BR112021012497A2 - Levedura recombinante e método para produzir etanol usando a mesma - Google Patents

Levedura recombinante e método para produzir etanol usando a mesma Download PDF

Info

Publication number
BR112021012497A2
BR112021012497A2 BR112021012497-7A BR112021012497A BR112021012497A2 BR 112021012497 A2 BR112021012497 A2 BR 112021012497A2 BR 112021012497 A BR112021012497 A BR 112021012497A BR 112021012497 A2 BR112021012497 A2 BR 112021012497A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
gene
seq
arabinose
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
BR112021012497-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Rie Hirao
Nobuki Tada
Toru Onishi
Original Assignee
Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha filed Critical Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
Publication of BR112021012497A2 publication Critical patent/BR112021012497A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01004—L-Arabinose isomerase (5.3.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01016—Ribulokinase (2.7.1.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03004—L-Ribulose-5-phosphate 4-epimerase (5.1.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

levedura recombinante e método para produzir etanol usando a mesma. são fornecidos genes metabólicos de l-arabinose excelentes que funcionam em leveduras. é fornecido um cluster do gene metabólico de l-arabinose incluindo um gene l-arabinose isomerase especificado por uma seq id predeterminada, um gene l-ribuloquinase especificado por uma seq id predeterminada e um gene l-ribulose-5-fosfato-4-epimerase especificado por uma seq id predeterminada.

Description

“LEVEDURA RECOMBINANTE E MÉTODO PARA PRODUZIR ETANOL USANDO A MESMA”
FUNDAMENTOS Campo Técnico
[001] A presente divulgação se refere a uma levedura recombinante tendo capacidade de fermentação de etanol e um método para produzir etanol usando a levedura. Fundamentos da Técnica
[002] A biomassa celulósica é eficazmente usada como uma matéria-prima para os álcoois úteis, tais como etanol e ácidos orgânicos. De modo a aumentar a quantidade de etanol a ser produzido na produção de etanol usando biomassa celulósica, foram desenvolvidas cepas de leveduras que podem usar pentose, tal como D-xilose e L-arabinose como substratos. Por exemplo, uma cepa de levedura tendo a capacidade de metabolizar L-arabinose pode ser construída introduzindo um grupo de genes envolvidos no metabolismo de L-arabinose na levedura. Exemplos dos genes metabólicos de L-arabinose a serem introduzidos na levedura podem incluir araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-fosfato-4- epimerase) procarióticas. Além disso, os exemplos dos genes metabólicos de L- arabinose podem incluir LXR (L-xilulose redutase) e LAD (L-L-arabinitol 4- desidrogenase) eucarióticas.
[003] A Literatura Não Patente 1 divulga uma técnica para produzir etanol a partir de L-arabinose introduzindo genes metabólicos de L-arabinose em uma levedura. Em particular, a Literatura Não Patente 1 aponta que o equilíbrio de coenzimas nas vias metabólicas de D-xilose e L-arabinose é deficiente em leveduras recombinantes em que genes metabólicos de L-arabinose eucariótica são introduzidos, e a eficiência de conversão da L-arabinose em etanol é deficiente em comparação com leveduras recombinantes em que genes metabólicos de L-arabinose procariótica são introduzidos.
[004] Além disso, a Literatura Não Patente 2 divulga uma levedura recombinante em que o gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli são introduzidos como genes metabólicos de L-arabinose, e a galactose permease endógena (gene GAL2) é superexpressada. O etanol pode ser produzido usando a levedura recombinante divulgada na Literatura Não Patente 2 para assimilar a L-arabinose. É conhecido que a galactose permease codificada por um gene GAL2 está envolvida no transporte de L-arabinose.
[005] Além disso, a Literatura de Patente 1 divulga que, em uma levedura recombinante em que genes metabólicos de L-arabinose procariótica são introduzidos, o crescimento em um meio contendo L-arabinose é excelente, particularmente, no caso onde o gene araA é derivado de Bacillus licheniformis ou Clostridium acelobulylicum. Além disso, a Literatura de Patente 1 divulga que o crescimento no meio contendo L-arabinose é superior no caso onde as sequências nucleotídicas de pelo menos dois ou mais dos genes araA, araB e araD são otimizados para os códons de Saccharomyces cerevisiae.
[006] Além do mais, a Literatura Não Patente 3 divulga uma levedura recombinante (Saccharomyces cerevisiae recombinante) em que os genes araA, araB e araD derivados de Lactobacilo plantarum são introduzidos. De acordo com a Literatura Não Patente 3, a levedura recombinante assimila a L-arabinose e produz etanol em um meio contendo L-arabinose como uma única fonte de carbono ou um meio contendo um açúcar misto contendo L-arabinose como uma fonte de carbono sob condições anaeróbicas.
[007] Além disso, a Literatura de Patente 2 divulga uma levedura recombinante em que os genes araA, araB e araD derivados de Bacteroides thetaiotamicron são introduzidos. A levedura recombinante divulgada na Literatura de Patente 2 assimila a L-arabinose e produz etanol. Além disso, a Literatura de Patente
3 divulga uma levedura recombinante em que os genes araA, araB e araD derivados de Arthrobacter aurescens, genes araA, araB e araD derivados de Clavibacter michiganensis ou genes araA, araB e araD derivados de Gramella forsetii são introduzidos. [Lista de Citação] [Literatura de Patente] [Literatura de Patente 1] US 8.753.862 B2 [Literatura de Patente 2] US 9.598.689 B2 [Literatura de Patente 3] US 2010/0304454 A1 [Literatura Não Patente] [Literatura Não Patente 1] P. Richard et al., FEMS Levedura Research 3 (2003): 185-189 [Literatura Não Patente] Becker J, et al., Appl. Environ. Microbiol. (2003) Jul; 69(7): 4144-4150 [Literatura Não Patente] Wisselink, H. W. et al., Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73: 4881-4891
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Objetivos a Serem Alcançados pela Invenção
[008] Entretanto, as descobertas sobre os genes metabólicos de L-arabinose que funcionam em leveduras não são suficientes e o desenvolvimento de um gene metabólico de L-arabinose excelente tem sido necessária. Em vista da real situação descrita acima, a presente divulgação fornece uma levedura recombinante que adquiriu a capacidade de metabolizar arabinose descobrindo um gene metabólico de L-arabinose excelente que funciona, particularmente, em leveduras e introduzindo o gene metabólico de L-arabinose, e fornece ainda um método para produzir etanol usando a levedura recombinante. Meios para Alcançar os Objetivos
[009] Como um resultado de estudos diligentes, de modo a fornecer a levedura recombinante e o método descrito acima, os inventores descobriram um novo gene metabólico de L-arabinose que funciona em leveduras, consumando assim a presente divulgação.
[010] A presente divulgação inclui os seguintes aspectos. (1) Uma levedura recombinante compreendendo um grupo de genes metabólicos de L-arabinose incluindo um gene L-arabinose isomerase, um gene L- ribuloquinase e um gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase introduzido na mesma, em que o gene L-arabinose isomerase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6 e tendo atividade de L-arabinose isomerase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 sob condições rigorosas e tendo atividade de L-arabinose isomerase. (2) Uma levedura recombinante compreendendo um grupo de genes metabólicos de L-arabinose incluindo um gene L-arabinose isomerase, um gene L- ribuloquinase e um gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase introduzido na mesma, em que o gene L-ribuloquinase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 e 16;
(b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 e 16 e tendo atividade de L-ribuloquinase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13 e 15 sob condições rigorosas e tendo atividade de L-ribuloquinase. (3) Uma levedura recombinante compreendendo um grupo de gene metabólico de L-arabinose incluindo um gene L-arabinose isomerase, um gene L- ribuloquinase e um gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase introduzido na mesma, em que o gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 20 e 22; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 20 e 22 e tendo atividade de L-ribulose-5-fosfato- 4-epimerase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 17, 19 e 21 sob condições rigorosas e tendo atividade de L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase. (4) A levedura recombinante de acordo com qualquer um de (1) a (3), que superexpressa um gene galactose permease. (5) A levedura recombinante de acordo com (4), em que o gene galactose permease é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo:
(a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e tendo atividade de galactose permease; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar à sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 23 sob condições rigorosas e tendo atividade de galactose permease. (6) A levedura recombinante de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que um gene xilose isomerase é introduzido. (7) A levedura recombinante de acordo com (6), em que o gene xilose isomerase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 e tendo atividade de xilose isomerase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar à sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 25 sob condições rigorosas e tendo atividade de xilose isomerase. (8) Um método para produzir etanol, compreendendo uma etapa de cultivar a levedura recombinante de acordo com qualquer um de (1) a (7) em um meio compreendendo arabinose para a fermentação de etanol. (9) O método para produzir etanol de acordo com (8), em que o meio compreende celulose, e pelo menos a sacarificação da celulose prossegue simultaneamente com a fermentação de etanol.
[011] O presente relatório descritivo inclui a divulgação do Pedido de Patente
Japonesa No 2018-241823, com base no qual o presente pedido reivindica a prioridade. Efeitos da Invenção
[012] Tendo a capacidade de metabolizar L-arabinose, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser usada para a produção de etanol usando um meio compreendendo L-arabinose.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[013] A seguir, a presente divulgação será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos.
[014] A levedura recombinante de acordo com a presente divulgação é uma levedura que adquiriu a capacidade de metabolizar arabinose introduzindo um grupo de gene metabólico de L-arabinose incluindo um gene L-arabinose isomerase (gene araA), um gene L-ribuloquinase (gene araB) e um gene L-ribulose-5-fosfato-4- epimerase (gene araD). Na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação, pelo menos um dos genes araA, araB e araD tem a seguinte característica. Por exemplo, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ter o gene araA descrito abaixo e os genes araB e araD convencionalmente conhecidos. Além disso, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ter o gene araB descrito abaixo e os genes araA e araD convencionalmente conhecidos, por exemplo. A levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ter o gene araD descrito abaixo e os genes araA e araB convencionalmente conhecidos. Alternativamente, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ter pelo menos dois dos genes araA, araB e araD descritos abaixo, e o restante pode ser um gene convencionalmente conhecido. Além disso, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ter os genes araA, araB e araD descritos abaixo. <Gene araA>
[015] O gene L-arabinose isomerase aqui descrito é um gene selecionado do grupo que consiste no gene araA de Bacillus licheniformis (Número de Acesso NCBI: WP_011198012), o gene araA de Selenomonas ruminantium (Número de Acesso NCBI: WP_072306024) e o gene araA de Lactobacilo sakei (Número de Acesso NCBI: WP_011375537). Esses genes araA podem transmitir a capacidade de metabolizar arabinose para as leveduras sendo introduzidos em leveduras junto com os genes araB e araD.
[016] Entretanto, o gene L-arabinose isomerase usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser um gene que tem uma relação paráloga ou relação homóloga em um sentido restrito a tal gene araA.
[017] Aqui, as sequências de aminoácidos de L-arabinose isomerase codificadas pelo gene araA de Bacillus licheniformis, o gene araA de Selenomonas ruminantium e o gene araA de Lactobacilo sakei são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6. Além disso, as sequências nucleotídicas das regiões do gene araA de Bacillus licheniformis, o gene araA de Selenomonas ruminantium e o gene araA de Lactobacilo sakei que codificam a proteína L-arabinose isomerase são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 1, 3 e 5.
[018] Além disso, o gene L-arabinose isomerase usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação não é limitado àqueles que codificam as sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs e podem ser aqueles que codificam uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais, 85 % ou mais em algumas modalidades, 90 % ou mais em outras modalidades, 95 % ou mais ainda em outras modalidades, ou 97 % ou mais em algumas outras modalidades, com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6 e tendo atividade de L- arabinose isomerase.
[019] Os valores de identidade podem ser calculados pelos programas
BLASTN ou BLASTX que implementam o algoritmo BLAST (configuração padrão). Os valores de identidade são calculados como uma razão do número de resíduos de aminoácido que correspondem completamente uns aos outros quando um par de sequências de aminoácidos é analisado por alinhamento de pares com os resíduos de aminoácido totais comparados.
[020] Além disso, o gene L-arabinose isomerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 1 a 6 e pode ser, por exemplo, aquele que codifica uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 4 ou 6 pela substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos, e tendo atividade de L-arabinose isomerase. O número referido como vários aqui significa 2 a 50, 2 a 30 em algumas modalidades, 2 a 15 em outras modalidades, ou 2 a 7 em algumas outras modalidades, por exemplo.
[021] Além do mais, o gene L-arabinose isomerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 1 a 6 e pode ser aquele que hibridiza com o todo ou uma parte da fita complementar de DNA que consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 sob condições rigorosas e que codifica uma proteína tendo atividade de L-arabinose isomerase, por exemplo. O termo “condições rigorosas” aqui significa condições em que os assim chamados híbridos específicos são formados e híbridos não específicos não são formados. As condições podem ser apropriadamente determinadas com referência a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), por exemplo. Especificamente, a estringência pode ser determinada pela temperatura e a concentração de sal contida na solução na hibridização de Southern, e a temperatura e a concentração de sal contida na solução na etapa de lavagem da hibridização de Southern. Mais especificamente, as condições rigorosas, por exemplo, são uma concentração de sódio de 25 a 500 mM ou 25 a 300 mM em algumas modalidades e uma temperatura de 42 a 68 °C ou 42 a 65 °C em algumas modalidades. Mais especificamente, as condições rigorosas são 5 x SSC (83 mM de
NaCl, 83 mM de citrato de sódio) e uma temperatura de 42 °C.
[022] Como descrito acima, se um gene que consiste em uma sequência nucleotídica diferente da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos diferente da SEQ ID NO: 2, 4 ou 6 funciona como um gene L-arabinose isomerase pode ser determinado produzindo um vetor de expressão tendo tal gene incorporado em um sítio entre um promotor adequado e um terminador adequado ou semelhantes, transformando um hospedeiro, tal como Escherichia coli, usando o vetor de expressão, e medindo a atividade de L-arabinose isomerase de uma proteína expressada. A atividade de L-arabinose isomerase é a atividade para catalisar uma reação para produzir L-ribulose usando L-arabinose como um substrato. Consequentemente, a atividade de L-arabinose isomerase pode ser avaliada com base na diminuição de L-arabinose como um substrato e/ou no incremento de L- ribulose como um produto, por exemplo. <Gene araB>
[023] O gene L-ribuloquinase aqui descrito é um gene selecionado do grupo que consiste no gene araB de Thermoactinomyces sp. (Número de Acesso NCBI: WP_049720024), o gene araB de Clostridium nexile (Número de Acesso NCBI: CDC22812), o gene araB de Selenomonas sp. oral taxon (Número de Acesso NCBI: WP_050342034), o gene araB de Paenibacillus sp. (Número de Acesso NCBI: WP_039877980) e o gene araB de Megasphaera cerevisiae (Número de Acesso NCBI: WP_048515518). Esses genes araB podem transmitir a capacidade de metabolizar a arabinose para as leveduras sendo introduzidos nas leveduras junto com os genes araA e araD.
[024] Entretanto, o gene L-ribuloquinase usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser um gene que tem uma relação paráloga ou relação homóloga em um sentido restrito a tal gene araB.
[025] Aqui, as sequências de aminoácidos de L-ribuloquinase codificadas pelo gene araB de Thermoactinomyces sp., o gene araB de Clostridium nexile, o gene araB de Selenomonas sp. oral taxon, o gene araB de Paenibacillus sp. e o gene araB de Megasphaera cerevisiae são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 e 16. Além disso, as sequências nucleotídicas das regiões do gene araB de Thermoactinomyces sp., o gene araB de Clostridium nexile, o gene araB de Selenomonas sp. oral taxon, o gene araB de Paenibacillus sp. e o gene araB de Megasphaera cerevisiae que codifica a proteína L-ribuloquinase são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13 e 15.
[026] Além disso, o gene L-ribuloquinase usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação não é limitado àqueles que codificam as sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs e podem ser aqueles que codificam uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais, 85 % ou mais em algumas modalidades, 90 % ou mais em outras modalidades, 95 % ou mais ainda em outras modalidades, ou 97 % ou mais em algumas outras modalidades, com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 e 16 e tendo atividade de L- ribuloquinase.
[027] Os valores de identidade podem ser calculados pelos programas BLASTN ou BLASTX que implementam o algoritmo BLAST (configuração padrão). Os valores de identidade são calculados como uma razão do número de resíduos de aminoácido que correspondem completamente uns aos outros quando um par de sequências de aminoácidos é analisado por alinhamento de pares com os resíduos de aminoácido totais comparados.
[028] Além disso, o gene L-ribuloquinase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 7 a 16 e podem ser aqueles que codificam uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos derivado das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 e 16 pela substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos, e tendo atividade de L-ribuloquinase, por exemplo. O número referido como vários aqui é, por exemplo, 2 a 50, 2 a 30 em algumas modalidades, 2 a 15 em outras modalidades, ou 2 a 7 em algumas outras modalidades.
[029] Além do mais, o gene L-ribuloquinase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 7 a 16 e pode ser aquele que hibridiza com o todo ou uma parte da fita complementar de DNA que consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13 e 15 sob condições rigorosas e que codifica uma proteína tendo atividade de L-ribuloquinase, por exemplo. O termo “condições rigorosas” aqui significa condições em que os assim chamados híbridos específicos são formados, e híbridos não específicos não são formados. As condições podem ser apropriadamente determinadas com referência a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), por exemplo. Especificamente, a estringência pode ser determinada pela temperatura e a concentração de sal contida na solução na hibridização de Southern, e a temperatura e a concentração de sal contida na solução na etapa de lavagem da hibridização de Southern. Mais especificamente, as condições rigorosas, por exemplo, são uma concentração de sódio de 25 a 500 mM ou 25 a 300 mM em algumas modalidades e uma temperatura de 42 a 68 °C ou 42 a 65 °C em algumas modalidades. Mais especificamente, as condições rigorosas são 5 x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio) e uma temperatura de 42 °C.
[030] Como descrito acima, se um gene que consiste em uma sequência nucleotídica diferente da SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13 e 15, ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos diferente da SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14 e 16 funciona como um gene L-ribuloquinase pode ser determinado produzindo um vetor de expressão com tal gene incorporado em um sítio entre um promotor adequado e um terminador adequado ou semelhantes, transformando um hospedeiro, tal como Escherichia coli usando o vetor de expressão, e medindo a atividade de L-ribuloquinase de uma proteína expressada. A atividade de L-ribuloquinase é a atividade para catalisar uma reação para produzir ADP e L-ribulose-5-fosfato usando ATP e L-ribulose como substratos. Consequentemente, a atividade de L-ribuloquinase pode ser avaliada, por exemplo, com base na diminuição de ATP ou L-ribulose como um substrato e/ou no incremento de ADP ou L-ribulose-5-fosfato como um produto. <Gene araD>
[031] O gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase aqui descrito é um gene selecionado do grupo que consiste no gene araD de Bacillus licheniformis (Número de Acesso NCBI: WP_003182291), o gene araD de Alkalibacterium putridalgicola (Número de Acesso NCBI: WP_091486828) e o gene araD de Carnobacterium sp. 17- 4 (Número de Acesso NCBI: WP_013709965). Esses genes araD podem transmitir a capacidade de metabolizar a arabinose para as leveduras sendo introduzidos nas leveduras junto com os genes araA e araB.
[032] Entretanto, o gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser um gene que tem uma relação paráloga ou relação homóloga em um sentido restrito a tal gene araD.
[033] As sequências de aminoácidos de L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase codificadas pelo gene araD de Bacillus licheniformis, o gene araD de Alkalibacterium putridalgicola e o gene araD de Carnobacterium sp. 17-4 são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 18, 20 e 22. Além disso, as sequências nucleotídicas das regiões do gene araD de Bacillus licheniformis, o gene araD de Alkalibacterium putridalgicola e o gene araD de Carnobacterium sp. 17-4 que codifica L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase proteína são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 17, 19 e 21.
[034] Além disso, o gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação não é limitado àqueles que codificam as sequências de aminoácidos definidas pelas SEQ ID NOs e podem ser aqueles que codificam uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais, 85 % ou mais em algumas modalidades, 90 % ou mais em outras modalidades, 95 % ou mais ainda em outras modalidades, ou 97 % ou mais em algumas outras modalidades, com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 20 e 22, e tendo atividade de L-ribulose-5- fosfato-4-epimerase.
[035] Os valores de identidade podem ser calculados pelos programas BLASTN ou BLASTX que implementam o algoritmo BLAST (configuração padrão). Os valores de identidade são calculados como uma razão do número de resíduos de aminoácido que correspondem completamente uns aos outros quando um par de sequências de aminoácidos é analisado por alinhamento de pares com os resíduos de aminoácido totais comparados.
[036] Além disso, o gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 17 a 22 e podem ser aqueles que codificam uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos derivado das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 18, 20 e 22 pela substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos, e tendo atividade de L-ribulose-5-fosfato-4- epimerase, por exemplo. O número referido como vários aqui é, por exemplo, 2 a 50, 2 a 30 em algumas modalidades, 2 a 15 em outras modalidades, ou 2 a 7 em algumas outras modalidades.
[037] Além do mais, o gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 17 a 22 e pode ser aquele que hibridiza com o todo ou uma parte da fita complementar de DNA que consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID NOs: 17, 19 e 21 sob condições rigorosas e que codifica uma proteína tendo atividade de L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase, por exemplo. O termo “condições rigorosas” aqui significa condições em que os assim chamados híbridos específicos são formados, e híbridos não específicos não são formados. As condições podem ser apropriadamente determinadas com referência a Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Terceira Edição), por exemplo. Especificamente, a estringência pode ser determinada pela temperatura e a concentração de sal contida na solução na hibridização de Southern, e a temperatura e a concentração de sal contida na solução na etapa de lavagem da hibridização de Southern. Mais especificamente, as condições rigorosas, por exemplo, são uma concentração de sódio de 25 a 500 mM ou 25 a 300 mM em algumas modalidades e uma temperatura de 42 a 68 °C ou 42 a 65 °C em algumas modalidades. Mais especificamente, as condições rigorosas são 5 x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio) e uma temperatura de 42 °C.
[038] Como descrito acima, se um gene que consiste em uma sequência nucleotídica diferente da SEQ ID NOs: 17, 19 e 21 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos diferente da SEQ ID NOs: 18, 20 e 22 funciona como um gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase pode ser determinado produzindo um vetor de expressão com tal gene incorporado em um sítio entre um promotor adequado e um terminador adequado ou semelhantes, transformando um hospedeiro, tal como Escherichia coli usando o vetor de expressão, e medindo a atividade de L-ribulose-5- fosfato-4-epimerase de uma proteína expressada. A atividade de L-ribulose-5-fosfato- 4-epimerase é a atividade para catalisar uma reação para produzir D-xilulose-5-fosfato usando L-ribulose-5-fosfato como um substrato. Consequentemente, a atividade de L- ribulose-5-fosfato-4-epimerase pode ser avaliada com base na diminuição de L- ribulose-5-fosfato como um substrato e/ou no incremento de D-xilulose-5-fosfato como um produto, por exemplo. <Gene galactose permease>
[039] A levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser aquela com o gene galactose permease introduzido de modo a superexpressar, além do gene relacionado ao metabolismo da L-arabinose descrito acima. O gene galactose permease codifica uma proteína que funciona como um transportador de arabinose. Consequentemente, a superexpressão de gene galactose permease pode melhorar a capacidade de incorporar a arabinose na levedura recombinante.
[040] O termo “superexpressão de gene galactose permease” significa que o nível de expressão do gene é feito maior que em uma levedura tipo selvagem introduzindo um vetor de expressão capaz de expressar o gene ou substituindo um promotor do gene da galactose permease endógena por um promotor para alta expressão. Alternativamente, o termo “superexpressão de gene galactose permease” significa incluir a introdução de um gene exógeno da galactose permease sob o controle de um promotor capaz de induzir a expressão em uma levedura.
[041] O gene galactose permease de Saccharomyces cerevisiae é conhecido como um gene GAL2. A sequência nucleotídica do gene GAL2 de Saccharomyces cerevisiae e a sequência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene GAL2 são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 23 e 24.
[042] Entretanto, o gene galactose permease usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser um gene que tem uma relação paráloga ou relação homóloga em um sentido restrito ao gene GAL2.
[043] Além disso, o gene galactose permease usado na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação não é limitado àqueles tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e podem ser aqueles que codificam uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80 % ou mais, 85 % ou mais em algumas modalidades, 90 % ou mais em outras modalidades, 95 % ou mais ainda em outras modalidades, ou 97 % ou mais em algumas outras modalidades, com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, e tendo atividade de galactose permease.
[044] Os valores de identidade podem ser calculados pelos programas BLASTN ou BLASTX que implementam o algoritmo BLAST (configuração padrão). Os valores de identidade são calculados como uma razão do número de resíduos de aminoácido que correspondem completamente uns aos outros quando um par de sequências de aminoácidos é analisado por alinhamento de pares com os resíduos de aminoácido totais comparados.
[045] Além disso, o gene galactose permease não é limitado àquele especificado pela SEQ ID NO: 24 e podem ser aqueles que codificam uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 pela substituição, deleção, inserção ou adição ou um ou vários aminoácidos, e tendo atividade de galactose permease, por exemplo. O número referido como vários aqui é, por exemplo, 2 a 50, 2 a 30 em algumas modalidades, 2 a 15 em outras modalidades, ou 2 a 7 em algumas outras modalidades.
[046] Além do mais, o gene galactose permease não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 23 e 24 e pode ser aquele que hibridiza com o todo ou uma parte da fita complementar de DNA que consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 23 sob condições rigorosas e que codifica uma proteína tendo atividade de galactose permease, por exemplo. O termo “condições rigorosas” aqui significa condições em que os assim chamados híbridos específicos são formados, e híbridos não específicos não são formados. As condições podem ser apropriadamente determinadas com referência a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), por exemplo. Especificamente, a estringência pode ser determinada pela temperatura e a concentração de sal contida na solução na hibridização de Southern, e a temperatura e a concentração de sal contida na solução na etapa de lavagem da hibridização de Southern. Mais especificamente, as condições rigorosas, por exemplo, são uma concentração de sódio de 25 a 500 mM ou 25 a 300 mM em algumas modalidades e uma temperatura de 42 a 68 °C ou 42 a 65 °C em algumas modalidades. Mais especificamente, as condições rigorosas são 5 x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio) e uma temperatura de 42 °C.
[047] Como descrito acima, se um gene que consiste em uma sequência nucleotídica diferente da SEQ ID NO: 23 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos diferente da SEQ ID NO: 24 funciona como um gene galactose permease pode ser determinado produzindo um vetor de expressão com tal gene incorporado em um sítio entre um promotor adequado e um terminador adequado ou semelhantes, transformando um hospedeiro, tal como Escherichia coli usando o vetor de expressão, e medindo a atividade de galactose permease de uma proteína a ser expressada. A atividade de galactose permease é a atividade para incorporar a galactose e/ou arabinose contidas no meio em células. Consequentemente, a atividade de galactose permease pode ser avaliada, por exemplo, cultivando a Escherichia coli transformada descrita acima em um meio contendo galactose e/ou arabinose com base na diminuição de galactose e/ou arabinose no meio. < Gene relacionado ao metabolismo da xilose>
[048] A levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ainda ter um gene de enzima relacionado ao metabolismo da xilose convencionalmente conhecido além do gene relacionado ao metabolismo da L- arabinose de modo a ter a capacidade de metabolizar a xilose. Aqui, “tendo a capacidade de metabolizar xilose” significa: adquirir a capacidade de metabolizar xilose introduzindo um gene de enzima relacionado ao metabolismo da xilose em uma levedura que não tem originalmente a capacidade de metabolizar xilose; e ter inerentemente a capacidade de metabolizar xilose tendo um gene de enzima relacionado ao metabolismo da xilose. Mais especificamente, exemplos da levedura tendo a capacidade de metabolizar xilose podem incluir uma levedura que não tem inerentemente a capacidade de metabolizar xilose, à qual a capacidade de metabolizar xilose foi conferida introduzindo um gene xilose isomerase na levedura, e uma levedura à qual a capacidade de metabolizar xilose foi conferida introduzindo outros genes relacionados ao metabolismo da xilose.
[049] O gene xilose isomerase (gene XI) não é particularmente limitado, e genes de qualquer espécie podem ser usados. Por exemplo, vários genes xilose isomerase derivados de protistas intestinais de térmita, divulgados em JP 2011- 147445 A, podem ser usados sem limitação particular. Além disso, os exemplos do gene xilose isomerase que podem ser usados incluem genes derivados de fungos anaeróbicos, Piromyces sp. tipo E2 (JP 2005-514951 T), fungos anaeróbicos, Cyllamyces aberensis, bactérias, Bacteroides thetaiotaomicron, bactérias, Clostridium phytofermentans e clusters de Streptomyces murinus.
[050] Especificamente, um gene xilose isomerase derivado de protistas intestinais Reticulitermes speratus é usado como o gene xilose isomerase em algumas modalidades. A sequência nucleotídica da região de codificação do gene xilose isomerase derivado de protistas intestinais Reticulitermes speratus e a sequência de aminoácidos das proteínas codificadas pelo gene são respectivamente representadas pelas SEQ ID NOs: 25 e 26.
[051] Entretanto, o gene xilose isomerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 25 e 26 e pode ser um gene tendo uma relação paráloga ou uma relação homóloga em um sentido restrito, embora a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácidos sejam diferentes.
[052] Além disso, o gene xilose isomerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 25 e 26 e podem ser aqueles que codificam uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 70 % ou mais, 80 % ou mais em algumas modalidades, 90 % ou mais em outras modalidades, ou 95 % ou mais em algumas outras modalidades, com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 e tendo atividade de xilose isomerase, por exemplo. Os valores de identidade podem ser calculados pelos programas BLASTN ou BLASTX que implementam o algoritmo BLAST (configuração padrão). Os valores de identidade são calculados como uma razão do número de resíduos de aminoácido que correspondem completamente uns aos outros quando um par de sequências de aminoácidos é analisado por alinhamento de pares com os resíduos de aminoácido totais comparados.
[053] Além disso, o gene xilose isomerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 25 e 26 e podem ser aqueles que codificam uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 pela substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos, e tendo atividade de xilose isomerase, por exemplo. O número referido como vários aqui é, por exemplo, 2 a 30, 2 a 20 em algumas modalidades, 2 a 10 em outras modalidades, ou 2 a 5 em algumas outras modalidades.
[054] Além do mais, o gene xilose isomerase não é limitado àquele especificado pelas SEQ ID NOs: 25 e 26 e pode ser aquele que hibridiza com o todo ou uma parte da fita complementar de DNA que consiste na sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 25 sob condições rigorosas e que codifica uma proteína tendo atividade de xilose isomerase, por exemplo. O termo “condições rigorosas” aqui significa condições em que os assim chamados híbridos específicos são formados, e híbridos não específicos não são formados. As condições podem ser apropriadamente determinadas com referência a Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), por exemplo. Especificamente, a estringência pode ser determinada pela temperatura e a concentração de sal contida na solução na hibridização de Southern, e a temperatura e a concentração de sal contida na solução na etapa de lavagem da hibridização de Southern. Mais especificamente, as condições rigorosas, por exemplo, são uma concentração de sódio de 25 a 500 mM ou 25 a 300 mM em algumas modalidades e uma temperatura de 42 a 68 °C ou 42 a 65 °C em algumas modalidades. Mais especificamente, as condições rigorosas são 5 x SSC (83 mM de NaCl, 83 mM de citrato de sódio) e uma temperatura de 42 °C.
[055] Como descrito acima, se um gene que consiste em uma sequência nucleotídica diferente da SEQ ID NO: 25 ou um gene que codifica uma sequência de aminoácidos diferente da SEQ ID NO: 26 funciona como um gene xilose isomerase pode ser determinado produzindo um vetor de expressão com tal gene incorporado em um sítio entre um promotor adequado e um terminador adequado ou semelhantes, transformando um hospedeiro, tal como Escherichia coli usando o vetor de expressão, e medindo a atividade de xilose isomerase de uma proteína expressada. O termo “atividade de xilose isomerase” significa a atividade para isomerizar a xilose em xilulose. Portanto, a atividade de xilose isomerase pode ser avaliada preparando uma solução contendo xilose como um substrato, permitindo que a proteína como um alvo de inspeção atue em uma temperatura adequada, e medindo a diminuição na xilose e/ou a quantidade de xilulose produzida.
[056] Em particular, o gene xilose isomerase a ser usado em algumas modalidades é um gene que codifica a xilose isomerase mutante que consiste em uma sequência de aminoácidos com uma mutação específica introduzida em resíduos de aminoácido específicos na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 26 e tendo atividade melhorada de xilose isomerase. Especificamente, os exemplos do gene que codifica xilose isomerase mutante podem incluir um gene que codifica uma sequência de aminoácidos com uma substituição de asparagina na posição 337 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 26 por cisteína. A xilose isomerase que consiste na sequência de aminoácidos com a substituição da asparagina na posição 337 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 26 por cisteína tem excelente atividade de xilose isomerase em comparação com a xilose isomerase tipo selvagem. A xilose isomerase mutante não é limitada àquelas com a substituição da asparagina na posição 337 por cisteína e pode ser aquelas com a substituição da asparagina na posição 337 por um aminoácido diferente de cisteína, aquelas com substituições diferentes, além da asparagina na posição 337, por outro aminoácido, ou aquelas com uma substituição de um resíduo de aminoácido diferente de asparagina na posição 337.
[057] Enquanto isso, o termo “gene relacionado ao metabolismo da xilose diferente do gene xilose isomerase” significa incluir um gene xilose redutase que codifica a xilose redutase que converte xilose em xilitol, um gene xilitol desidrogenase que codifica xilitol desidrogenase que converte xilitol em xilulose e um gene xiluloquinase que codifica xiluloquinase que produz xilulose 5-fosfato pela fosforilação da xilulose. A xilulose 5-fosfato produzida pela xiluloquinase entra na via da pentose fosfato a ser metabolizada.
[058] A gene relacionado ao metabolismo da xilose não é particularmente limitado, mas exemplos do mesmo podem incluir um gene xilose redutase e um gene xilitol desidrogenase derivado de Pichia stipitis, e um gene xiluloquinase derivado de Saccharomyces cerevisiae (ver Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66: 3381- 3386 e Toivari MN et al., Metab. Eng. 3: 236-249). Além disso, os exemplos de gene xilose redutase que podem ser usados incluem genes xilose redutase derivados de Candida tropicalis e Candida prapsilosis. Exemplos do gene xilitol desidrogenase que podem ser usados incluem genes xilitol desidrogenase derivados de Candida tropicalis ou Candida prapsilosis. Exemplos do gene xiluloquinase que podem ser usados também incluem genes xiluloquinase derivados de Pichia stipitis.
[059] Além disso, a levedura tendo inerentemente a capacidade de metabolizar xilose não é particularmente limitada, mas exemplos da mesma podem incluir Pichia stipitis, Candida tropicalis e Candida prapsilosis. <Outros genes>
[060] Enquanto isso, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser uma levedura compreendendo ainda outro gene introduzido na mesma. Por exemplo, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser uma compreendendo um gene acetaldeído desidrogenase introduzido na mesma. O gene acetaldeído desidrogenase não é particularmente limitado, e genes de qualquer organismo podem ser usados. Além disso, o gene acetaldeído desidrogenase usa um gene com uma sequência nucleotídica modificada de acordo com a frequência de uso de códon na levedura a ser introduzida, no caso do uso de genes derivados de organismos diferentes de fungos, tais como leveduras, e.g., bactérias, animais, plantas, insetos e algas, em algumas modalidades.
[061] Mais especificamente, os exemplos do gene acetaldeído desidrogenase que podem ser usados incluem o gene mhpF de Escherichia coli e o gene ALDH1 de Entamoeba histolytica como divulgado em Applied and Environmental Microbiology, maio de 2004, p. 2892-2897, Vol. 70, No 5. Além disso, os exemplos do gene acetaldeído desidrogenase podem incluir o gene adhE de Escherichia coli, um gene de desidrogenação de acetaldeído derivado de Clostridium beijerinckii e um gene de desidrogenação de acetaldeído derivado de Chlamydomonas reinhardtii.
[062] Além disso, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser, por exemplo, uma levedura compreendendo um gene que está envolvido no metabolismo de glicose, tal como a glicose introduzida na mesma. Como um exemplo, a levedura recombinante pode ser transformada em uma levedura tendo atividade de β-glucosidase introduzindo um gene β-glucosidase.
[063] Aqui, o termo “atividade de β-glucosidase” significa a atividade para catalisar uma reação de hidrólise de uma ligação β-glicosídica de um açúcar. Isto é, a β-glucosidase pode decompor celooligossacarídeos, tais como celobiose em glicose. O gene β-glucosidase pode ser introduzido como um gene de exibição na superfície celular. Aqui, o gene de exibição na superfície celular é um gene modificado de modo que a proteína codificada pelo gene é expressada de modo a ser exibida na camada de superfície de uma célula. Por exemplo, um gene β glucosidase de exibição na superfície celular é um gene em que um gene β-glucosidase e um gene de proteína localizada na superfície celular são fundidos. Uma proteína localizada na superfície celular é uma proteína que está fixada na superfície celular de uma levedura e existe na superfície celular. Exemplos destas incluem proteína α- ou a-aglutinina e FLO, que são proteínas agregadas. Em geral, a proteína localizada na superfície celular tem uma sequência de sinal secretora no lado N-terminal e um sinal de reconhecimento ancorado em GPI no lado C-terminal. A proteína localizada na superfície celular é semelhante às proteínas secretoras por ter um sinal secretor, mas a proteína localizada na superfície celular é diferente das proteínas secretoras por estar fixada a uma membrana celular por meio de uma âncora de GPI e transportada. A proteína localizada na superfície celular está fixada à membrana celular pela clivagem seletiva da sequência de sinal de reconhecimento ancorada por GPI, ao passar através da membrana celular e se ligar à âncora de GPI em uma parte C-terminal recém- protruberante. Depois disso, a porção basal da âncora de GPI é clivada por fosfolipase C dependente de fosfatidilinositol (PI-PLC). Então, a proteína separada da membrana celular é incorporada na parede celular para ser fixada à camada de superfície celular e localizada na camada de superfície celular (por exemplo, ver JP 2006-174767 A).
[064] O gene β-glucosidase não é particularmente limitado, mas exemplos do mesmo podem incluir um gene β-glucosidase derivado de Aspergillus aculeatus (Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64: 4857-4861). Além disso, os exemplos do gene β- glucosidase que podem ser usados incluem um gene β-glucosidase derivado de Aspergillus oryzae, um gene β-glucosidase derivado de Clostridium cellulovorans e um gene β-glucosidase derivado de Saccharomycopsis fibuligera.
[065] Além disso, a levedura recombinante usada no método para produzir etanol de acordo com a presente divulgação pode ser uma com um gene que codifica outra enzima que constitui a celulase introduzida, além do gene β glucosidase ou diferente do gene β glucosidase. Exemplos da enzima que constitui a celulase diferente de β glucosidase podem incluir celobio-hidrolases tipo exo (CBH1 e CBH2) que liberam celobiose das extremidades de celulose cristalina, e uma endoglucanase de tipo final (EG) que não pode decompor a celulose cristalina, mas cliva as cadeias de celulose não cristalina (celulose amorfa) aleatoriamente.
[066] Além disso, exemplos de outros genes a serem introduzidos na levedura recombinante podem incluir um gene álcool desidrogenase (gene ADH1) tendo a atividade de converter acetaldeído em etanol, um gene acetil-CoA sintase (gene ACS1) tendo a atividade de converter ácido acético em acetil-CoA e genes (gene ALD4, gene ALD5 e gene ALD6) tendo a atividade de converter acetaldeído em ácido acético. Um gene álcool desidrogenase (gene ADH2) tendo a atividade de converter etanol em acetaldeído pode ser interrompido.
[067] Além disso, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ter uma característica de expressar um gene álcool desidrogenase (gene ADH1) tendo a atividade de converter acetaldeído em etanol em um alto nível em algumas modalidades. Exemplos do método para expressar o gene em um alto nível incluem um método de substituir o promotor intrínseco do gene com um promotor para alta expressão e um método de introduzir um vetor de expressão capaz de expressar o gene na levedura.
[068] Além disso, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ter uma característica de tendo um nível reduzido de expressão do gene álcool desidrogenase (gene ADH2) tendo a atividade de converter etanol em aldeído em algumas modalidades. Exemplos do método para reduzir o nível de expressão do gene incluem um método de modificar o promotor intrínseco do gene e um método de remover o gene. Ao remover o gene, um dos pares de genes ADH2 existentes na levedura recombinante diploide pode ser suprimido, ou ambos podem ser suprimidos. Exemplos da técnica para reduzir a expressão gênica podem incluir o assim chamado método de transposon, método de transgene, método de silenciamento de gene pós-transcricional, método de RNAi, método de decaimento mediado por nonsense (NMD), método de ribozima, método de antisense, método de miRNA (micro-RNA) e método de siRNA (pequeno RNA interferente).
[069] Além disso, exemplos de outros genes a serem introduzidos na levedura recombinante podem incluir genes que podem promover a utilização de xilose em um meio. Especificamente, exemplos dos mesmos podem incluir um gene que codifica xiluloquinase tendo a atividade para produzir xilulose-5-fosfato usando xilulose como um substrato. O fluxo metabólico na via da pentose fosfato pode ser melhorado introduzindo o gene xiluloquinase.
[070] Além disso, um gene que codifica uma enzima selecionada de um grupo de enzima que constitui a via do processo de não oxidação na via da pentose fosfato pode ser introduzida na levedura recombinante. Exemplos das enzimas que constituem o processo de não oxidação na via da pentose fosfato podem incluir ribose- 5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato-3-epimerase, transcetolase e transaldolase. Um ou mais genes que codificam essas enzimas são introduzidos em algumas modalidades. Além disso, dois ou mais de tais genes são introduzidos em combinação em algumas modalidades, três ou mais são introduzidos em combinação em algumas outras modalidades, ou todos os genes são introduzidos em ainda outras modalidades.
[071] Mais especificamente, o gene xiluloquinase (XK) pode ser usado sem limitação particular da origem do mesmo. Muitos micro-organismos, tais como bactérias e leveduras que assimilam a xilulose, compreendem o gene XK. A informação sobre o gene XK pode ser apropriadamente obtida pesquisando no site do NCBI ou semelhantes. Em algumas modalidades, exemplos dos mesmos incluem genes XK derivados de leveduras, bactérias ácido láticas, Escherichia coli e plantas. Exemplos do gene XK incluem um gene XK derivado da cepa S. cerevisiae S288C, XKS1 (GenBank: Z72979) (sequência nucleotídica e sequência de aminoácidos da região de codificação de CDS).
[072] Mais especificamente, o gene transaldolase (TAL), o gene transcetolase (TKL), o gene ribulose-5-fosfato epimerase (RPE) e o gene ribose-5-fosfato cetoisomerase (RKI) podem ser usados sem limitação particular da origem do mesmo. Muitos organismos que têm a via da pentose fosfato compreendem esses genes. Por exemplo, leveduras de propósitos gerais, tais como S. cerevisiae, também carregam esses genes. A informação sobre esses genes pode ser apropriadamente obtida acessando um site da internet tal como do NCBI. Em algumas modalidades, exemplos dos mesmos incluem genes derivados do mesmo gênero da célula eucariótica hospedeira, tal como uma célula eucariótica ou uma levedura, e a mesma espécie da célula eucariótica hospedeira em ainda outras modalidades. Em algumas modalidades, um gene TAL1 pode ser usado como o gene TAL, um gene TKL1 e um gene TKL2 podem ser usados como o gene TKL, um gene RPE1 pode ser usado como o gene RPE, e um gene RKI1 pode ser usado como o gene RKI. Exemplos de tais genes incluem um gene TAL1 derivado da cepa S. cerevisiae S288, gene TAL1 (GenBank: U19102), um gene TKL1 derivado da cepa S. cerevisiae S288 (GenBank: X73224), um gene RPE1 derivado da cepa S. cerevisiae S288 (GenBank: X83571) e um gene RKI1 derivado da cepa S. cerevisiae S288 (GenBank: Z75003). <Produção de levedura recombinante>
[073] A levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser produzida, por exemplo, introduzindo um grupo de genes metabólicos de L-arabinose incluindo pelo menos um selecionado do grupo que consiste no gene L-arabinose isomerase (gene araA), o gene L-ribuloquinase (gene araB) e o gene L-ribulose-5- fosfato-4-epimerase (gene araD) em uma levedura como um hospedeiro. Alternativamente, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode ser produzida, por exemplo, pela introdução adicional de pelo menos um selecionado do grupo que consiste no gene L-arabinose isomerase (gene araA), o gene L-ribuloquinase (gene araB) e o gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase (gene araD) em uma levedura tendo a capacidade de metabolizar L-arabinose.
[074] O gene galactose permease, o gene relacionado ao metabolismo da xilose, e outros genes podem ser introduzidos na levedura recombinante de acordo com a presente divulgação, ou pode ser realizada uma modificação para reduzir o nível de expressão do gene álcool desidrogenase (gene ADH2) tendo a atividade de converter etanol em aldeído.
[075] Ao introduzir o cluster de gene metabólico de L-arabinose, o gene galactose permease, o gene relacionado ao metabolismo da xilose e outros genes na levedura hospedeira na produção da levedura recombinante de acordo com a presente divulgação, todos os genes podem ser introduzidos ao mesmo tempo ou podem ser sequencialmente introduzidos usando diferentes vetores de expressão.
[076] A levedura que pode ser usada como um hospedeiro não é particularmente limitada, mas exemplos da mesma incluem leveduras de Candida Shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe. Em particular, Saccharomyces cerevisiae é usada em algumas modalidades. A levedura pode ser uma cepa experimental usada para conveniência experimental ou uma cepa industrial (cepa prática) usada para utilidade prática. Exemplos da cepa industrial incluem cepas de leveduras usadas para fabricar vinho, saquê e shochu.
[077] Como a levedura hospedeira, leveduras homotálicas são usadas em algumas modalidades. De acordo com a técnica divulgada em JP 2009-34036 A, o uso de uma levedura tendo propriedades homotálicas convenientemente permite a transfecção de múltiplas cópias em um genoma. As leveduras tendo propriedades homotálicas são sinônimas de leveduras homotálicas. As leveduras tendo propriedades homotálicas não são particularmente limitadas e qualquer levedura pode ser usada. Exemplos das leveduras tendo propriedades homotálicas não são particularmente limitados, mas podem incluir cepa Saccharomyces cerevisiae OC-2 (NBRC2260). Exemplos de outras leveduras tendo propriedades homotálicas podem incluir uma levedura de álcool (Daiken 396 No NBRC0216) (Fonte: “Characteristics of alcohol yeast” Shuken Kaihou (Bulletin), No 37, p18-22 (1998,8)), levedura para produzir etanol isolada no Brasil e Okinawa (Fonte: “Genetic properties of wild strains of Saccharomyces cerevisiae isolated in Brazil and Okinawa" Journal of Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, Vol. 65, No 4, p. 759-762 (1991,4)) e 180 (Fonte “The screening of yeast having strong alcoholic fermentation ability" Journal of Brewing Society of Japan, Vol. 82, No 6, p. 439-443 (1987,6)). Além disso, mesmo as leveduras que apresentam um fenótipo heterotálico podem ser usadas como leveduras tendo propriedades homotálicas introduzindo o gene HO de modo a expressar. Isto é, as leveduras tendo propriedades homotálicas na presente divulgação pretendem incluir leveduras com o gene HO introduzido de modo a expressar.
[078] Dentre essas, a cepa Saccharomyces cerevisiae OC-2 é usada em algumas modalidades, visto que é uma cepa que foi convencionalmente usada para fabricação de vinho e confirmada como sendo segura. Além disso, a cepa Saccharomyces cerevisiae OC-2 é usada em algumas modalidades, visto que é uma cepa tendo excelente atividade promotora sob condições de alta concentração de açúcar, como será descrito nos exemplos abaixo. Em particular, a cepa Saccharomyces cerevisiae OC-2 é usada em algumas modalidades devido à excelente atividade promotora de um gene piruvato decarboxilase (PDC1) sob condições de alta concentração de açúcar.
[079] Além disso, o promotor do gene a ser introduzido não é particularmente limitado, mas exemplos deste que podem ser usados incluem o promotor de um gene gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase (TDH3), o promotor de um gene 3-fosfoglicerato cinase (PGK1) e o promotor de um gene de resposta hiperosmótica 7 (HOR7). Dentre esses, o promotor do gene piruvato decarboxilase (PDC1) é usado em algumas modalidades devido à sua alta capacidade de expressar o gene alvo a jusante em um alto nível.
[080] Isto é, o gene anteriormente mencionado pode ser introduzido no genoma da levedura junto com um promotor que regula a expressão e outras regiões reguladoras de expressão. Alternativamente, o gene anteriormente mencionado pode ser introduzido de modo que sua expressão seja regulada pelo promotor do gene originalmente existente no genoma da levedura que serve como o hospedeiro ou outras regiões reguladoras de expressão.
[081] Além disso, como o método para introduzir o gene anteriormente mencionado, qualquer técnica convencionalmente conhecida como um método de transformação de levedura pode ser aplicada. Especificamente, exemplos dos mesmos incluem o método de eletroporação “Meth. Enzym., 194, p.182 (1990)”, o método de esferoplasto “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p.1929 (1978)”, o método de acetato de lítio “J. Bacteriology, 153, p163 (1983)”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p.1929 (1978), e Methods in yeast genetics, Edição 2000: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, mas não existe limitação a esses métodos.
[082] Exemplos do método para reduzir o nível de expressão do gene álcool desidrogenase (gene ADH2) tendo a atividade de converter etanol em aldeído incluem um método de modificar o promotor intrínseco do gene e um método de remover o gene. Ao remover o gene, um dos pares de genes existentes na levedura recombinante diploide pode ser suprimido, ou ambos podem ser suprimidos. Exemplos da técnica para reduzir a expressão gênica podem incluir o assim chamado método de transposon, método de transgene, método de silenciamento de gene pós- transcricional, método de RNAi, método de decaimento mediado por nonsense (NMD), método de ribozima, método de antisense, método de miRNA (micro-RNA) e método de siRNA (pequeno RNA interferente). <Produção de etanol>
[083] Ao produzir etanol usando a levedura recombinante descrita acima, a cultura de fermentação de etanol é realizada em um meio contendo pelo menos arabinose. Isto é, o meio para a fermentação de etanol contém pelo menos arabinose como uma fonte de carbono. O meio pode conter previamente outras fontes de carbono, tais como glicose e xilose.
[084] Além disso, as fontes de carbono, tais como arabinose contida no meio usado para a fermentação de etanol, podem ser derivadas de biomassa. Em outras palavras, o meio usado para a fermentação de etanol pode ter uma composição contendo biomassa celulósica e hemicelulase, que produz arabinose ou semelhantes sacarificando a hemicelulose contida na biomassa celulósica. Aqui, a biomassa celulósica pode ser submetida a um pré-tratamento convencionalmente conhecido. O pré-tratamento não é particularmente limitado, mas exemplos do mesmo podem incluir tratamento para decompor lignina por micro-organismos e tratamento de esmagamento da biomassa celulósica. Além disso, os exemplos do pré-tratamento que podem ser aplicados incluem tratamento para imergir a biomassa celulósica esmagada em uma solução diluída de ácido sulfúrico, uma solução alcalina ou um líquido iônico, tratamento hidrotérmico e tratamento de pulverização. Esses pré- tratamentos podem melhorar a taxa de sacarificação da biomassa.
[085] Ao produzir etanol usando a levedura recombinante descrita acima, o meio pode ter uma composição adicional contendo celulose e celulase. Neste caso, o meio contém glicose produzida pela celulase agindo na celulose. No caso onde o meio usado para a fermentação de etanol contém celulose, a celulose pode ser derivada da biomassa. Em outras palavras, o meio usado para a fermentação de etanol pode ter uma composição contendo celulase capaz de sacarificar a celulase contida na biomassa celulósica.
[086] Além disso, o meio usado para a fermentação de etanol pode ser suplementado com uma solução sacarificada depois do tratamento de sacarificação da biomassa celulósica. Neste caso, a solução sacarificada contém celulose e glicose residuais, e arabinose e xilose derivadas da hemicelulose contida na biomassa celulósica.
[087] Como descrito acima, o método para produzir etanol de acordo com a presente divulgação compreende uma etapa de fermentação de etanol usando pelo menos arabinose como uma fonte de açúcar. No método para produzir etanol de acordo com a presente divulgação, o etanol pode ser produzido pela fermentação de etanol usando arabinose como uma fonte de açúcar. No método para produzir etanol usando a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação, o etanol é recuperado do meio depois da fermentação de etanol. O método para recuperar o etanol não é particularmente limitado, e qualquer método convencionalmente conhecido pode ser aplicado. Por exemplo, depois do término da fermentação de etanol, uma camada líquida contendo etanol e uma camada sólida contendo a levedura recombinante e componentes sólidos são separadas por operação de separação sólido-líquido. Depois disso, o etanol contido na camada líquida é separado e purificado por um método de destilação, de modo que o etanol de alta pureza possa ser recuperado. O grau de purificação do etanol pode ser apropriadamente ajustado de acordo com o propósito de uso do etanol.
[088] Além disso, o método para produzir etanol de acordo com a presente divulgação pode ser um assim chamado processo de fermentação de sacarificação simultânea, em que uma etapa de sacarificar a celulose contida no meio pela celulase e uma etapa de fermentar o etanol usando arabinose e glicose produzidas pela sacarificação como fontes açúcar procedem ao mesmo tempo. Aqui, o termo “processo de fermentação de sacarificação simultânea” significa um processo em que uma etapa de sacarificar a biomassa celulósica e uma etapa de fermentar o etanol são realizadas ao mesmo tempo sem distinção entre elas.
[089] O método de sacarificação não é particularmente limitado, mas exemplos do mesmo podem incluir um método enzimático usando uma preparação de celulase, tal como celulase e hemicelulase. A preparação de celulase contém múltiplas enzimas que estão envolvidas na decomposição de cadeias de celulose e cadeias de hemicelulose e exibe múltiplas atividades, tais como a atividade de endoglucanase, atividade de endoxilanase, atividade de celobio-hidrolase, atividade de glucosidase e atividade de xilosidase. A preparação de celulase não é particularmente limitada, mas exemplos da mesma podem incluir celulases produzidas por Trichoderma reesei e Acremonium cellulolyticus. Uma preparação de celulase comercialmente disponível também pode ser usada.
[090] No processo de fermentação de sacarificação simultânea, uma preparação de celulase e os micro-organismos recombinantes são adicionados a um meio contendo a biomassa celulósica (que pode ser pré-tratada) e a levedura recombinante é cultivada em uma faixa de temperatura predeterminada. A temperatura da cultura não é particularmente limitada, mas pode ser de 25 a 45 °C ou de 30 a 40 °C em consideração à eficiência da fermentação de etanol em algumas modalidades. Além disso, o pH da solução de cultura é de 4 a 6 em algumas modalidades. Além disso, a agitação ou sacudida pode ser realizada na cultura. Além disso, fermentação de sacarificação simultânea anômala pode ser realizada, em que a sacarificação é primeiro realizada na temperatura ideal da enzima (40 a 70 °C), depois a temperatura é diminuída a uma temperatura predeterminada (30 a 40 °C) e a levedura é adicionada.
[091] Enquanto isso, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação é excelente na capacidade de metabolizar a arabinose, isto é, a eficiência de assimilação da arabinose contida no meio para produzir etanol. Consequentemente, a levedura recombinante de acordo com a presente divulgação pode produzir etanol usando não apenas a glicose produzida durante a sacarificação da biomassa celulósica, mas também eficazmente a arabinose, para melhorar consideravelmente a produtividade de etanol a partir da biomassa celulósica. Exemplos
[092] Em seguida a presente divulgação será descrita em mais detalhes por meio de exemplos, mas o escopo técnico da presente divulgação não é limitado aos exemplos a seguir.
[Exemplo 1]
[093] Neste exemplo, um novo gene L-arabinose isomerase (gene araA), um novo gene L-ribuloquinase (gene araB) e um novo gene L-ribulose-5-fosfato-4- epimerase (gene araD) que contribuem para a assimilação de arabinose foram examinados. (1) Triagem do gene araB
[094] Uma levedura recombinante foi produzida introduzindo cada um de 11 tipos de novos genes araB e genes araA e araD conhecidos derivados de Lactobacilo plantarum em uma levedura que superexpressa um gene GAL2 derivado de S. cerevisiae (que codifica um transportador de arabinose). Em seguida, a levedura recombinante foi comparada com o caso em que um gene araB conhecido derivado de Lactobacilo plantarum foi introduzido para investigação, para descobrir um novo gene araB que funciona em leveduras, diferente do araB conhecido derivado de Lactobacilo plantarum. (2) Triagem dos genes araD e araA
[095] Depois disso, de modo a pesquisar por novas sequências de araA e araD, foram focados os genes araA e araD derivados de Bacillus licheniformis, que são conhecidas como bactérias tendo a capacidade para assimilar a arabinose. Existem dois tipos para cada um de genes araA e araD derivados de Bacillus licheniformis no genoma.
[096] Nenhum dos dois tipos de genes araD derivados de Bacillus licheniformis que funcionam em leveduras e contribuem para a assimilação de arabinose são conhecidos, e foi descoberto que o gene araD1 tinha características de assimilação de arabinose particularmente excelentes. Neste momento, uma pluralidade de outros novos genes araD também foram descobertos.
[097] Então, os novos genes araA foram pesquisados usando o gene araD1 derivado de Bacillus licheniformis. Embora o araA1 derivado de Bacillus licheniformis seja conhecido, foi descoberto que o gene araA2, que nunca foi relatado em leveduras, pode ser testado e usado. Neste momento, uma pluralidade de novos genes araA foram adicionalmente descobertos.
1. Método
1.1. Cepa de teste
[098] Uma cepa com genes araA, araB e araD introduzidos foi produzida usando uma cepa de S. cerevisiae OC-2 de levedura de vinho com expressão aumentada de um gene transportador de arabinose (GAL2) como a cepa precursora. A Tabela 1 mostra os genes araA, araB e araD usados neste exemplo. [Tabela 1] Nome do Origem No de acesso Sequência Sequência Fonte gene de de nucleotídeo aminoácido s s LParaB Lactobacilo WP_01110221 SEQ ID NO: SEQ ID NO: Literatur plantarum 8 27 28 a [1] LCaraB Lactobacilo WP_03545276 SEQ ID NO: SEQ ID NO: composti 6 29 30 LFaraB Lactobacilo WP_03361455 SEQ ID NO: SEQ ID NO: fabifermentans 5 31 32 LSaraB Lactobacilo sakei WP_01626579 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4 33 34 PLaraB Pediococcus lolii GAC46306 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 35 36 TSaraB Thermoactinomyce WP_04972002 SEQ ID NO: SEQ ID NO: s sp. 4 7 8 BCaraB Bacillus coagulans AJO22070 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 37 38 MCaraB Megasphaera WP_04851551 SEQ ID NO: SEQ ID NO: cerevisiae 8 15 16 CNaraB Clostridium nexile CDC22812 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9 10 SSaraB Selenomonas sp. WP_05034203 SEQ ID NO: SEQ ID NO: Oral taxon 4 11 12 PSaraB Paenibacillus sp. WP_03987798 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 0 13 14 LParaD Lactobacilo WP_00364291 SEQ ID NO: SEQ ID NO: Literatur plantarum 6 39 40 a [1] BLaraD1 Bacillus WP_00318229 SEQ ID NO: SEQ ID NO: licheniformis 1 17 18 BLaraD2 Bacillus WP_01119818 SEQ ID NO: SEQ ID NO: licheniformis 5 41 42 AHaraD Anaerostipes WP_00920441 SEQ ID NO: SEQ ID NO:
hadrus 9 43 44 AParaD Alkalibacterium WP_09148682 SEQ ID NO: SEQ ID NO: putridalgicola 8 19 20 BAaraD Bacillus WP_01866266 SEQ ID NO: SEQ ID NO: acidiproducens 2 45 46 CS17ara Carnobacterium sp. WP_01370996 SEQ ID NO: SEQ ID NO: D 17-4 5 21 22 FParaD Fructobacillus WP_05937667 SEQ ID NO: SEQ ID NO: pseudoficulneus 7 47 48 LIaraD Listeria ivanovii WP_03840672 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 6 49 50 MSaraD Megasphaera sp. WP_08747685 SEQ ID NO: SEQ ID NO: An286 1 51 52 SSaraD Selenomonas sp. WP_00944296 SEQ ID NO: SEQ ID NO: oral taxon 149 6 53 54 BLaraA1 Bacillus WP_00318425 SEQ ID NO: SEQ ID NO: Literatur licheniformis 7 55 56 a [2] BLaraA2 Bacillus WP_01119801 SEQ ID NO: SEQ ID NO: licheniformis 2 1 2 SRaraA Selenomonas WP_07230602 SEQ ID NO: SEQ ID NO: ruminantium 4 3 4 LLaraA Lactococcus lactis SBW30785 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 57 58 MCaraA Megasphaera WP_04851551 SEQ ID NO: SEQ ID NO: cerevisiae 9 59 60 CAaraA1 Clostridium sp. WP_01096465 SEQ ID NO: SEQ ID NO: Literatur 1 61 62 a [2] CAaraA2 Clostridium WP_03458346 SEQ ID NO: SEQ ID NO: Literatur acetobutilicum 4 63 64 a [2] BAaraA Bacillus akibai WP_03566267 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 6 65 66 BHaraA Bacillus halodurans WP_01089803 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4 67 68 LSaraA Lactobacilo sakei WP_01137553 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7 5 6 OOaraA Oenococcus oeni WP_00282248 SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7 69 70 Literatura [1]: Wisselink, H. W et al. Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73: 4881-4891 Literatura [2]: US 8.753.862 B2
[099] A Tabela 2 resume os nomes e genótipos das cepas produzidas neste exemplo e submetidas ao teste de fermentação para avaliação da capacidade para assimilar a arabinose. [Tabela 2] Nome da Genótipo cepa Uz2837 SUC2/SUC2::GAL2 Uz2839 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA
Uz2875 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::LParaB Uz2861 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::CNaraB Uz2863 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::LCaraB Uz2864 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::LFaraB Uz2865 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::LSaraB Uz2866 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::PLaraB Uz2867 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::TSaraB Uz2868 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::BCaraB Uz2869 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::MCaraB Uz2870 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::SSaraB Uz2871 SUC2/SUC2::GAL2 ATH1/ath1::LParaD PDC6/PDC6::LParaA GAD1/GAD1::PSaraB Uz2943 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB Uz3003 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 Uz3010 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD2 Uz3011 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::LParaD Uz3121 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::AHaraD Uz3122 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::AParaD Uz3123 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BAaraD Uz3124 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::CS17araD Uz3126 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::FParaD Uz3127 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::LIaraD Uz3128 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::MSaraD Uz3129 SUC2/SUC2::GAL2 PDC6/PDC6::BLaraA2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::SSaraD Uz3151 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 Uz3181 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::LParaA Uz3182 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::BLaraA2 Uz3183 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::BLaraA1
Uz3184 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::CAaraA1 Uz3186 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::CAaraA2 Uz3188 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::SRaraA Uz3189 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::BAaraA Uz3190 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::BHaraA Uz3191 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::LLaraA Uz3192 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::LSaraA Uz3193 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::MCaraA Uz3194 SUC2/SUC2::GAL2 GAD1/GAD1::SsaraB ATH1/ath1::BLaraD1 PDC6/PDC6::OOaraA Uz3096 ALD6/ALD6-T_GIC1 adh2::ADH1_eutE GRE3/gre3::TKL1_TAL1_RPE1_RKI1_XI~N337C_XKS1 Uz3337 GAL1/GAL1::GAL2 ALD6/ALD6-T_GIC1 adh2::ADH1_eutE GRE3/gre3::TKL1_TAL1_RPE1_RKI1_XI~N337C_XKS1 Uz3338 GAL1/GAL1::GAL2 ALD6/ALD6-T_GIC1 adh2::ADH1_eutE GRE3/gre3::TKL1_TAL1_RPE1_RKI1_XI~N337C_XKS1
1.2. Produção de plasmídeo para expressão do gene GAL2
[0100] Um plasmídeo: pUC-5U500_SUC2-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-loxP- HPH-loxP-5U_SUC2 tendo uma sequência necessária para introduzir um gene GAL2 derivado de Saccharomyces cerevisiae foi produzido.
[0101] Este plasmídeo foi construído de modo a compreender, no lado 5’, um gene GAL2 no qual o promotor HOR7 e o terminador DIT1 derivado da cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 foram adicionados, uma sequência de DNA cerca de 1000 bp a montante de um gene SUC2 (5U500_SUC2) e uma sequência de DNA cerca de 500 bp a montante de um gene SUC2 (5U_SUC2) como regiões para recombinação homóloga no genoma de levedura e introdução do gene GAL2, e uma sequência de genes contendo um gene HPH como um marcador (marcador HPH). O gene marcador teve uma sequência capaz de remover o marcador introduzindo sequências de LoxP em ambos os lados.
[0102] Cada sequência de DNA pode ser amplificada por PCR usando o iniciador mostrado na Tabela 3. De modo a ligar os fragmentos de DNA, uma sequência de DNA foi adicionada ao iniciador de modo a sobrepor uma sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp na Tabela 3. Um fragmento de DNA alvo foi amplificado usando tal iniciador com o DNA sintético do genoma de Saccharomyces cerevisiae OC2 e as sequências de LoxP como modelos. Usando um Kit de clonagem In-Fusion HD (disponível na Takara Bio Inc.), os fragmentos de DNA obtidos foram sequencialmente ligados e clonados em um plasmídeo pUC19, para produzir um plasmídeo como o alvo final.
1.3. Produção de plasmídeo para introdução do gene araA
[0103] Um plasmídeo: 5U_PDC6-P_HOR7-[araA]-T_RPL41B-LoxP66- P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-3U_PDC6 tendo uma sequência necessária para introduzir vários genes araA mostrados na Tabela 1 no locus do gene PDC6 da levedura foi produzido. Em [araA] neste nome de plasmídeo, o nome do gene mostrado na Tabela 1 é inserido.
[0104] Este plasmídeo foi construído de modo a compreender, no lado 5’, um gene araA (com o comprimento total da sequência totalmente sintetizada de modo que os códons foram convertidos de acordo com a frequência de uso do códon na levedura) em que o promotor HOR7 e o terminador RPL41B derivado da cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 foram adicionados, uma sequência de DNA na região cerca de 500 bp a jusante da extremidade 3’ do gene PDC6 (3U_PDC6) e uma sequência de genes contendo um gene SAT como um marcador (marcador SAT). O gene marcador teve uma sequência capaz de remover o marcador introduzindo sequências de LoxP em ambos os lados.
[0105] Cada sequência de DNA pode ser amplificada por PCR usando o iniciador mostrado na Tabela 3. De modo a ligar os fragmentos de DNA, uma sequência de DNA foi adicionada ao iniciador de modo a sobrepor uma sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp na Tabela 3. Um fragmento de DNA alvo foi amplificado usando tal iniciador com o DNA sintético do genoma de Saccharomyces cerevisiae OC2, o gene araA e as sequências de LoxP como modelos. Usando um kit de clonagem In-Fusion HD (disponível na Takara Bio Inc.), os fragmentos de DNA obtidos foram sequencialmente ligados e clonados em um plasmídeo pUC19, para produzir um plasmídeo como o alvo final.
1.4. Produção de plasmídeo para introdução do gene araD
[0106] Um plasmídeo: 5U_ATH1-P_TDH3-[araD]-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1- G418-T_URA3-LoxP71-3U_ATH1 tendo uma sequência necessária para introduzir vários genes araD mostrados na Tabela 1 no locus do gene ATH1 da levedura foi produzido. Em [araD] neste nome de plasmídeo, o nome do gene mostrado na Tabela 1 é inserido.
[0107] Este plasmídeo foi construído de modo a compreender, no lado 5’, um gene araD (com o comprimento total da sequência totalmente sintetizada de modo que os códons foram convertidos de acordo com a frequência de uso do códon na levedura) em que o promotor TDH3 e o terminador DIT1 derivado da cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 foram adicionados, uma sequência de DNA na região cerca de 500 bp a jusante da extremidade 3’ do gene ATH1 (3U_ATH1) e uma sequência de genes contendo um gene G418 como um marcador (marcador G418). O gene marcador teve uma sequência capaz de remover o marcador introduzindo sequências de LoxP em ambos os lados.
[0108] Cada sequência de DNA pode ser amplificada por PCR usando o iniciador mostrado na Tabela 3. De modo a ligar os fragmentos de DNA, uma sequência de DNA foi adicionada ao iniciador de modo a sobrepor uma sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp na Tabela 3. O fragmento de DNA alvo foi amplificado usando tal iniciador com o DNA sintético do genoma de Saccharomyces cerevisiae OC2, o gene araD e as sequências de LoxP como modelos. Usando um kit de clonagem In-Fusion HD (disponível na Takara Bio Inc.), os fragmentos de DNA obtidos foram sequencialmente ligados e clonados em um plasmídeo pUC19, para produzir um plasmídeo como o alvo final.
1.5. Plasmídeo para introdução do gene araB
[0109] Um plasmídeo: 5U500_GAD1-P_TDH3-[araB]-T_DIT1-LoxP-T_CYC1- Crei-P_SED1-T_LEU2-BSD-P_TEF1-LoxP-5U_GAD1 tendo uma sequência necessária para introduzir vários genes araB mostrados na Tabela 1 no locus do gene GAD1 da levedura foi produzido. Em [araB] neste nome de plasmídeo, o nome do gene mostrado na Tabela 1 é inserido.
[0110] Este plasmídeo foi construído de modo a compreender, no lado 5’, um gene araB (com o comprimento total da sequência totalmente sintetizada de modo que os códons foram convertidos de acordo com a frequência de uso do códon na levedura) em que o promotor TDH3 e o terminador DIT1 derivado da cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 foram adicionados, uma sequência de DNA na região cerca de 1000 bp a 500 bp a montante da extremidade 5’ do gene GAD1 (5U500_GAD1), uma sequência de DNA na região cerca de 500 bp a montante da extremidade 5’ do gene GAD1 (5U_GAD1) e uma sequência de genes contendo um gene BSD como um marcador (marcador BSD). O gene marcador teve uma sequência capaz de remover o marcador introduzindo sequências de LoxP em ambos os lados. Um gene Cre necessário para remover o marcador (No de acesso NCBI NP_415757.1, com o comprimento total da sequência totalmente sintetizada de modo que os códons foram convertidos de acordo com a frequência de uso do códon na levedura) foi introduzido e fundido com um promotor induzido por galactose, promotor GAL1.
[0111] Cada sequência de DNA pode ser amplificada por PCR usando o iniciador mostrado na Tabela 3. De modo a ligar os fragmentos de DNA, uma sequência de DNA foi adicionada ao iniciador de modo a sobrepor uma sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp na Tabela 3. O fragmento de DNA alvo foi amplificado usando tal iniciador com o DNA sintético do genoma de Saccharomyces cerevisiae BY4742, o gene araB e as sequências de LoxP como modelos.
Alternativamente, um fragmento de DNA foi sintetizado de modo a conter uma sequência sobrepondo a sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp (gBlocks, disponível na Integrated DNA Technologies, Inc). Usando um kit de clonagem In- Fusion HD (disponível na Takara Bio Inc.), os fragmentos de DNA obtidos foram sequencialmente ligados e clonados em um plasmídeo pUC19, para produzir um plasmídeo como o alvo final.
1.6. Plasmídeo para introdução dos genes araA, araB e araD
[0112] Um plasmídeo: 5U_GAL1-P_HOR7-BlaraA2 (ou SRaraA)-T_RPL41B- T_DIT1-BlaraD1-P_TDH3-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1- LoxP71-P_FBA1-SsaraB-T_RPL3-3U_GAL1 tendo uma sequência necessária para introduzir os genes araA, araB e araD no locus do gene GAL1 da levedura foi produzido.
[0113] Este plasmídeo foi construído de modo a compreender, no lado 5’, cada gene araA (com o comprimento total da sequência totalmente sintetizada de modo que os códons foram convertidos de acordo com a frequência de uso do códon na levedura) em que o promotor HOR7 e o terminador RPL41B derivado da cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 foram adicionados, uma sequência de DNA na região cerca de 500 bp a montante da extremidade 5’ do gene GAL1 (5U_GAL1), uma sequência de DNA na região cerca de 500 bp a jusante da extremidade 3’ do gene GAL1 (3U_GAL1) e uma sequência de genes contendo um gene SAT1 como um marcador (marcador SAT). O gene marcador teve uma sequência capaz de remover o marcador introduzindo sequências de LoxP em ambos os lados. Um gene Cre necessário para remover o marcador (No de acesso NCBI NP_415757.1, com o comprimento total da sequência totalmente sintetizada de modo que os códons foram convertidos de acordo com a frequência de uso do códon na levedura) foi introduzido e fundido com um promotor induzido por galactose, promotor GAL1.
[0114] Cada sequência de DNA pode ser amplificada por PCR usando o iniciador mostrado na Tabela 3. De modo a ligar os fragmentos de DNA, uma sequência de DNA foi adicionada ao iniciador de modo a sobrepor uma sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp na Tabela 3. O fragmento de DNA alvo foi amplificado usando tal iniciador com o DNA sintético do genoma de Saccharomyces cerevisiae BY4742, cada um dos genes araA, araB e araD, as sequências de LoxP como modelos. Alternativamente, um fragmento de DNA foi sintetizado de modo a conter uma sequência sobrepondo uma sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp (gBlocks, disponível na Integrated DNA Technologies, Inc). Usando um kit de clonagem In-Fusion HD (disponível na Takara Bio Inc.), os fragmentos de DNA obtidos foram sequencialmente ligados e clonados em um plasmídeo pUC19, para produzir um plasmídeo como o alvo final.
1.7. Produção de plasmídeo para introdução do gene GAL2
[0115] Um plasmídeo: 5U_GAL1-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1- HPH-T_URA3-LoxP71-3U_GAL1 tendo uma sequência necessária para introduzir um gene GAL2 no locus do gene GAL1 da levedura foi produzido. Este plasmídeo foi construído de modo a compreender, no lado 5’, um gene GAL2 no qual o promotor HOR7 e o terminador DIT1 derivado da cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 foram adicionados, uma sequência de DNA na região cerca de 500 bp a montante da extremidade 5’ do gene GAL1 (5U_GAL1), uma sequência de DNA na região cerca de 500 bp a jusante da extremidade 3’ do gene GAL1 (3U_GAL1) e uma sequência de genes contendo um gene HPH como um marcador (marcador HPH). O gene marcador teve uma sequência capaz de remover o marcador introduzindo sequências de LoxP em ambos os lados. Um gene Cre necessário para remover o marcador (No de acesso NCBI NP_415757.1, com o comprimento total da sequência totalmente sintetizada de modo que os códons foram convertidos de acordo com a frequência de uso do códon na levedura) foi introduzido e fundido com um promotor induzido por galactose, promotor GAL1.
[0116] Cada sequência de DNA pode ser amplificada por PCR usando o iniciador mostrado na Tabela 3. De modo a ligar os fragmentos de DNA, uma sequência de DNA foi adicionada ao iniciador de modo a sobrepor uma sequência de DNA adjacente por cerca de 15 bp na Tabela 3. O fragmento de DNA alvo foi amplificado usando tal iniciador com o DNA sintético do genoma de Saccharomyces cerevisiae BY4742 e as sequências de LoxP como modelos. Usando um kit de clonagem In-Fusion HD (disponível na Takara Bio Inc.) ou semelhantes, os fragmentos de DNA obtidos foram sequencialmente ligados e clonados em um plasmídeo pUC19, para produzir um plasmídeo como o alvo final.
1.8. Produção da cepa de expressão do gene GAL2
[0117] Usando a cepa de S. cerevisiae OC2 de uma levedura diploide (NBRC2260) como um hospedeiro e um fragmento obtido amplificando-se os sítios de recombinação homóloga de um plasmídeo pBluntEndTOPO-5U500_SUC2-P_HOR7- GAL2-T_DIT1-loxP-HPH-loxP-5U_SUC2 por PCR, a transformação foi realizada. A levedura foi transformada usando Transformação de Levedura Frozen-EZ II (ZYMO RESEARCH) de acordo com o protocolo em anexo.
[0118] O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo higromicina, seguido por purificação de colônias cultivadas. Este foi usado como cepa Uz2837. Foi confirmado que o transgene de cada uma das cepas selecionadas foi recombinado de forma heterogênea (1 cópia).
1.9. Produção de uma cepa que expressa genes araA e araD e interrompe o gene ATH1 de forma heterozigótica
[0119] Usando a cepa Uz2837 como um hospedeiro, um fragmento obtido amplificando-se os sítios de recombinação homóloga de um plasmídeo pUC- 5U_PDC6-P_HOR7-LParaA-RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei- T_CYC1-LoxP71-3U_PDC6 por PCR, e um fragmento obtido amplificando-se os sítios de recombinação homóloga de 5U_ATH1-P_TDH3-LParaD-T_DIT1-LoxP66-
P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71-3U_ATH1 por PCR, a transformação foi realizada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo nourseotricina e G418, seguido por purificação de colônias cultivadas. Este foi usado como cepa Uz2839. Foi confirmado que o transgene de cada uma das cepas selecionadas foi recombinado de forma heterogênea (1 cópia), e o gene ATH1 foi interrompido de forma heterozigótica.
1.10. Produção de cepas que expressam os genes GAL2, araA, araB e araD
[0120] Usando a cepa Uz2839 como um hospedeiro e um fragmento obtido amplificando-se uma porção entre os sítios de recombinação homóloga de cada plasmídeo pUC-5U500_GAD1-P_TDH3-[araB]-T_DIT1-LoxP71-T_CYC1-Crei- P_SED1-T_LEU2-Bla-P_TEF1-LoxP66-5U_GAD1 ([araB] = cada nome do gene, ver Tabela 1) por PCR, a transformação foi realizada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo blasticidina, seguido por purificação de colônias cultivadas. As cepas purificadas foram respectivamente nomeadas de cepas Uz2861 a 2871 e 2875 (Tabela 2). Foi confirmado que cada cepa foi recombinada de forma heterogênea (1 cópia).
1.11. Produção de uma cepa que expressa os genes GAL2, araA e araB e interrompe o gene ATH1 de forma heterozigótica
[0121] Usando a cepa Uz2837 como um hospedeiro, um fragmento obtido amplificando-se o sítio de recombinação homóloga de um plasmídeo pUC-5U_PDC6- P_HOR7-BLaraA2-RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1- LoxP71-3U_PDC6 por PCR, e um fragmento obtido amplificando-se o sítio de recombinação homóloga de pUC-5U500_GAD1-P_TDH3-SSaraB-T_DIT1-LoxP71- T_CYC1-Crei-P_SED1-T_LEU2-Bla-P_TEF1-LoxP66-5U_GAD1 por PCR, a transformação foi realizada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo nourseotricina e blasticidina, seguido por purificação de colônias cultivadas. Este foi usado como cepa Uz2943. Foi confirmado que o transgene de cada uma das cepas selecionadas foi recombinado de forma heterogênea (1 cópia).
1.12. Produção de cepas que expressam genes GAL2, araA, araB e araD
[0122] Usando um fragmento obtido amplificando-se uma porção entre os sítios de recombinação homóloga de cada plasmídeo pUC19-5U_ATH1-P_TDH3- [araD]-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71-3U_ATH1 ([araD] = cada nome do gene, ver Tabela 1) por PCR, a cepa Uz2943 foi transformada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo blasticidina, seguido por purificação de colônias cultivadas. As cepas purificadas foram respectivamente nomeadas de cepas Uz3003, 3010, 3011 e 3121 a 3129 (Tabela 2). Foi confirmado que cada cepa foi recombinada de forma heterogênea (1 cópia).
1.13. Produção de uma cepa que expressa genes GAL2, araB e araD e interrompe o gene ATH1 de forma heterozigótica
[0123] Usando a cepa Uz2837 como um hospedeiro, um fragmento obtido amplificando-se o sítio de recombinação homóloga de um plasmídeo pUC19- 5U_ATH1-P_TDH3-BLaraD1-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71- 3U_ATH1 por PCR, e um fragmento obtido amplificando-se o sítio de recombinação homóloga de pUC-5U500_GAD1-P_TDH3-SSaraB-T_DIT1-LoxP71-T_CYC1-Crei- P_SED1-T_LEU2-Bla-P_TEF1-LoxP66-5U_GAD1 por PCR, a transformação foi realizada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo G418 e blasticidina, seguido por purificação de colônias cultivadas. Este foi usado como cepa Uz3151. Foi confirmado que o transgene de cada uma das cepas selecionadas foi recombinado de forma heterogênea (1 cópia).
1.14. Produção de cepas que expressam os genes GAL2, araA, araB e araD
[0124] Usando um fragmento obtido amplificando-se uma porção entre os sítios de recombinação homóloga de cada plasmídeo pUC-5U_PDC6-P_HOR7- [araA]-RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71- 3U_PDC6 ([araA] = cada nome do gene, ver Tabela 1) por PCR, a cepa Uz3151 foi transformada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo nourseotricina, seguido por purificação de colônias cultivadas. As cepas purificadas foram respectivamente nomeadas de cepas Uz3181 a 3194 (Tabela 2). Foi confirmado que cada cepa foi recombinada de forma heterogênea (1 cópia).
1.15. Produção de uma cepa na qual genes de assimilação de arabinose (genes GAL2, araA, araB e araD) foram introduzidos na cepa tendo capacidade para assimilar a xilose e genes GAL1 foram interrompidos de forma homozigótica
[0125] Usando um plasmídeo 5U_GAL1-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-LoxP66- P_CYC1-HPH-T_URA3-LoxP71-3U_GAL1, uma cepa Uz3096 tendo a capacidade para assimilar a xilose foi transformada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo higromicina, seguido por purificação de colônias cultivadas. A cepa purificada foi nomeada de cepa Uz3337. Foi confirmado que o transgene de cada uma das cepas selecionadas foi recombinado de forma heterogênea (1 cópia), e o gene GAL1 foi interrompido de forma heterogênea.
[0126] Depois, usando um plasmídeo pUC19-5U_GAL1-P_HOR7-BlaraA2- T_RPL41B-T_DIT1-BlaraD1-P_TDH3-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei- T_CYC1-LoxP71-P_FBA1-SsaraB-T_RPL3-3U_GAL1, a cepa Uz3337 foi transformada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo nourseotricina, seguido por purificação de colônias cultivadas. A cepa purificada foi nomeada de cepa Uz3380. Do mesmo modo, usando um plasmídeo pUC19- 5U_GAL1-P_HOR7-SRaraA-T_RPL41B-T_DIT1-BlaraD1-P_TDH3-LoxP66-P_TEF1- SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-P_FBA1-SsaraB-T_RPL3-3U_GAL1, a cepa Uz3337 foi transformada. O transformante obtido foi aplicado a um meio de ágar YPD contendo nourseotricina, seguido por purificação de colônias cultivadas. A cepa purificada foi nomeada de cepa Uz3381. Foi confirmado que o transgene de cada uma das cepas selecionadas foi recombinado de forma heterogênea (1 cópia), e o gene GAL1 foi interrompido de forma homozigótica.
[Tabela 3] Fragmento de Sequência de iniciadores (5’-3’) DNA amplificado pUC-5U500_SUC2-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-loxP-HPH-loxP-5U_SUC2 5U500_SUC2 CTGGAATTCGCCCTTTTGAGGTTATAGGGGC SEQ ID NO: 71
TTAGCATC GACCCGTGGCTGCGAGTCAGTTTTTCCAGA SEQ ID NO: 72
AACCTCCATG Promotor HOR7 TCGCAGCCACGGGTCAAC SEQ ID NO: 73 TTTTATTATTAGTCTTTTTTTTTTTTGACAATA SEQ ID NO: 74
TCTG GAL2 ATGGCAGTTGAGGAGAACAATATG SEQ ID NO: 75 TTATTCTAGCATGGCCTTGTACCA SEQ ID NO: 76 Terminador DIT1 GCCATGCTAGAATAATAAAGTAAGAGCGCTA SEQ ID NO: 77
CATTGGTCTACC TTACTCCGCAACGCTTTTCTGAAC SEQ ID NO: 78 LoxP TGACGGTATCGATAAGCTTGATATC SEQ ID NO: 79 (incluindo ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTT SEQ ID NO: 80 sequência de ATACGACATCGTCGAATATGATTCAGGGTAA conectores) C Promotor CYC1 ACGACATCGTCGAATATGATTC SEQ ID NO: 81 TATTAATTTAGTGTGTGTATTTGTGTTTGTGT SEQ ID NO: 82
G HPH CACACTAAATTAATAATGAAAAAGCCTGAACT SEQ ID NO: 83
CACC TTTAGTAGACATGCACTATTCCTTTGCCCTC SEQ ID NO: 84
GG Terminador URA3 TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAGCTT SEQ ID NO: 85
CAATT GGGTAATAACTGATATAATTAAATTG SEQ ID NO: 86 LoxP ATTATACGAAGTTATTGACACCGATTATTTAA SEQ ID NO: 87 (incluindo AGCTG sequência de ATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGGTAATA SEQ ID NO: 88 conectores) ACTGATATAATTAAATTGAAGC 5U_SUC2 AAAGCTGCAGCATACGAGGAATGTGATTATA SEQ ID NO: 89
AATCCCTTTATG GCAGAATTCGCCCTTCATATACGTTAGTGAA SEQ ID NO: 90
AAGAAAAGCTTTTTG pUC19 AAGGGCGAATTCTGCAGATATCC SEQ ID NO: 91 AAGGGCGAATTCCAGCACACTG SEQ ID NO: 92 pUC-5U500_GAD1-P_TDH3-XaraB-T_DIT1-LoxP-T_CYC1-Cre-P_GAL1-T_LEU2-BSD- P_TEF1-LoxP-5U_GAD1 5U500_GAD1 ACGGCCAGTGAATTCGGCTGATGTAATGGTA SEQ ID NO: 93
TTGTTATTCAACC ATTTACCAGCATCAGCGCC SEQ ID NO: 94 Promotor TDH3 CTGATGCTGGTAAATTAGCGTTGAATGTTAG SEQ ID NO: 95
CGTCAAC TTTGTTTGTTTATGTGTGTT SEQ ID NO: 96 LParaB ACATAAACAAACAAAATGAATTTGGTCGAAA SEQ ID NO: 97
CCGC
AGCGCTCTTACTTTATTAGTATTTAATAGCTT SEQ ID NO: 98
GACCAGCGGC LCaraB ATGAACACTCTGGAGATATCAAAGGCG SEQ ID NO: 99 TCACCCTTTCTCGTTTATAGCATCCC SEQ ID NO: 100 LFaraB ATGAACTTGATCGAGACGAGTCAGG SEQ ID NO: 101 TCAGGATTTAACCGTTTCGCCCGC SEQ ID NO: 102 LSaraB ATGAACTTGGTTGAGATTGCACAAGC SEQ ID NO: 103 TCACTTCTCATCTTTTATCGCGGCG SEQ ID NO: 104 PLaraB ATGGAAATCTTGAAAATGAACATCG SEQ ID NO: 105 TTATATCACTTCACCAGCACGAGC SEQ ID NO: 106 MCaraB ATGGGTTTGATGAATGTCGCTGC SEQ ID NO: 107 CTACTCTGCTAATGCCGTACCAGC SEQ ID NO: 108 SSaraB ATGGACATGACCGCCGC SEQ ID NO: 109 AGCGCTCTTACTTTACTAGCCGTTGTAAGTC SEQ ID NO: 110
AACGCG PSaraB ATGGATCAGAACATCCGTCAAGCG SEQ ID NO: 111 CTACCCCCTCCCGTTTTCTATTAAATG SEQ ID NO: 112 CNaraB ATGGGTAACGTAAAGGAAACG SEQ ID NO: 113 TTAAACCAGGTTCTTCAAAGCGC SEQ ID NO: 114 Terminador DIT1 TAAAGTAAGAGCGCTACATTGGTCTACC SEQ ID NO: 115 TTACTCCGCAACGCTTTTCTGAAC SEQ ID NO: 116 LoxP TATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGCTTGC SEQ ID NO: 117 (incluindo AAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTT sequência de C conectores) ATAGCATACATTATACGAACGGTATGACACC SEQ ID NO: 118
GATTATTTAAAGCTGCAG Terminador CYC1 AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG SEQ ID NO: 119 TTAGTTATGTCACGCTTACATTCACG SEQ ID NO: 120 Cre GCGTGACATAACTAATCAATCACCATCTTCC SEQ ID NO: 121
AACAATC CAAGGAGAAAAAACCATGTCTAACTTGTTGA SEQ ID NO: 122
CTGTTC Promotor GAL1 GGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAG SEQ ID NO: 123 TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAGCTT SEQ ID NO: 124
CAATTTAATTATATCAGTTATTACCCACGGAT
TAGAAGCCGCCG Terminador URA3 GGGTAATAACTGATATAATTAAATTG SEQ ID NO: 125 TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAG SEQ ID NO: 126 BSD TTAGCCCTCCCACACATAACCAG SEQ ID NO: 127 CATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAG SEQ ID NO: 128 Promotor TEF1 CCCTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTA SEQ ID NO: 129
ATG ATAGCATACATTATACGAAGTTATCCCACAC SEQ ID NO: 130
ACCATAGCTTCAAAATG LoxP TACGAACGGTAAGGGAAAGATATGAG SEQ ID NO: 131 (incluindo ATAGCATACATTATACGAAGTTATCCCACAC SEQ ID NO: 132 sequência de ACCATAGCTTCAAAATG conectores) 5U_GAD1 TCTAGTTGGTTCTTGACATTTTTCAAATAATC SEQ ID NO: 133 TCCCCGGGTACCGAGTATTCCTTGTTTTGTT SEQ ID NO: 134
CAGCCTG pUC19 ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCG SEQ ID NO: 135 GAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC SEQ ID NO: 136 pUC19-5U_ATH1-P_TDH3-XaraD-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71- 3U_ATH1 5U_ATH1 CTGGAATTCGCCCTTGTATGACCACATTCTA SEQ ID NO: 137
TACTGAGAAGAGTGCC TAACATTCAACGCTATATTGGAATGAGGAAA SEQ ID NO: 138
TTTCGGTAAAAAC Promotor TDH3 TAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAAC SEQ ID NO: 139 TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC SEQ ID NO: 140 LParaD ACATAAACAAACAAAATGTTGGAAGCATTGA SEQ ID NO: 141
AGCAAG AGCGCTCTTACTTTATTACTTTCTAACAGCGT SEQ ID NO: 142
GATCTTTTGAATG BLaraD1 ACATAAACAAACAAAATGTTGGAGCAGTTAA SEQ ID NO: 143
AGGAAGAAG AGCGCTCTTACTTTATTATTTCTGACCGTAAT SEQ ID NO: 144
AGGCATTCTTAC BLaraD2 ACATAAACAAACAAAATGTTGGAAAGCCTAA SEQ ID NO: 145
AGGAACAAG AGCGCTCTTACTTTATTATTGGCCATAGTATG SEQ ID NO: 146
CATCAGCTC AHaraD ATGCTTGAACAGTTGAAGAAAGAAG SEQ ID NO: 147 TCATTTACCTTGACCATAATAGGC SEQ ID NO: 148 AParaD ATGCTAGAAAAGTTAAAGCAGG SEQ ID NO: 149 TCATTGACCGTAGTAAGCATTCTC SEQ ID NO: 150 BAaraD ATGTTGGAAGAATTAAAGAAAG SEQ ID NO: 151 TCACTTCGTCTGACCGTAGTAAGC SEQ ID NO: 152 CS17araD ATGCTGGAACAACTTAAGGAGGAAG SEQ ID NO: 153 TCAGTGCTTATTTTTTTGACCGTAG SEQ ID NO: 154 FParaD ATGTTGTTGGAAAAGCTGAGGCTGG SEQ ID NO: 155 TCAAGCTTGCCCGTAGTAGGC SEQ ID NO: 156 LIaraD ATGTTAGAAGCCCTAAAGGAAG SEQ ID NO: 157 TCACTTTTGACCGTAGTAAGCATC SEQ ID NO: 158 MSaraD ATGTTGGAGGAACTAAAGCAGCAGG SEQ ID NO: 159 TCATTTTTTCTGACCGTAGTAAGC SEQ ID NO: 160 SSaraD ATGCTAGAAGAGTTAAAGCAAGAGG SEQ ID NO: 161 TCAGGCTTTTTGGCCATAGTAAGC SEQ ID NO: 162 Terminador DIT1 GCCATGCTAGAATAATAAAGTAAGAGCGCTA SEQ ID NO: 163
CATTGGTCTACC TTACTCCGCAACGCTTTTCTGAAC SEQ ID NO: 164 LoxP TGACGGTATCGATAAGCTTGATATC SEQ ID NO: 165 (incluindo ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTT SEQ ID NO: 166 sequência de ATACGACATCGTCGAATATGATTCAGGGTAA conectores) C Promotor CYC1 ACGACATCGTCGAATATGATTC SEQ ID NO: 167 TATTAATTTAGTGTGTGTATTTGTGTTTGTGT SEQ ID NO: 168
G G418 ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC SEQ ID NO: 169 TTTAGTAGACATGCATTACAACCAATTAACCA SEQ ID NO: 170
ATTCTG
Terminador URA3 TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAGCTT SEQ ID NO: 171
CAATT GGGTAATAACTGATATAATTAAATTG SEQ ID NO: 172 LoxP ATTATACGAAGTTATTGACACCGATTATTTAA SEQ ID NO: 173 (incluindo AGCTG sequência de ATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGGTAATA SEQ ID NO: 174 conectores) ACTGATATAATTAAATTGAAGC 3U_ATH1 AAAGCTGCAGCATACATGAAATGATGCATAT SEQ ID NO: 175
AAGTAGCGC GCAGAATTCGCCCTTAGTGTTTGCTTAATTTA SEQ ID NO: 176
CATAGGACCC pUC19 AAGGGCGAATTCTGCAGATATCC SEQ ID NO: 177 AAGGGCGAATTCCAGCACACTG SEQ ID NO: 178 pUC-5U_PDC6-P_HOR7-XaraA-T_RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei- T_CYC1-LoxP71-3U_PDC6 5U_PDC6 CTACCCTATTTTCTCTTACCAGCGAAC SEQ ID NO: 179 GACCCGTGGCTGCGATTTTGGCCAAATGCC SEQ ID NO: 180
ACAG Promotor HOR7 TCGCAGCCACGGGTCAAC SEQ ID NO: 181 TTTTATTATTAGTCTTTTTTTTTTTTGACAATA SEQ ID NO: 182
TCTG LParaA AGACTAATAATAAAAATGTTGTCCGTTCCAG SEQ ID NO: 183
ATTATGAATTTTG TTGCTCTCAATCCGCTTATTTTAAGAAAGCCT SEQ ID NO: 184
TTGTCATACCAAC BLaraA2 AGACTAATAATAAAAATGTTGACCACTGGTA SEQ ID NO: 185
AGAAGGAG TTGCTCTCAATCCGCTTATTTGATCACGACG SEQ ID NO: 186
TATTCAAGATC BLaraA1 AGACTAATAATAAAAATGATCCAAGCCAAAA SEQ ID NO: 187
CCCATG TTGCTCTCAATCCGCTTAGAATTTTCTCAATC SEQ ID NO: 188
TGTAAGCCGC CAaraA1 AGACTAATAATAAAAATGCTAAAGAACAAGA SEQ ID NO: 189
AGCTAGAATTTTG TTGCTCTCAATCCGCTTACCTTGATGTCTCTT SEQ ID NO: 190
TTATAATGTCTCTCAA CAaraA2 AGACTAATAATAAAAATGTTGGAAAACAAGA SEQ ID NO: 191
AGATGGAG TTGCTCTCAATCCGCTTATTTTGTGGTCTTTT SEQ ID NO: 192
CTATTATGTCTCTTAGTTTAG SRaraA AGACTAATAATAAAAATGTTGGAAGTCAAGA SEQ ID NO: 193
ATTACGAATTCTG TTGCTCTCAATCCGCTCAGCAGATTTCAACC SEQ ID NO: 194
AAGTTGAC BAaraA ATGTTAACAATAAAGAAGTATCAATTCTGG SEQ ID NO: 195 TCATCTATCGAATTTCCTAGCGATG SEQ ID NO: 196 BHaraA ATGTTGCAAACGAAACCGTACAC SEQ ID NO: 197 TCACTTGAATAACCTTCTGAAG SEQ ID NO: 198 LLaraA ATGTTGGAAAACACTCAAAAGG SEQ ID NO: 199 TCAACCAAGGTTGATGTACGTC SEQ ID NO: 200
LSaraA ATGCTTAATACGGAAAACTACG SEQ ID NO: 201 TCATTTGATATTCACGTACGTC SEQ ID NO: 202 MCaraA ATGTTGCAGGTAAAAGAATATG SEQ ID NO: 203 TCAACAAATTTCCACTAGTTCC SEQ ID NO: 204 OOaraA ATGCTTAAGACAAATGACTACAAG SEQ ID NO: 205 TCACTCGGAATCAACAGCGAAAGTC SEQ ID NO: 206 Terminador GCGGATTGAGAGCAAATCGTTAAGT SEQ ID NO: 207 RPL41B CTATACAGCGGAATTAGAGGCATAGCGGCA SEQ ID NO: 208
AACTAAG LoxP ATAGCATACATTATACGAAGTTATCCCACAC SEQ ID NO: 209 (incluindo ACCATAGCTTCAAAATG sequência de ATAATGTATGCTATACGAACGGTAAGGGAAA SEQ ID NO: 210 conectores) GATATGAGCTATACAGCG Promotor TEF1 CCCACACACCATAGCTTCAAAATG SEQ ID NO: 211 ATCACCGAAATCTTCATGTTTAGTTCCTCACC SEQ ID NO: 212
TTG SAT CAAGGTGAGGAACTAAACATGAAGATTTCGG SEQ ID NO: 213
TGAT TTAGGCGTCATCCTGTGCTC SEQ ID NO: 214 Terminador LEU2 CAGGATGACGCCTAAAAAGATTCTCTTTTTTT SEQ ID NO: 215
ATGATATTTGTAC AGGAATCATAGTTTCATGATTTTCTGTTAC SEQ ID NO: 216 Promotor GAL1 GAAACTATGATTCCTACGGATTAGAAGCCGC SEQ ID NO: 217
CG GGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAG SEQ ID NO: 218 Cre CAAGGAGAAAAAACCATGTCTAACTTGTTGA SEQ ID NO: 219
CTGTTC GCGTGACATAACTAATCAATCACCATCTTCC SEQ ID NO: 220
AACAATC Terminador CYC1 TTAGTTATGTCACGCTTACATTCACG SEQ ID NO: 221 AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG SEQ ID NO: 222 LoxP ATAGCATACATTATACGAACGGTATGACACC SEQ ID NO: 223 (incluindo GATTATTTAAAGCTGCAG sequência de TATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGCTTGC SEQ ID NO: 224 conectores) AAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTT
C 3U_PDC6 TGTTATAGAGTTCACACCTTATTCACATACTT SEQ ID NO: 225
TTTC GTGAACTCTATAACAGTATGCTGCAGCTTTA SEQ ID NO: 226
AATAATCGGTG pUC19 AAGGGCGAATTCTGCAGATATCC SEQ ID NO: 227 AAGGGCGAATTCCAGCACACTG SEQ ID NO: 228 pUC19-5U_GAL1-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-HPH-T_URA3-LoxP71- 3U_GAL1 5U_GAL1 TGGCTACAGAATCATAAGTTGAATTCGAC SEQ ID NO: 229 GACCCGTGGCTGCGAGTTTTTTCTCCTTGAC SEQ ID NO: 230
GTTAAAGTATAGAGG Promotor HOR7 TCGCAGCCACGGGTCAAC SEQ ID NO: 231 CTCCTCAACTGCCATTTTTTATTATTAGTCTT SEQ ID NO: 232
TTTTTTTTTTGACAATATCTG GAL2 ATGGCAGTTGAGGAGAACAATATG SEQ ID NO: 233
TTATTCTAGCATGGCCTTGTACCAC SEQ ID NO: 234 Terminador DIT1 GCCATGCTAGAATAATAAAGTAAGAGCGCTA SEQ ID NO: 235
CATTGGTCTACC CTATACAGCGGAATTTTACTCCGCAACGCTT SEQ ID NO: 236
TTC LoxP ATTATACGAAGTTATACGACATCGTCGAATAT SEQ ID NO: 237 (incluindo GATTCAG sequência de ATAATGTATGCTATACGAACGGTAAGGGAAA SEQ ID NO: 238 conectores) GATATGAGCTATACAGCG Promotor CYC1 ACGACATCGTCGAATATGATTCAG SEQ ID NO: 239 TATTAATTTAGTGTGTGTATTTGTGTTTGTGT SEQ ID NO: 240
G HPH CACACTAAATTAATAATGAAAAAGCCTGAACT SEQ ID NO: 241
CACC TTTAGTAGACATGCACTATTCCTTTGCCCTC SEQ ID NO: 242
GG Terminador URA3 TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAGCTT SEQ ID NO: 243
CAATT GGGTAATAACTGATATAATTAAATTG SEQ ID NO: 244 LoxP ATTATACGAAGTTATTGACACCGATTATTTAA SEQ ID NO: 245 (incluindo AGCTG sequência de ATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGGTAATA SEQ ID NO: 246 conectores) ACTGATATAATTAAATTGAAGC 3U_GAL1 CTACTCATAACTTTAGCATCACAAAATACGC SEQ ID NO: 247 GTGAAATTAAGAAAGGAGTTTTATACAGATG SEQ ID NO: 248
ATACC pUC19 ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCG SEQ ID NO: 249 GAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC SEQ ID NO: 250 pUC19-5U_GAL1-P_HOR7-BlaraA2-T_RPL41B-T_DIT1-BlaraD1-P_TDH3-LoxP66- P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-P_FBA1-SsaraB-T_RPL3- 3U_GAL1 5U_GAL1 TGGCTACAGAATCATAAGTTGAATTCGAC SEQ ID NO: 251 GACCCGTGGCTGCGAGTTTTTTCTCCTTGAC SEQ ID NO: 252
GTTAAAGTATAGAGG Promotor HOR7 TCGCAGCCACGGGTCAAC SEQ ID NO: 253 CTCCTCAACTGCCATTTTTTATTATTAGTCTT SEQ ID NO: 254
TTTTTTTTTTGACAATATCTG BLaraA2 AGACTAATAATAAAAATGTTGACCACTGGTA SEQ ID NO: 255
AGAAGGAG TTGCTCTCAATCCGCTTATTTGATCACGACG SEQ ID NO: 256
TATTCAAGATC SRaraA AATACATATTCAAAATGGACATGACCGCCGC SEQ ID NO: 257
GGAAATAGTCAGAAATG TTCTAACAAAACTTCTAGCCGTTGTAAGTCAA SEQ ID NO: 258
CGCG Terminador GCGGATTGAGAGCAAATCGTTAAGT SEQ ID NO: 259 RPL41B CTATACAGCGGAATTAGAGGCATAGCGGCA SEQ ID NO: 260
AACTAAG Terminador DIT1 GCCATGCTAGAATAATAAAGTAAGAGCGCTA SEQ ID NO: 261
CATTGGTCTACC CTATACAGCGGAATTTTACTCCGCAACGCTT SEQ ID NO: 262
TTC BLaraD1 TTCTAACAAAACTTCTTATTTCTGACCGTAAT SEQ ID NO: 263
AGGCATTCTTAC TAATACATATTCAAAATGTTGGAGCAGTTAAA SEQ ID NO: 264
GGAAGAAGTC Promotor TDH3 TAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAAC SEQ ID NO: 265 TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC SEQ ID NO: 266 LoxP TATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGCTTGC SEQ ID NO: 267 (incluindo AAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTT sequência de C conectores) ATAGCATACATTATACGAACGGTATGACACC SEQ ID NO: 268
GATTATTTAAAGCTGCAG Terminador CYC1 TTAGTTATGTCACGCTTACATTCACG SEQ ID NO: 269 AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG SEQ ID NO: 270 Crei GCGTGACATAACTAATCAATCACCATCTTCC SEQ ID NO: 271
AACAATC CAAGGAGAAAAAACCATGTCTAACTTGTTGA SEQ ID NO: 272
CTGTTC Promotor GAL1 GGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAG SEQ ID NO: 273 TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAGCTT SEQ ID NO: 274
CAATTTAATTATATCAGTTATTACCCACGGAT
TAGAAGCCGCCG Promotor TEF1 CCCACACACCATAGCTTCAAAATG SEQ ID NO: 275 GTTTAGTTCCTCACCTTGTCGTATTATACTAT SEQ ID NO: 276
G SAT ATGAAGATTTCGGTGATCCCTG SEQ ID NO: 277 TTAGGCGTCATCCTGTGCTC SEQ ID NO: 278 Terminador LEU2 AAAGATTCTCTTTTTTTATGATATTTGTACATA SEQ ID NO: 279
AACTTTATAAATG GGAATCATAGTTTCATGATTTTCTGTTAC SEQ ID NO: 280 LoxP TACGAACGGTAAGGGAAAGATATGAG SEQ ID NO: 281 (incluindo ATAGCATACATTATACGAAGTTATCCCACAC SEQ ID NO: 282 sequência de ACCATAGCTTCAAAATG conectores) 3U_GAL1 CTACTCATAACTTTAGCATCACAAAATACGC SEQ ID NO: 283 GTGAAATTAAGAAAGGAGTTTTATACAGATG SEQ ID NO: 284
ATACC pUC19 ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCG SEQ ID NO: 285 GAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC SEQ ID NO: 286
1.16. Teste de fermentação em frasco
[0127] Uma cepa de teste foi inoculada em um frasco defletor de 100 ml no qual 20 ml de um meio líquido YPD com uma concentração de glicose de 20 g/L (extrato de levedura: 10 g/L, peptona: 20 g/L e glicose: 20 g/L) foram dispensados, seguido por cultura a 30 °C e 120 rpm por 24 horas. Depois de coletar as células, a cepa foi inoculada em uma placa de poço profundo de 24 orifícios na qual 4,9 ml de um meio para produzir etanol foram dispensados (concentração de bactérias: 0,3 g de células secas/L), seguido por um teste de fermentação agitando-se a cultura (230 rpm, amplitude 25 mm) a uma temperatura de 31 °C. Cada área de processamento da placa de poço profundo de 24 orifícios foi coberta por uma tampa de silício com uma válvula de retenção, de modo que um gás de dióxido de carbono gerado escape para o ar externo, mas o oxigênio não entra do lado de fora, mantendo assim cada área de processamento para ser anaeróbica.
[0128] As concentrações de glicose, arabinose, xilose e etanol no líquido de fermentação foram medidas usando HPLC (Prominence, disponível na SHIMADZU CORPORATION) sob as seguintes condições. Coluna: AminexHPX-87H Fase móvel: H2SO4 0,01 N Taxa de fluxo: 0,6 ml/min Temperatura: 30 °C Detector: Detector de índice refrativo diferencial RID-10A
2. Resultados
2.1. Triagem de novo gene araB
[0129] A concentração de etanol e a concentração de arabinose no meio foram medidas para as cepas Uz2861 a 2871 e 2875 produzidas em Capítulo 1.10. acima, e nenhum incremento de etanol e a diminuição em arabinose foram calculados. A Tabela 4 mostra os resultados. [Tabela 4] araB Nome da cepa Concentraçã Concentraçã Increment Diminuiçã introduzido o de etanol o de o de o de (g/L) arabinose etanol arabinose (g/L) (g/L) (g/L) - Uz2839 9,9 37,6 0,0 0 (Cepa controle) LParaB Uz2875 15,1 27,4 5,2 10,2 LCaraB Uz2863 13,9 28,4 4,0 9,2 LFaraB Uz2864 14,4 27,2 4,5 10,4 LSaraB Uz2865 14,2 30,3 4,3 7,3
PLaraB Uz2866 13,3 30,0 3,4 7,6 TSaraB Uz2867 15,8 25,4 5,9 12,2 CNaraB Uz2861 15,9 28,3 6,0 9,3 SSaraB Uz2870 15,3 28,1 5,4 9,5 PSaraB Uz2871 15,1 29,2 5,2 8,4 BCaraB Uz2868 12,3 36,6 2,4 1 MCaraB Uz2869 16,9 26,0 7,0 11,6
[0130] Os resultados mostrados na Tabela 4 foram obtidos com uma composição de meio de glicose: 30 g/L, arabinose: 40 g/L e extrato de levedura: 10 g/L a uma temperatura de fermentação de 31 °C. Além disso, a concentração de cada substância foi uma média de valores medidos para três cepas recombinantes que foram obtidas independentemente com um tempo de fermentação de 48 horas.
[0131] Como mostrado na Tabela 4, em muitas das cepas Uz2861 a Uz2871 com um novo gene araB introduzido, a quantidade de etanol produzida foi significativamente menor do que na cepa Uz2875 com um gene araB conhecido derivado de Lactobacilo plantarum introduzido. Entretanto, foi revelado que a cepa Uz2867, a cepa Uz2861, a cepa Uz2870, a cepa Uz2871 e a cepa Uz2869 mostraram uma produtividade de etanol e/ou uma assimilação de arabinose superior à da cepa Uz2875 na qual um gene araB conhecido foi introduzido, como mostrado na Tabela
4.
[0132] A partir destes resultados, foi revelado que o gene araB de Thermoactinomyces sp. (Número de Acesso NCBI: WP_049720024, SEQ ID NO: 7 e 8), o gene araB de Clostridium nexile (Número de Acesso NCBI: CDC22812, SEQ ID NO: 9 e 10), o gene araB de Selenomonas sp. oral taxon (Número de Acesso NCBI: WP_050342034, SEQ ID NO: 11 e 12), o gene araB de Paenibacillus sp. (Número de Acesso NCBI: WP_039877980, SEQ ID NO: 13 e 14) e o gene araB de Megasphaera cerevisiae (Número de Acesso NCBI: WP_048515518, SEQ ID NO: 15 e 16) codifica L-ribuloquinase capaz de alcançar excelente produtividade de etanol e/ou excelente assimilação de arabinose quando confere a capacidade de metabolizar a arabinose para a levedura.
2.2. Triagem de novo gene araD
[0133] A concentração de etanol e a concentração de arabinose no meio foram medidas para as cepas Uz3003, 3010, 3011 e 3121 a 3129 produzidas no Capítulo 1.12. acima, para calcular nenhum incremento de etanol e a diminuição em arabinose. A Tabela 5 mostra os resultados. [Tabela 5] araD Nome da cepa Concentraçã Concentraçã Increment Diminuiçã introduzido o de etanol o de o de o de (g/L) arabinose etanol arabinose (g/L) (g/L) (g/L) - Uz2943 16,0 38,8 0,0 0,0 (Cepa controle) LParaD Uz3011 25,0 18,6 9,0 20,2 BLaraD1 Uz3003 25,1 18,5 9,1 20,3 BLaraD2 Uz3010 17,1 37,0 1,1 1,8 AHaraD Uz3121 24,5 18,3 8,5 20,5 AParaD Uz3122 25,1 17,9 9,2 20,9 BAaraD Uz3123 24,7 18,3 8,7 20,5 CS17araD Uz3124 26,0 14,0 10,0 24,8 FParaD Uz3126 10,8 36,0 0,2 2,8 LIaraD Uz3127 24,0 5,4 8,0 33,4 MSaraD Uz3128 24,4 5,3 8,4 33,5 SSaraD Uz3129 14,0 28,9 0,8 9,9
[0134] Os resultados mostrados na Tabela 5 foram obtidos com uma composição de meio de glicose: 30 g/L, arabinose: 40 g/L e extrato de levedura: 10 g/L a uma temperatura de fermentação de 31 °C. Além disso, a concentração de cada substância foi uma média de valores medidos para três a cinco cepas recombinantes que foram obtidas independentemente com um tempo de fermentação de 48 horas.
[0135] Como mostrado na Tabela 5, em algumas da cepa Uz3003, da cepa UZ3010 e das cepas Uz3121 a 3129 com um novo gene araD introduzido, a quantidade de etanol produzida foi significativamente menor do que na cepa Uz3011 com um gene araD conhecido derivado de Lactobacilo plantarum introduzido, e a quantidade de etanol produzida não aumentou, embora a assimilação de arabinose foi excelente. Entretanto, foi revelado que a cepa Uz3003, a cepa Uz3122 e a cepa Uz3124 mostraram uma produtividade de etanol e/ou uma assimilação de arabinose superior à da cepa Uz3011 com um gene araD conhecido introduzido, como mostrado na Tabela 5.
[0136] A partir destes resultados, foi revelado que o gene araD de Bacillus licheniformis (Número de Acesso NCBI: WP_003182291, SEQ ID NO: 17 e 18), o gene araD de Alkalibacterium putridalgicola (Número de Acesso NCBI: WP_091486828, SEQ ID NO: 19 e 20) e o gene araD de Carnobacterium sp. 17-4 (Número de Acesso NCBI: WP_013709965, SEQ ID NO: 21 e 22) codifica L-ribulose-5-fosfato-4- epimerase capaz de alcançar excelente produtividade de etanol e/ou excelente assimilação de arabinose quando confere a capacidade de metabolizar a arabinose à levedura.
[0137] Em particular, embora um gene BLaraD1 (número de acesso: WP_003182291) e um gene BLaraD2 (número de acesso: WP_011198185) foram mencionados como candidatos do gene araD derivado de Bacillus licheniformis, neste exemplo, foi revelado que apenas o gene BLaraD1 (número de acesso: WP_003182291) funcionou em leveduras, enquanto que o gene BLaraD2 (número de acesso: WP_011198185) não funcionou.
2.3. Triagem de novo gene araA
[0138] A concentração de etanol e a concentração de arabinose no meio foram medidas para as cepas Uz3181 a 3194 produzidas no Capítulo 1.14. acima, para calcular nenhum incremento de etanol e a diminuição em arabinose. A Tabela 6 mostra os resultados. [Tabela 6] araA introduzido Nome da Concentração Concentração Incremento Diminuição cepa de etanol (g/L) de arabinose de etanol de (g/L) (g/L) arabinose (g/L) - Uz3151 10,5 39,7 0,0 0,0 (Cepa controle) LParaA Uz3181 17,9 23,5 7,5 16,1 CAaraA1 Uz3184 21,5 13,4 11,1 26,2 BLaraA2 Uz3010 20,6 16,1 10,1 23,5 SRaraA Uz3188 19,8 18,7 9,3 21,0 LLaraA Uz3191 17,9 23,0 7,5 16,6
MCaraA Uz3193 17,9 23,0 7,5 16,6 OOaraA Uz3194 15,7 31,1 5,3 8,6 BLaraA1 Uz3183 17,0 35,2 6,5 4,4 CAaraA2 Uz3186 19,0 32,7 9,0 7,0 BAaraA Uz3189 16,0 38,7 5,5 1,0 BHaraA Uz3190 16,8 37,4 6,3 2,3 LSaraA Uz3192 20,7 28,6 10,2 11,1
[0139] Os resultados mostrados na Tabela 6 foram obtidos com uma composição de meio de glicose: 30 g/L, arabinose: 40 g/L e extrato de levedura: 10 g/L a uma temperatura de fermentação de 31 °C. Além disso, a concentração de cada substância foi uma média de valores medidos para três cepas recombinantes que foram obtidas independentemente com um tempo de fermentação de 24 horas.
[0140] Como mostrado na Tabela 6, em algumas das cepas Uz3181 a 3194 produzidas no Capítulo 1.14. acima, a quantidade de etanol produzida foi significativamente menor do que na cepa Uz3181 com um gene araA conhecido derivado de Lactobacilo plantarum introduzido, a quantidade de etanol produzida não aumentou, embora a assimilação de arabinose foi excelente, e a assimilação de arabinose foi deficiente. Entretanto, foi revelado que, das cepas Uz3181 a 3194 produzidas no Capítulo 1.14. acima, a cepa Uz3010, a cepa Uz3188 e a cepa Uz3192 com um novo gene araA introduzido mostraram uma produtividade de etanol e/ou uma assimilação de arabinose superior à da cepa Uz3181 com um gene araA conhecido introduzido, como mostrado na Tabela 6. O gene araA introduzido na cepa Uz3184 e na cepa Uz3186 é conhecido no documento US 8.753.862 B2.
[0141] A partir destes resultados, foi revelado que o gene araA de Bacillus licheniformis (Número de Acesso NCBI: WP_011198012, SEQ ID NO: 1 e 2), o gene araA de Selenomonas ruminantium (Número de Acesso NCBI: WP_072306024, SEQ ID NO: 3 e 4) e o gene araA de Lactobacilo sakei (Número de Acesso NCBI: WP_011375537, SEQ ID NO: 5 e 6) codifica L-arabinose isomerase capaz de alcançar excelente produtividade de etanol e/ou excelente assimilação de arabinose quando confere a capacidade de metabolizar a arabinose à levedura.
2.4. Combinação da técnica de assimilação de xilose e da técnica de assimilação de arabinose
[0142] A concentração de etanol, a concentração de arabinose e a concentração de xilose no meio foram medidas para a cepa Uz3380 e a cepa Uz3381 cepa obtidas introduzindo genes de assimilação de arabinose (genes GAL2, araA, araB e araD) em uma cepa tendo a capacidade para assimilar a xilose, que foi produzida no Capítulo 1.15. acima, para calcular nenhum incremento de etanol e a diminuição em arabinose. A Tabela 7 mostra os resultados. [Tabela 7] araA Nome Concentraçã Concentraçã Concentraçã Increment Diminuiçã introduzid da cepa o de etanol o de o de xilose o de o de o (g/L) arabinose (g/L) etanol arabinose (g/L) (g/L) (g/L) - Uz3337 32,7 18,5 6,9 0,0 0,0 (Cepa controle ) BLaraA2 Uz3380 36,8 9,5 7,7 4,1 9,1 SRaraA Uz3381 37,0 8,3 8,1 4,3 10,2
[0143] Os resultados mostrados na Tabela 7 foram obtidos com uma composição de meio de glicose 60 g/L, xilose 20 g/L, arabinose 20 g/L e extrato de levedura 10 g/L a uma temperatura de fermentação de 31 °C. Além disso, a concentração de cada substância foi uma média de valores medidos para quatro cepas recombinantes que foram obtidas independentemente com um tempo de fermentação de 48 horas.
[0144] Como mostrado na Tabela 7, foi revelado que a cepa Uz3380 e a cepa Uz3381 produzidas no Capítulo 1.15. acima metabolizaram a glicose, a xilose e a arabinose e produziram etanol a uma alto nível.
[0145] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados neste relatório descritivo são incorporados neste relatório descritivo por referência em sua totalidade.

Claims (9)

REIVINDICAÇÕES
1. Levedura recombinante CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um grupo de genes metabólicos de L-arabinose incluindo um gene L-arabinose isomerase, um gene L-ribuloquinase e um gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase introduzidos na mesma, em que o gene L-arabinose isomerase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80% ou mais com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4 e 6 e tendo atividade de L-arabinose isomerase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 sob condições rigorosas e tendo atividade de L-arabinose isomerase.
2. Levedura recombinante CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um grupo de genes metabólicos de L-arabinose incluindo um gene L-arabinose isomerase, um gene L-ribuloquinase e um gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase introduzidos na mesma, em que o gene L-ribuloquinase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 e 16; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80% ou mais com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 e 16 e tendo atividade de L- ribuloquinase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13 e 15 sob condições rigorosas e tendo atividade de L-ribuloquinase.
3. Levedura recombinante CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um grupo de genes metabólicos de L-arabinose incluindo um gene L-arabinose isomerase, um gene L-ribuloquinase e um gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase introduzidos na mesma, em que o gene L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 20 e 22; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80% ou mais com uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 18, 20 e 22 e tendo atividade de L-ribulose-5- fosfato-4-epimerase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 17, 19 e 21 sob condições rigorosas e tendo atividade de L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase.
4. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que superexpressa um gene galactose permease.
5. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene galactose permease é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e tendo atividade de galactose permease; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar à sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 23 sob condições rigorosas e tendo atividade de galactose permease.
6. Levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que um gene xilose isomerase é introduzido.
7. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene xilose isomerase é um gene que codifica qualquer uma das proteínas (a) a (c) abaixo: (a) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; (b) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo uma identidade de 80% ou mais com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 e tendo atividade de xilose isomerase; e (c) uma proteína codificada por uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica complementar à sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 25 sob condições rigorosas e tendo atividade de xilose isomerase.
8. Método para produzir etanol, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma etapa de cultivar a levedura recombinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em um meio compreendendo arabinose para a fermentação de etanol.
9. Método para produzir etanol, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio compreende celulose, e pelo menos a sacarificação da celulose prossegue simultaneamente com a fermentação de etanol.
BR112021012497-7A 2018-12-25 2019-12-24 Levedura recombinante e método para produzir etanol usando a mesma BR112021012497A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-241823 2018-12-25
JP2018241823A JP2020099308A (ja) 2018-12-25 2018-12-25 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
PCT/JP2019/050466 WO2020138020A1 (ja) 2018-12-25 2019-12-24 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021012497A2 true BR112021012497A2 (pt) 2021-09-08

Family

ID=71125755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021012497-7A BR112021012497A2 (pt) 2018-12-25 2019-12-24 Levedura recombinante e método para produzir etanol usando a mesma

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220073896A1 (pt)
JP (1) JP2020099308A (pt)
CN (1) CN113272438A (pt)
BR (1) BR112021012497A2 (pt)
WO (1) WO2020138020A1 (pt)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118207268A (zh) * 2024-05-22 2024-06-18 中国海洋大学 一种催化琼脂糖同时生产新琼三糖和d-塔格糖的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7846712B2 (en) * 2006-06-01 2010-12-07 Alliance For Sustainable Energy, Llc L-arabinose fermenting yeast
DE102007016534B4 (de) * 2007-04-05 2019-03-28 Butalco Gmbh Neuer Expressionsvektor von Codon-optimierten Genen eines Arabinose-Stoffwechselweges zur Arabinose-Umsetzung in Hefe
WO2009011591A2 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 Royal Nedalco B.V. Novel arabinose-fermenting eukaryotic cells
KR20100053294A (ko) * 2008-11-12 2010-05-20 건국대학교 산학협력단 신규 ｌ-아라비노스 이성화효소 및 이를 이용한 ｌ-리불로스의 생산방법
WO2011078262A1 (ja) * 2009-12-22 2011-06-30 株式会社豊田中央研究所 キシロースイソメラーゼ及びその利用
WO2011131667A1 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Cell suitable for fermentation of a mixed sugar composition
PL3250698T3 (pl) * 2015-01-28 2020-06-29 Dsm Ip Assets B.V. Sposób enzymatycznej hydrolizy materiału lignocelulozowego i fermentacji cukrów

Also Published As

Publication number Publication date
US20220073896A1 (en) 2022-03-10
JP2020099308A (ja) 2020-07-02
CN113272438A (zh) 2021-08-17
WO2020138020A1 (ja) 2020-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114774477B (zh) 使用了重组酵母的乙醇的制造方法
JP5590140B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
BR112021012497A2 (pt) Levedura recombinante e método para produzir etanol usando a mesma
CA3125212C (en) Mutant gene associated with improvement in ethanol productivity via ethanol fermentation and method for producing ethanol using the same
US10017788B2 (en) Recombinant yeast and method for producing ethanol using the same
JP6879111B2 (ja) 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
US20190106719A1 (en) Recombinant yeast and method for producing ethanol using the same
WO2020032233A1 (ja) 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法
JP6447583B2 (ja) 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法
JP7298674B2 (ja) エタノール発酵によるエタノール生産性の向上に関与する変異遺伝子及びこれを用いたエタノールの製造方法
JP7298673B2 (ja) エタノール発酵によるエタノール生産性の向上に関与する変異遺伝子及びこれを用いたエタノールの製造方法
US11193113B2 (en) Transgenic yeast and method for producing ethanol using the same