplas cópias de genes podem ser facilmente introduzidas em um genoma com o uso de uma cepa de levedura que tem propriedades homotálicas. O termo “cepa de levedura que tem propriedades homotálicas” tem o mesmo significado que o termo “cepa de levedura homotálica”. As cepas de levedura que têm propriedades homotálicas não são particularmente limitadas, e qualquer cepa de levedura pode ser usada. Um exemplo de uma cepa de levedura que tem propriedades homotálicas é a cepa OC- 2 de Saccharomyces cerevisiae (NBRC2260), mas as cepas de levedura não são limitadas à mesma. Os exemplos de outras cepas de levedura que têm propriedades homotálicas incluem uma levedura de produção de álcool (Taiken No. 396, NBRC0216) (referência: “Alcohol kobo no shotokusei” (“Various properties of alcohol-producing yeast”), Shuken Kaiho, No. 37, páginas 18 a 22, 1998.8), uma levedura de produção de etanol isolada no Brasil e no Japão (referência: “Brazil to Okinawa de bunri shita Saccharomyces cerevisiae yaseikabu no idengakuteki seishitsu” (“Genetic properties of wild-type Saccharomyces cerevisiae isolated in Brazil and in Okinawa”), the Journal of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, Vol. 65, No. 4, páginas 759 a 762, 1991.4) e 180 (referência: “Alcohol Hakkoryoku no tsuyoi kobo no screening” (“Screening of yeast having potent alcohol- fermenting ability”), the Journal of the Brewing Society of Japan, Vol. 82, No. 6, páginas 439 a 443, 1987.6). Além disso, o gene HO pode ser introduzido em uma cepa de levedura que exibe fenótipos heterotálicos de uma maneira passível de expressão, e a cepa resultante pode ser usada como uma cepa de levedura que tem propriedades homotálicas. Isto é, o termo “cepa de levedura que tem propriedades homotálicas”, usado no presente documento, também se refere a uma cepa de levedura em que o gene HO foi introduzido de uma maneira passível de expressão.
[00114] A cepa OC-2 Saccharomyces cerevisiae é particularmente preferencial, uma vez que tem sido até o momento usado para elaboração de vinho, e a segurança da mesma tem sido verificada. Conforme descrito nos exemplos abaixo, a cepa OC-2 de Saccharomyces cerevisiae é preferencial em termos de sua excelente atividade de promotor em altas concentrações de açúcar. Em particular, a cepa OC-2 de Saccharomyces cerevisiae é preferencial em termos de sua excelente atividade de promotor para o gene piruvato descarboxilase (PDC1) em altas concentrações de açúcar.
[00115] Os promotores de genes a serem introduzidos não são particularmente limitados. Por exemplo, os promotores do gene de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (TDH3), do gene de 3- fosfoglicerato quinase (PGK1) e o gene de resposta à alta pressão osmótica 7 (HOR7) podem ser usados. O promotor do gene de piruvato descarboxilase gene (PDC1) é particularmente preferencial em termos de sua alta capacidade para expressar genes-alvo em uma região a jusante em níveis altos.
[00116] Especificamente, tal gene pode ser introduzido no genoma de levedura em conjunto com um promotor de regulação de expressão ou outra região de expressão regulada. Tal gene pode ser introduzido em um genoma de levedura hospedeiro de tal maneira que a expressão do mesmo seja regulada por um promotor ou outra região de expressão regulada de um gene que está presente inerentemente no mesmo.
[00117] O gene pode ser introduzido no genoma por meio de qualquer técnica convencional conhecida como uma técnica de transformação de levedura. Os exemplos específicos incluem, porém sem limitação, eletroporação (Meth. Enzym., 194, página 182, 1990), a técnica de esferoplasto (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75, página 1.929, 1978) e o método de acetato de lítio (J. Bacteriology, 153, página 163, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75, página 1.929, 1978; Methods in yeast genetics, edição de 2000: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual).
PRODUÇÃO DE ETANOL
[00118] Sob a produção de etanol com o uso da cepa de levedura recombinante descrita acima, a fermentação de etanol é realizada pela cultura em um meio que contém pelo menos xilose. Um meio em que a fermentação de etanol é realizada contém pelo menos xilose como uma fonte de carbono. O meio pode conter outra fonte de carbono, tal como glicose, antecipadamente.
[00119] A xilose que está contida em um meio a ser usado para a fermentação de etanol pode ser derivada a partir de uma biomassa. Em outras palavras, um meio a ser usado para a fermentação de etanol pode compreender uma biomassa celulósica e hemicelulase que gera xilose através de sacarificação de hemicelulose contida em uma biomassa celulósica. A biomassa celulósica pode ter sido submetida a uma técnica de pré-tratamento convencional. Os exemplos de técnicas de pré-tratamento incluem, porém não se limitam particularmente, degradação de uma lignina com um micro-organismo e trituração de uma biomassa celulósica. Por exemplo, uma biomassa celulósica triturada pode ser submetida ao pré-tratamento, tal como embebimento da mesma em uma solução de ácido sulfúrico diluído, solução alcalina ou solução iônica, tratamento hidrotérmico, ou trituração fina. Desse modo, a eficiência da sacarificação de biomassa pode ser aperfeiçoada.
[00120] Sob a produção de etanol com o uso da cepa de levedura recombinante descrita acima, o meio pode compreender adicionalmente celulose e celulase. Em tal caso, o meio iria conter glicose gerada pela ação da celulase imposta sob celulose. Quando um meio usado para a fermentação de etanol contém celulose, tal celulose pode ser derivada a partir de uma biomassa. Em outras palavras, um meio usado para a fermentação de etanol pode compreender celulase que tem capacidade para sacarificar celulase contida em uma biomassa celulósica.
[00121] Uma solução sacarificada que resulta da sacarificação de uma biomassa celulósica pode ser adicionada ao meio usado para a fermentação de etanol. Em tal caso, a solução sacarificada contém celulose restante ou celulase e xilose derivada a partir da hemicelulose contida em uma biomassa celulósica.
[00122] Conforme descrito acima, o método para produzir etanol da presente invenção compreende uma etapa de fermentação de etanol que envolve o uso de pelo menos xilose como uma fonte de sacarídeo. De acordo com o método para produzir etanol da presente invenção, o etanol pode ser produzido através de fermentação de etanol com o uso de xilose como uma fonte de sacarídeo. De acordo com o método para produzir etanol com o uso da cepa de levedura recombinante da presente invenção, a fermentação de etanol é seguida da recuperação de etanol a partir do meio. O etanol pode ser recuperado por qualquer meio convencional sem limitação particular. Após a conclusão do processo de fermentação de etanol mencionado acima, por exemplo, uma camada líquida que contém etanol é separada de uma camada sólida que contém a cepa de levedura recombinante ou matéria sólida através da separação de sólido-solução. Posteriormente, o etanol contido em uma camada líquida é separado e purificado através de destilação, de modo que o etanol altamente purificado possa ser recuperado. O grau de purificação de etanol pode ser determinado adequadamente de acordo com o propósito do uso do etanol.
[00123] Sob a produção de etanol com o uso de um sacarídeo derivado a partir de uma biomassa, em geral, um inibidor de fermentação, tal como ácido acético ou furfural, pode ser ocasionalmente gerado no processo de pré-tratamento ou sacarificação. Em particular, o ácido acético é conhecido por inibir o crescimento e multiplicação de cepas de levedura e por reduzir a eficiência para a fermentação de etanol conduzida com o uso de xilose como uma fonte de sacarídeo.
[00124] De acordo com a presente invenção, contudo, as cepas de levedura recombinantes nas quais o gene de xilose isomerase e o gene de acetaldeído desidrogenase foram introduzidos são usadas. Desse modo, o ácido acético contido em um meio pode ser metabolizado, e a concentração de ácido acético em um meio pode ser mantida em um nível baixo. Consequentemente, o método para produzir etanol da presente invenção pode alcançar um rendimento de etanol superior àquele alcançado com o uso de cepas de levedura em que nem um gene de xilose isomerase e nem um gene de acetaldeído desidrogenase foi introduzido.
[00125] De acordo com o método para produzir etanol da presente invenção, a concentração de ácido acético em um meio permanece baixa depois que a cepa de levedura recombinante foi cultivada durante um determinado período de tempo. Mesmo se parte do meio após tal determinado período de tempo for usada para um sistema de cultura contínua, no qual um novo processo de cultura é iniciado, consequentemente, a quantidade de ácido acético remanescente pode ser reduzida. De acordo com o método para produzir etanol da presente invenção, portanto, a quantidade de ácido acético remanescente pode ser reduzida mesmo quando as células são recuperadas e reusadas após a conclusão do processo de fermentação de etanol.
[00126] O método para produzir etanol da presente invenção pode empregar o chamado processo de sacarificação e fermentação simultânea, no qual a etapa de sacarificação de celulose contida em um meio com uma celulase prossegue ao mesmo tempo em que o processo de fermentação de etanol realizado com o uso de fontes de sacarídeo (isto é, xilose e glicose gerada pela sacarificação). Com o processo de sacarificação e fermentação simultânea, a etapa de sacarificação de uma biomassa celulósica é realizada simultaneamente com o processo de fermentação de etanol.
[00127] Os métodos de sacarificação não são particularmente limitados e, por exemplo, um método enzimático que envolve o uso de uma preparação de celulase, tal como celulase ou hemicelulase, pode ser empregado. Uma preparação de celulase contém uma pluralidade de enzimas envolvidas na degradação de uma cadeia de celulose e uma cadeia de hemicelulose, e a mesma exibe uma pluralidade de tipos de atividade, tais como atividade endoglucanase, atividade de endoxilanase, atividade de celobioidrolase, atividade de glicosidase e atividade de xilosidase. As preparações de celulase não são particularmente limitadas, e os exemplos incluem celulases produzidas por Trichoderma reesei e Acremonium cellulolyticus. As preparações de celulase disponíveis comercialmente também podem ser usadas.
[00128] No processo de sacarificação e fermentação simultânea, uma preparação de celulase e o micro-organismo recombinante são adicionados a um meio que contém uma biomassa celulósica (uma biomassa após o pré-tratamento pode ser usada), e a cepa de levedura recombinante é cultivada a uma determinada temperatura. A cultura pode ser realizada em qualquer temperatura sem limitação particular, e a temperatura pode ser de 25°C a 45°C e, de preferência, 30°C a 40 °C a partir do ponto de vista de eficiência de fermentação de etanol. O nível de pH da solução de cultura é, de preferência, de 4 a 6. Sob a condução da cultura, a agitação ou vibração pode ser realizada. Alternativamente, o processo de sacarificação e fermentação simultânea pode ser realizado de maneira irregular de modo que a sacarificação seja primeiramente realizada a uma temperatura ótima para uma enzima (40°C a 70°C), a temperatura é reduzida a um determinado nível (30°C a 40°C) e uma cepa de levedura é, então, adicionada ao mesmo.
EXEMPLOS
[00129] Doravante, a presente invenção é descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos, embora o escopo da técnica da presente invenção não seja limitado a esses exemplos.
EXEMPLO 1
[00130] No presente exemplo, uma cepa de levedura recombinante foi preparada através da introdução de um gene de xilose isomerase e um gene de acetaldeído desidrogenase de E. coli (o gene mhpF), e a capacidade de metabolização de ácido acético da cepa de levedura recombinante foi avaliada.
PRODUÇÃO DE VECTORES PARA INTRODUÇÃO DE GENE (1) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE XKS1
[00131] Como um vetor para introduzir o gene de xiluloquinase (XK) derivado a partir de S. cerevisiae em uma cepa de levedura, o vetor pUC-HIS3U-P_HOR7-XKS1-T_TDH3-P_TDH2-hph-T_CYC1-HIS3D mostrado na Figura 1 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene XKS1, o qual é um gene XK derivado a partir da cepa NBRC304 de S. cerevisiae na qual o promotor HOR7 e o terminador TDH3 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (GenBank: X61377); uma região a montante de aproximadamente 500 bp (HIS3U) do gene de histidina sintetase (HIS3) e uma região de aproximadamente 500 bp dentro de tal gene (HIS3D), as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e o gene de higromicina fosfotransferase (hph) (um gene marcador), no qual o promotor TDH2 e o terminador CYC1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente. Os sítios de enzima de restrição Sse8387I foram introduzidos em sítios fora da região de recombinação homóloga. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene XKS1 derivado a partir da cepa NBRC304 de S. cerevisiae e a sequência de aminoácidos de xiluloquinase codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente.
(2) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE XI
[00132] Como um vetor para introduzir o gene de xilose isomerase derivado a partir do protozoário intestinal de Reticulitermes speratus (RsXI-C1; consulte o documento sob o no. JP 2011-147445 A), o vetor pUC-R67-HOR7p-RsXI-T_TDH3-TRP1d-R45 mostrado na Figura 2 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene RsXI-C1 em que o promotor HOR7 e o terminador TDH3 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente; R45 e R67 de sequências homólogas ao gene rRNA (rDNA), as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e o gene marcador TRP1d que exibe um nível de expressão reduzido como resultado do rompimento da região de promotor. Os sítios de enzima de restrição Sse8387I foram introduzidos em sítios fora da região de recombinação homóloga. Múltiplas cópias de genes que incluem RsXI-C1 são introduzidas no locus de rDNA do cromossomo 12 com o auxílio de R45 e R67. O marcador TRP1d pode funcionar como um marcador se múltiplas cópias do mesmo forem introduzida no cromossomo. Com o uso de tal vetor, consequentemente, múltiplas cópias de genes podem ser introduzidas. O gene RsXI-C1 usado nesse exemplo foi preparado por meio da síntese total com base na sequência de nucleotídeos projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência de uso de códon da cepa de levedura. A sequência de nucleotídeos do gene RsXI-C1 projetada no presente exemplo e a sequência de aminoácidos de xilose isomerase codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.
(3) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE TAL1 E TKL1
[00133] Como um vetor para introduzir o gene de transaldolase 1 (TAL1) e o gene de transcetolase 1 (TKL1) derivados a partir de S. cerevisiae em uma cepa de levedura, o vetor pUC-LEU2U-P_HOR7- TAL1-T_TDH3-P_HOR7-TKL1-T_TDH3-HIS3-LEU2D mostrado na Figura 3 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene TAL1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae, na qual o promotor HOR7 e o terminador TDH3 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (GenBank: U19102); o gene TKL1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae, na qual o promotor HOR7 e o terminador TDH3 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (GenBank: X73224); uma região a montante de aproximadamente 500 bp a partir da terminação 3’ do gene de leucina sintetase (LEU2) e uma região a montante de aproximadamente 450 bp a partir da terminação 5’ do mesmo (LEU2D), as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e o gene de histidina sintetase (HIS3) (um gene marcador). Os sítios de enzima de restrição Sse8387I foram introduzidos em sítios fora da região de recombinação homóloga. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene TAL1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae e a sequência de aminoácidos de transaldolase 1 codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID Nos: 11 e 12, respectivamente. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene TKL1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae e a sequência de aminoácidos de transcetolase 1 codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID Nos: 13 e 14, respectivamente.
(4) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE RPE1 E RKI1 E ROMPIMENTO DE GENE GRE3
[00134] Como um vetor para introduzir o gene de ribulose fosfato epimerase 1 (RPE1) e o gene de ribose fosfato cetoisomerase (RKI1) derivados a partir de S. cerevisiae em uma cepa de levedura, o vetor pUC-GRE3U-P_HOR7-RPE1-T_TDH3-P_HOR7-RKI1-T_TDH3-LEU2- GRE3D mostrado na Figura 4 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene RPE1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae na qual o promotor HOR7 e o terminador TDH3 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (GenBank: X83571); o gene RKI1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae, na qual o promotor HOR7 e o terminador TDH3 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (GenBank: Z75003); uma região de aproximadamente 800 bp que compreende a região 3’ terminal de aproximadamente 500 bp do gene GRE3 e uma região a montante de aproximadamente 1.000 bp do gene GRE3 (GRE3D), as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga e para o rompimento do gene de aldose redutase 3 (GRE3); e o gene de leucina sintetase (LEU2) (um gene marcador). Os sítios de enzima de restrição Sse8387I foram introduzidos em sítios fora da região de recombinação homóloga. A sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene RPE1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae e a sequência de aminoácidos de ribulose fosfato epimerase 1 codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID Nos: 15 e 16, respectivamente. Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos da região de codificação do gene RKI1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae e a sequência de aminoácidos de ribose fosfato cetoisomerase codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID Nos: 17 e 18, respectivamente.
(5) VETOR PARA ROMPIMENTO DE GENE ADH2
[00135] Como um vetor para romper o gene ADH2 inerente no hospedeiro, o vetor pCR-ADH2U-URA3-ADH2D mostrado na Figura 5 foi produzido. Esse vetor compreende regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga e para o rompimento do gene de álcool desidrogenase 2 (ADH2): isto é, uma região a montante de aproximadamente 700 bp do gene ADH2 (ADH2U); uma região a jusante de aproximadamente 800 bp do gene ADH2 (ADH2D); e o gene de orotidina-5’-fosfato descarboxilase (URA3) (um gene marcador).
(6) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE ADH1
[00136] Como um vetor para introduzir o gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) em uma cepa de levedura, o vetor pCR- ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-URA3-ADH2D mostrado na Figura 6 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene ADH1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae, na qual o promotor TDH3 e o terminador ADH1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (GenBank: Z74828.1); uma região a montante de aproximadamente 450 bp a partir da terminação 3’ (ADH2part) e uma região a jusante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 3’ (ADH2D) do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; o terminador CYC1 com o terminador ADH2; e o gene URA3 (um gene marcador).
(7) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE MHPF
[00137] Como um vetor para introduzir o gene de acetaldeído desidrogenase (mhpF) derivado a partir de E. coli em uma cepa de levedura, o vetor pCR-ADH2part-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P- URA3-ADH2D mostrado na Figura 7 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de E. coli em que o promotor HOR7 e o terminador ERO1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (o gene mhpF); uma região a montante de aproximadamente 450 bp a partir da terminação 3’ (ADH2part) e uma região a jusante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 3’ (ADH2D) do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; o terminador CYC1 com o terminador ADH2; e o gene URA3 (um gene marcador). O gene mhpF usado nesse exemplo foi preparado por meio da síntese total com base na sequência de nucleotídeos projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência do uso de códon da cepa de levedura. A sequência de nucleotídeos do gene mhpF projetada no presente exemplo e a sequência de aminoácidos de acetaldeído desidrogenase codificada por tal gene são mostradas em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.
(8) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE MHPF E ADH1
[00138] Como um vetor para introduzir o gene mhpF e o gene ADH1 em uma cepa de levedura, o vetor pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3- ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D mostrado na Figura 8 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene mhpF em que o promotor HOR7 e o terminador ERO1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (igual ao (7) acima); o gene ADH1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae em que o promotor TDH3 e o terminador ADH1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (igual ao (6) acima); uma região a montante de aproximadamente 450 bp a partir da terminação 3’ (ADH2part) e uma região a jusante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 3’ (ADH2D) do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; o terminador CYC1 como o terminador ADH2; e o gene URA3 (um gene marcador).
(9) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE MHPF E ROMPIMENTO DE GENE ADH2
[00139] Como um vetor para introduzir o gene mhpF em uma cepa de levedura e para romper o gene ADH2, o vetor pCR-ADH2U-ERO1_T- mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D mostrado na Figura 9 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene mhpF em que o promotor HOR7 e o terminador ERO1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (igual ao (7) acima); uma região a montante de aproximadamente 700 bp (ADH2U) e uma região a montante de aproximadamente 800 bp (ADH2D) do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga e para o rompimento do gene ADH2; e o gene URA3 (um gene marcador).
(10) VETOR PARA INTRODUÇÃO DE GENE MHPF E ADH1 E ROMPIMENTO DE GENE ADH2
[00140] Como um vetor para introduzir os genes mhpF e ADH1 em uma cepa de levedura e para romper o gene ADH2, o vetor pCR- ADH2U-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3- ADH2D mostrado na Figura 10 foi produzido. Esse vetor compreende: o gene mhpF em que o promotor HOR7 e o terminador ERO1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (igual ao (7) acima); o gene ADH1 derivado a partir da cepa S288 de S. cerevisiae em que o promotor TDH3 e o terminador ADH1 são adicionados no lado 5’ e no lado 3’, respectivamente (igual ao (6) acima); uma região a montante de aproximadamente 700 bp (ADH2U) e uma região a montante de aproximadamente 800 bp (ADH2D) do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga e para o rompimento do gene ADH2; e o gene URA3 (um gene marcador).
(11) VETOR DE CONTROLE (GENE MARCADOR SOMENTE)
[00141] Como um vetor de controle destinado a introduzir seletivamente um gene marcador, o vetor pCR-ADH2part-T_CYC1- URA3-ADH2D mostrado na Figura 11 foi produzido. Esse vetor compreende: uma região a montante de aproximadamente 450 bp a partir da terminação 3’ (ADH2part) e uma região a jusante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 3’ (ADH2D) do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; o terminador CYC1 como o terminador ADH2; e o gene URA3 (um gene marcador).
PRODUÇÃO DE CEPAS DE LEVEDURA QUE COMPREENDEM VETORES INTRODUZIDOS NA MESMA
[00142] As cepas de levedura diploides, Saccharomyces cerevisiae OC2-T (Saitoh, S. et al., J. Ferment. Bioeng., 1996, vol. 81, páginas 98 a 103), foram selecionadas em um meio suplementado com ácido 5- fluororótico (Boeke, J. D., et al., 1987, Methods Enzymol., 154: 164 a 175.), e as cepas auxotróficas de uracil foram designadas como cepas hospedeiras.
[00143] As cepas de levedura foram transformadas com o uso da transformação de levedura Frozen-EZ II (ZYMO RESEARCH) de acordo com os protocolos incluídos no mesmo. No início, o vetor pUC-HIS3U P_HOR7-XKS1-T_TDH3-P_TDH2-hph-T_CYC1-HIS3D foi digerido com a enzima de restrição Sse8387I, as cepas de OC2-T foram transformadas com o uso do fragmento de digestão resultante, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de YPD + HYG ágar, e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como as cepas OC100. Subsequentemente, o vetor pUC-LEU2U-P_HOR7- TAL1-T_TDH3-P_HOR7-TKL1-T_TDH3-HIS3-LEU2D foi digerido com a enzima de restrição Sse8387I, as cepas OC100 foram transformadas com o uso do fragmento de digestão resultante, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar SD isento de histidina (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press), e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como as cepas OC300. Subsequentemente, o vetor pUC-GRE3U-P_HOR7-RPE1-T_TDH3- P_HOR7-RKI1-T_TDH3-LEU2-GRE3D foi digerido com a enzima de restrição Sse8387I, as cepas OC300 foram transformadas com o uso do fragmento de digestão resultante, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar SD isento de leucina, e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como as cepas OC600. Subsequentemente, o vetor pUC-R67-HOR7p-RsXI-T_TDH3-TRP1d- R45 foi digerido com a enzima de restrição Sse8387I, as cepas OC600 foram transformadas com o uso do fragmento de digestão resultante, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar SD livre de triptofano, e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como as cepas OC700. As cepas OC700 assim produzidas compreendem o gene RsXI-C1, o gene XK, o gene TAL1, o gene TKL1, o gene RPE1 e o gene RKI1 introduzidos no mesmo.
[00144] Subsequentemente, as regiões entre os sítios de recombinação homóloga dos vetores pCR-ADH2U-URA3-ADH2D, pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-URA3-ADH2D, pCR-ADH2part-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-ADH2D, pCR-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF- HOR7_P-URA3-ADH2D, pCR-ADH2U-ERO1_T-mhpF-HOR7_P- URA3-ADH2D, pCR-ADH2U-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF- HOR7_P-URA3-ADH2D e pCR-ADH2part-T_CYC1-URA3-ADH2D foram amplificadas por PCR, os fragmentos amplificados resultantes foram usados para transformar as cepas OC700, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar SD isento de uracil, e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como as cepas Uz1048, as cepas Uz1047, as cepas Uz928, as cepas Uz1012, as cepas Uz926, as cepas Uz736 e as cepas Uz1049, respectivamente.
TESTE DE FERMENTAÇÃO
[00145] Dentre as cepas Uz1048, Uz1047, Uz928, Uz1012, Uz926, Uz736 e Uz1049 obtidas da maneira descrita acima, as cepas que exibem alta capacidade de fermentação foram selecionadas e submetidas a um teste de fermentação em frascos da maneira descrita abaixo. As cepas de testes foram inoculadas em frascos com defletores de 100 ml, sendo que cada um compreende 20 ml de meio líquido de YPD (concentração de glicose: 20 g/l; concentração de extrato de levedura: 10 g/l; e concentração de peptona: 20 g/l), e a cultura foi conduzida a 30 °C e 120 rpm durante 24 horas. As cepas foram coletadas e inoculadas em frascos de 20 ml, sendo que cada um compreende 10 ml de meio D20X60YAc6 (concentração de glicose: 20 g/l; concentração de xilose: 60 g/l; concentração de extrato de levedura: 10 g/l; e concentração de ácido acético: 6 g/l) (concentração: 0,3 g de células secas/l), e o teste de fermentação foi realizado através de cultura de agitação em 80 rpm com uma amplitude de 35 mm a 30 °C. Um tampão de borracha, no qual uma agulha (i.d.: 1,5 mm) foi inserida, foi usado para tampar cada frasco, e uma válvula de verificação foi montada na ponta da agulha para manter as condições anaeróbicas no frasco.
[00146] A amostragem foi realizada 65 horas após a iniciação da fermentação, e glicose, xilose, ácido acético e etanol no licor de fermentação foram avaliados através de HPLC (LC-10A; Shimadzu Corporation) sob as condições descritas abaixo.
[00147] Coluna: Aminex HPX-87H
[00148] Fase móvel: 0,01 N de H2SO4
[00149] Taxa de fluxo: 0,6 ml/min.
[00150] Temperatura: 30 °C
[00151] Aparelho de detecção: Refratômetro de difração (RID-10A)
RESULTADOS DO TESTE DE FERMENTAÇÃO
[00152] Os resultados do teste de fermentação são mostrados na Tabela 1. TABELA 1
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[00153] Conforme é evidente a partir da Tabela 1, a taxa de assimilação de xilose e a produtividade de etanol das cepas Uz736 que exibem superexpressão de gene mhpF e ADH1 e rompimento de gene ADH2 foram aperfeiçoadas consideravelmente, em comparação com os resultados para as cepas de superexpressão de mhpF. Uma vez que as cepas de ADH2 rompido e as cepas de superexpressão de ADH1 não exibem taxas aperfeiçoadas de assimilação de xilose, a superexpressão e rompimento, conforme descrito acima, são considerados render efeitos sinérgicos. Além disso, constatou-se que a cepa Uz736 tem capacidade de assimilação de ácido acético aperfeiçoada, uma vez que a concentração de ácido acético em um meio foi reduzida a um grau significante.
EXEMPLO 2
[00154] No presente exemplo, uma cepa de levedura recombinante foi preparada através da introdução de um gene de xilose isomerase e o gene mhpF de E. coli, o gene adhE, o gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii, ou o gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii. Qualquer um ou ambos dentre um par de genes ADH2 endógenos foram rompidos em levedura recombinante preparada no presente exemplo.
PRODUÇÃO DE VETORES PARA INTRODUÇÃO DE GENE
[00155] (1) Plasmídeo para introdução de gene XI, XKS1, TKL1, TAL1, RKI1 e RPE1 e rompimento de gene GRE3
[00156] Um plasmídeo (pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1- FBA1_P-P_ADH1-RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1- P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3) foi preparado. Esse plasmídeo compreende, no locus do gene GRE3, uma sequência necessária para rompimento de gene GRE3 e introdução dos genes a seguir em levedura: um gene mutante para qual a taxa de assimilação de xilose foi aperfeiçoada como resultado da substituição de asparagina na posição de aminoácido 377 do gene de xilose isomerase derivado a partir do protozoário intestinal de Reticulitermes speratus por cisteína (XI_N337C); um gene de xiluloquinase derivado de levedura (XKS1); um gene de transcetolase 1 (TKL1) da via de pentose fosfato; um gene de transaldolase 1 (TAL1); um gene de ribulose fosfato epimerase 1 (RPE1); e um gene de ribose fosfato cetoisomerase (RKI1).
[00157] A construção do plasmídeo compreende: o gene TKL1 derivado a partir da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae, em que um promotor HOR7 é adicionado no lado 5’; o gene TAL1 em que um promotor FBA1 é adicionado; o gene RKI1, em que um promotor ADH1 é adicionado; o gene RPE1 em que um promotor TEF1 é adicionado; XI_N337C em que um promotor TDH1 e um terminador DIT1 são adicionados (preparados através da síntese total com base em uma sequência projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência do uso de códon da cepa de levedura); o gene XKS1 em que um promotor TDH3 e um terminador HIS3 são adicionados; uma sequência de genes (GRE3U) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 5’ do gene GRE3 e uma sequência de DNA (GRE3D) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 bp a partir da terminação 3’ do gene GRE3, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e uma sequência de genes (marcador G418) que compreende o gene G418, o qual é um marcador. A sequência LoxP foi introduzida em ambos os lados do gene marcador, tornando possível, assim, remover o marcador.
[00158] Além disso, cada sequência de DNA contida no plasmídeo pode ser amplificada com o uso de iniciadores listados na Tabela 2. Com a finalidade de ligar fragmentos de DNA, um plasmídeo desejado a ser obtido como um produto final foi preparado da maneira a seguir. Uma sequência de DNA foi adicionada a cada iniciador listado na Tabela 2, de modo que a sequência de DNA sobrepusesse sua sequencia de DNA adjacente por aproximadamente 15 bp. Os iniciadores foram usados para amplificar os fragmentos de DNA desejados o uso, como modelos, do genoma BY4742 de Saccharomyces cerevisiae, DNA do gene de sintetização de XI_N337C e DNA sintético da sequência LoxP. Os fragmentos de DNA foram sequencialmente ligados com o uso de um kit de clonagem In-Fusion HD (Takara Bio Inc.), ou similares, seguido da clonagem em plasmídeo pUC19. TABELA 2
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[00159] (2) Plasmídeo para introdução de gene mhpF e A DH1 e rompimento de gene ADH2
[00160] Um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) foi preparado. Esse plasmídeo compreende, no locus do gene ADH2, uma sequência necessária para rompimento de gene ADH2 e introdução do gene de acetaldeído desidrogenase (mhpF) derivado a partir de E. coli e do gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) derivado a partir da levedura em levedura.
[00161] A construção do plasmídeo compreende: o gene ADH1 derivado a partir da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae em que um promotor TDH3 é adicionado no lado 5’; o gene mhpF em que um promotor HOR7 e um terminador DIT1 são adicionados (preparados através da síntese total com base em uma sequência projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência do uso de códon da cepa de levedura); uma sequência de genes (ADH2U) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 5’ do gene ADH2 e uma sequência de DNA (ADH2D) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 bp a partir da terminação 3’ do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e uma sequência de genes (marcador URA3) que compreende o gene URA3, o qual é um marcador.
[00162] Além disso, cada sequência de DNA contida no plasmídeo pode ser amplificada com o uso de iniciadores listados na Tabela 3. Com a finalidade de ligar fragmentos de DNA, um plasmídeo desejado a ser obtido como um produto final foi preparado da maneira a seguir. Uma sequência de DNA foi adicionada a cada iniciador listado na Tabela 3, de modo que a sequência de DNA sobrepusesse sua sequencia de DNA adjacente por aproximadamente 15 bp. Os iniciadores foram usados para amplificar os fragmentos de DNA desejados o uso, como modelos, do genoma BY4742 de Saccharomyces cerevisiae ou DNA do gene de sintetização de mhpF. Os fragmentos de DNA foram sequencialmente ligados com o uso de um kit de clonagem In-Fusion HD, ou similares, seguido da clonagem em plasmídeo pUC19. TABELA 3
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[00163] (3) Plasmídeo para introdução de gene adhE e ADH1 e rompimento de gene ADH2
[00164] Um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) foi preparado. Esse plasmídeo compreende, no locus do gene ADH2, uma sequência necessária para rompimento de gene ADH2 e introdução do gene de acetaldeído desidrogenase (adhE) derivado a partir de E. coli e do gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) derivado a partir de levedura em levedura.
[00165] A construção do plasmídeo compreende: o gene ADH1 derivado a partir da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae em que um promotor TDH3 é adicionado no lado 5’; o gene adhE em que um promotor HOR7 e um terminador DIT1 são adicionados (no. de registro NCBI NP_415757.1; preparados através da síntese total com base em uma sequência projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência do uso de códon da cepa de levedura); uma sequência de genes (ADH2U) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 5’ do gene ADH2 e uma sequência de DNA (ADH2D) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 bp a partir da terminação 3’ do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e uma sequência de genes (URA3 marcador) que compreende o gene URA3, o qual é um marcador.
[00166] Além disso, cada sequência de DNA contida no plasmídeo pode ser amplificada com o uso de iniciadores listados na Tabela 4. Com a finalidade de ligar fragmentos de DNA, um plasmídeo desejado a ser obtido como um produto final foi preparado da maneira a seguir. Uma sequência de DNA foi adicionada a cada iniciador listado na Tabela 4, de modo que a sequência de DNA sobrepusesse sua sequencia de DNA adjacente por aproximadamente 15 bp. Os iniciadores foram usados para amplificar os fragmentos de DNA desejados o uso, como modelos, de um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) ou DNA do gene de sintetização de adhE. Os fragmentos de DNA foram sequencialmente ligados com o uso de um kit de clonagem In-Fusion HD, ou similares, seguido da clonagem em plasmídeo pUC19. TABELA 4
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[00167] (4) Plasmídeo para rompimento de gene ADH2 e introdução do gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii e do gene ADH1
[00168] Um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-CloADH-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) foi preparado. Esse plasmí- deo compreende, no locus do gene ADH2, uma sequência necessária para rompimento de gene ADH2 e introdução do gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii e do gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) derivado a partir de levedura em levedura.
[00169] A construção do plasmídeo compreende: o gene ADH1 derivado a partir da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae em que um promotor TDH3 é adicionado no lado 5’; o gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii em que um promotor HOR7 e um terminador DIT1 são adicionados (no. de registro NCBI YP_001310903.1; preparados através da síntese total com base em uma sequência projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência do uso de códon da cepa de levedura); uma sequência de genes (ADH2U) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 5’ do gene ADH2 e uma sequência de DNA (ADH2D) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 bp a partir da terminação 3’ do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e uma sequência de genes (marcador URA3) que compreende o gene URA3, o qual é um marcador.
[00170] Além disso, cada sequência de DNA contida no plasmídeo pode ser amplificada com o uso de iniciadores listados na Tabela 5. Com a finalidade de ligar fragmentos de DNA, um plasmídeo desejado a ser obtido como um produto final foi preparado da maneira a seguir. Uma sequência de DNA foi adicionada a cada iniciador listado na Tabela 5, de modo que a sequência de DNA sobrepusesse sua sequencia de DNA adjacente por aproximadamente 15 bp. Os iniciadores foram usados para amplificar os fragmentos de DNA desejados o uso, como modelos, de um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) ou DNA do gene que sintetiza acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Clostridium beijerinckii. Os fragmentos de DNA foram sequencialmente ligados com o uso de um kit de clonagem In-Fusion HD, ou similares, seguido da clonagem em plasmídeo pUC19. TABELA 5
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[00171] (5) Plasmídeo para rompimento de gene ADH2 e introdução do gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii e do gene ADH1
[00172] Um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-ChlaADH1-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) foi preparado. Esse plasmídeo compreende, no locus do gene ADH2, uma sequência necessária para rompimento de gene ADH2 e introdução do gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii e do gene de álcool desidrogenase 1 (ADH1) derivado a partir de levedura em levedura.
[00173] A construção do plasmídeo compreende: o gene ADH1 derivado a partir da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae em que um promotor TDH3 é adicionado no lado 5’; o gene de acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii em que um promotor HOR7 e um terminador DIT1 são adicionados (no. de registro NCBI 5729132; preparados através da síntese total com base em uma sequência projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência do uso de códon da cepa de levedura); uma sequência de genes (ADH2U) que compreende uma região a montante de aproximadamente 700 bp a partir da terminação 5’ do gene ADH2 e uma sequência de DNA (ADH2D) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 bp a partir da terminação 3’ do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e uma sequência de genes (marcador URA3) que compreende o gene URA3, o qual é um marcador.
[00174] Além disso, cada sequência de DNA contida no plasmídeo pode ser amplificada com o uso de iniciadores listados na Tabela 6. Com a finalidade de ligar fragmentos de DNA, um plasmídeo desejado a ser obtido como um produto final foi preparado da maneira a seguir. Uma sequência de DNA foi adicionada a cada iniciador listado na Tabela 6, de modo que a sequência de DNA sobrepusesse sua sequencia de DNA adjacente por aproximadamente 15 bp. Os iniciadores foram usados para amplificar os fragmentos de DNA desejados o uso, como modelos, de um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) ou DNA do gene que sintetiza acetaldeído desidrogenase derivado a partir de Chlamydomonas reinhardtii. Os fragmentos de DNA foram sequencialmente ligados com o uso de um kit de clonagem In-Fusion HD, ou similares, seguido da clonagem em plasmídeo pUC19. TABELA 6
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[00175] (6) Plasmídeo para introdução de gene mhpF
[00176] Um plasmídeo (pUC-ADH2-T_CYC1 -DIT1_T-mhpF- HOR7_P-URA3-3U_ADH2) foi preparado. Esse plasmídeo compreende, no locus do gene ADH2, uma sequência necessária para introdução do gene de acetaldeído desidrogenase (mhpF) derivado a partir de E. coli em levedura nas proximidades do locus do gene ADH2, sem o rompimento do gene ADH2.
[00177] A construção do plasmídeo compreende: o gene mhpF derivado a partir da cepa BY4742 de Saccharomyces cerevisiae em que um promotor HOR7 e um terminador DIT1 são adicionados no lado 5’ (preparados através da síntese total com base em uma sequência projetada pela alteração de códons sobre toda a região, de acordo com a frequência do uso de códon da cepa de levedura); o gene ADH2 e uma sequência de DNA (ADH2D) que compreende uma região a jusante de aproximadamente 800 bp a partir da terminação 3’ do gene ADH2, as quais são regiões a serem integradas no genoma de levedura através da recombinação homóloga; e uma sequência de genes (marcador URA3) que compreende o gene URA3, o qual é um marcador.
[00178] Além disso, cada sequência de DNA contida no plasmídeo pode ser amplificada com o uso de iniciadores listados na Tabela 7. Com a finalidade de ligar fragmentos de DNA, um plasmídeo desejado a ser obtido como um produto final foi preparado da maneira a seguir. Uma sequência de DNA foi adicionada a cada iniciador listado na Tabela 7, de modo que a sequência de DNA sobrepusesse sua sequencia de DNA adjacente por aproximadamente 15 bp. Os iniciadores foram usados para amplificar os fragmentos de DNA desejados o uso, como modelos, de um plasmídeo (pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2) ou genoma BY4742 de Saccharomyces cerevisiae. Os fragmentos de DNA foram sequencialmente ligados com o uso de um kit de clonagem In-Fusion HD, ou similares, seguido da clonagem em plasmídeo pUC19. TABELA 7
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<PRODUÇÃO DE CEPAS DE LEVEDURA QUE COMPREENDEM VETORES INTRODUZIDOS NA MESMA>
[00179] A cepa de levedura diploide, a qual é a cepa OC2 de Saccharomyces cerevisiae (NBRC2260), foi selecionada em um meio suplementado com ácido 5-fluororótico (Boeke, J. D., et al., 1987, Methods Enzymol., 154: 164 a 175.), e uma cepa auxotrófica de uracil (OC2U) foi designada como uma cepa hospedeira. A cepa de levedura foi transformada com o uso da transformação de levedura Frozen-EZ II (ZYMO RESEARCH) de acordo com os protocolos incluídos no mesmo.
[00180] O sítio de recombinação homóloga do plasmídeo preparado em (1) acima (pUC-5U_GRE3-P_HOR7-TKL1-TAL1-FBA1_P-P_ADH1- RPE1-RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1-P_TDH3-XKS1- T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3) foi amplificado por PCR, os fragmentos amplificados resultantes foram usados para transformar a cepa OC2U, os transformantes resultantes foram aplicados ao meio de ágar YPD contendo G418, e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. A cepa de elite aclimatada foi designada como a cepa Uz1252. Essa cepa foi aplicada ao meio de esporulação (1% de fosfato de potássio, 0,1% de extrato de levedura, 0,05% de glicose e 2% ágar) para esporulação, e um diploide da cepa foi formado utilizando-se homotalismo. A cepa em que os genes mutantes XI, TKL1, TAL1, RPE1, RKI1 e XKS1 foram incorporados na região do locus do gene GRE3 de um cromossomo diploide, e desse modo, resultando no rompimento do gene GRE3, foi obtida. A cepa resultante foi designada como a cepa Uz1252-3.
[00181] Subsequentemente, as regiões entre sítios de recombinação homóloga para os plasmídeos pUC-5U_ADH2-P_TDH3- ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2 preparados em (2) acima, pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE- HOR7_P-URA3-3U_ADH2 preparado em (3) acima, pUC-5U_ADH2- P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-CloADH-HOR7_P-URA3-3U_ADH2 preparado em (4) acima, pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1- DIT1_T-ChlaADH1-HOR7_P-URA3-3U_ADH2 preparado em (5) acima e pUC-ADH2-T_CYC1 -DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2 preparado em (6) acima foram amplificados por PCR, os fragmentos amplificados resultantes foram usados para transformar a cepa Uz1252- 3, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar SD isento de uracil, e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. As cepas de elite aclimatadas foram designadas como a cepa Uz1317, a cepa Uz1298, a cepa Uz1296, a cepa Uz1330 e a cepa Uz1320.
[00182] A recombinação de heterozigoto (1 cópia) foi observada em todas as cepas acima. A esporulação foi induzida em meio de esporulação para a cepa Uz1317, a cepa Uz1298 e a cepa Uz1296 obtidas. As cepas obtidas através da formação de diploide utilizando-se homotalismo foram designadas como a cepa Uz1319, a cepa Uz1318 e a cepa Uz1311.
[00183] Como um controle, o gene de uracil foi amplificado por PCR com o uso do genoma OC2 como um modelo, os fragmentos amplificados resultantes foram usados para transformar a cepa OC2U, os transformantes resultantes foram aplicados a um meio de ágar SD isento de uracil, e as colônias desenvolvidas foram, então, submetidas à aclimatação. A cepa obtida foi designada como a cepa Uz1313. A esporulação foi induzida no meio de esporulação para a cepa Uz1313 obtida. A cepa foi submetida à formação de diploide utilizando-se homotalismo. A cepa resultante foi designada como a cepa Uz1323.
[00184] A Tabela 8 resume os genótipos das cepas preparadas nos exemplos. TABELA 8
Figure img0013
Figure img0014
TESTE DE FERMENTAÇÃO
[00185] Dentre as cepas obtidas da maneira descrita acima, duas cepas que exibem alta capacidade de fermentação foram selecionadas e submetidas a um teste de fermentação em frascos da maneira descrita abaixo. As cepas de teste foram inoculadas em frascos com defletores de 100 ml, sendo que cada um compreende 20 ml de meio líquido de YPD (concentração de extrato de levedura: 10 g/l; concentração de peptona: 20 g/l; e concentração de glicose: 20 g/l), e a cultura foi conduzida a 30 °C e 120 rpm durante 24 horas. As cepas foram coletadas e inoculadas em frascos de 10 ml, sendo que cada um compreende 8 ml de meio D60X80YPAc4 (concentração de glicose: 60 g/l; concentração de xilose: 80 g/l; concentração de extrato de levedura: 10 g/l; concentração de peptona: 20 g/l; e concentração de ácido acético: 4 g/l) ou meio D40X80YPAc2 (concentração de glicose: 40 g/l; concentração de xilose: 80 g/l; concentração de extrato de levedura: 10 g/l; concentração de peptona: 20 g/l; e concentração de ácido acético: 2 g/l), e o teste de fermentação foi realizado através de cultura de agitação em 80 rpm com uma amplitude de 35 mm a 30 °C. Um tampão de borracha, no qual uma agulha (i.d.: 1,5 mm) foi inserida, foi usado para tampar cada frasco, e uma válvula de verificação foi montada na ponta da agulha para manter as condições anaeróbicas no frasco.
[00186] Glicose, xilose, ácido acético e etanol no licor de fermentação foram avaliados através de HPLC (LC-10A; Shimadzu Corporation) sob as condições descritas abaixo.
[00187] Coluna: Aminex HPX-87H
[00188] Fase móvel: 0,01 N de H2SO4
[00189] Taxa de fluxo: 0,6 ml/min.
[00190] Temperatura: 30 °C
[00191] Aparelho de detecção: Refratômetro de diferencial (RID-10A)
RESULTADOS DO TESTE DE FERMENTAÇÃO
[00192] As Tabelas 9 e 10 mostram os resultados do teste de fermentação (concentração de levedura preparada: 0,3 g de células secas/l) para qual o meio D60X80YPAc4 foi usado e o tempo de fermentação foi ajustado para 66 horas. As Tabelas 9 e 10 mostram os valores médios de dados para as três cepas recombinantes, as quais foram independentemente obtidas. TABELA 9
Figure img0015
TABELA 10
Figure img0016
[00193] As Tabelas 11 e 12 mostram os resultados do teste de fermentação (concentração de levedura preparada: 0,24 g de células secas/l) para qual o meio D40X80YPAc2 foi usado e o tempo de fermentação foi ajustado para 42 horas. Além disso, a Tabela 13 mostra os resultados do teste de fermentação (concentração de levedura preparada: 0,3 g de células secas/l) para qual o meio D40X80YPAc2 foi usado e o tempo de fermentação foi ajustado para 42 horas para a cepa obtida através da introdução heterozigota. As Tabelas 11 a 13 mostram os valores médios dos dados para as três cepas recombinantes, as quais foram independentemente obtidas. TABELA 11
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TABELA 12
Figure img0018
TABELA 13
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[00194] Conforme é compreendido a partir das Tabelas 9 a 13, a taxa de assimilação de xilose aumentou significativamente, enquanto que a quantidade de ácido acético diminui obviamente para cada cepa, em que ADH2 foi rompido de maneira heterozigota ou homozigota, e p qual superexpressou ADH1 e qualquer uma dentre as três formas de acetaldeído desidrogenase, em comparação com o controle. Como resultado, a produtividade de etanol foi aperfeiçoada. Além disso, a quantidade de ácido acético na cepa obtida através de introdução homozigota do gene ADH2 diminui a uma extensão maior do que na cepa obtida através de introdução heterozigota do gene ADH2. Entretanto, no caso da cepa que expressou mhpF de acetaldeído desidrogenase sozinho, a taxa de assimilação de xilose diminuiu, enquanto que a quantidade de ácido acético não diminuiu substancialmente, resultando em nenhum aperfeiçoamento na produtividade de etanol.
[00195] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente documento estão incorporados ao presente documento a título de referência, em suas totalidades.

Claims (5)

1. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de que compreende etapas de cultura de Saccharomyces cerevisiae recombinante compreendendo um gene de xilose isomerase e um gene de acetaldeído desidrogenase introduzidos na mesma em um meio contendo xilose para realizar a fermentação de etanol, em que o Saccharomyces cerevisiae recombinante permite a expressão de alto nível do gene da álcool desidrogenase com atividade de conversão de acetaldeído em etanol e mostra um nível de expressão reduzido do gene da álcool desidrogenase com atividade de conversão de etanol em acetaldeído, em que o gene da xilose isomerase consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, ou sequência nucleotídica degenerada da mesma, que codifica a mesma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 4 e em que o gene da acetaldeído desidrogenase consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 19, 21 ou 23, ou sequência nucleotídica degenerada da mesma, que codifica a mesma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 2, 20, 22 ou 24.
2. Método para produzir etanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Saccharomyces cerevisiae recombinante compreende ainda o gene da xilulocinase introduzido na mesma.
3. Método para produzir etanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Saccharomyces cerevisiae recombinante compreende um gene que codifica uma enzima selecionada do grupo de enzimas que constituem um processo não oxidativo na via da pentose fosfato.
4. Método para produzir etanol, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o grupo de enzimas que constituem um processo não oxidativo na via da pentose fosfato inclui ribose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato-3-epimerase, transcetolase e transaldolase.
5. Método para produzir etanol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio contém celulose e a fermentação do etanol ocorre simultaneamente com a sacarificação por pelo menos a celulose.
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