CN117384871B - 一种热稳定性提高的乙醛脱氢酶及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的乙醛脱氢酶及其基因和应用。本发明通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ALDH序列进行S273N，I368L，V425Y突变，得到了突变体ALDH4M，该突变体的耐热性提高10℃，在55℃温度下保持5min仍维持60%酶活，而ALDH在45℃下5min仅能维持50%的酶活；本发明的乙醛脱氢酶ALDH4M具有以下性质：最适pH8.0‑9.0；具有良好的热稳定性。本发明扩大了乙醛脱氢酶基因的资源，也为乙醇代谢过程中乙醛的转化提供了优良的乙醛脱氢酶，在制作解酒饮品方面具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的乙醛脱氢酶及其基因和应用。
背景技术
乙醛（CH3CHO）是乙醇的代谢物，它广泛存在于众多食品、环境和过量饮酒者体内。高剂量（40-1000 μmol/L）的乙醛会对哺乳动物细胞产生较高毒性，诱变性以及致癌性。
乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是广泛存在于人和动物的肝脏细胞、植物细胞和微生物细胞中的一种氧化还原酶，可在NAD(P)+存在的条件下催化乙醛脱氢生成乙酸。可以将乙醇代谢后产生的乙醛代谢为乙酸并进入TCA 循环，生成无害的二氧化碳和水。乙醛脱氢酶有三大作用：①具有解酒功能。该酶为酒精在肝脏中代谢的关键酶，肝细胞通过乙醛脱氢酶的作用，迅速将酒精分解出的乙醛氧化成乙酸，最后分解为二氧化碳和水排出体外，这个过程为酒精消耗过程，即解酒过程；②能保护心脏细胞。加入乙醛脱氢酶的药物能够补充 ALDH 而减轻心肌缺血/再灌注损伤，减少缺氧而导致的心肌细胞凋亡；③可以保护肝脏细胞，减少肝癌的发生几率。乙醛是酒精代谢过程中对人体危害最大的物质，而乙醛脱氢酶能快速分解乙醛。
关于乙醛脱氢酶的研究，已报道了该酶的诱导剂、激活剂、抑制剂并从不同来源的微生物中分离出多种乙醛脱氢酶基因，其中，大多数乙醛脱氢酶的pH稳定性以及热稳定性较差，大多超过40℃时酶活急剧下降。目前，工业化的ALDH主要从动物的胰腺、肝脏或肝细胞线粒体中提取，由于来源少、提取难度大、产量较低、成本较高，因此尚未得到广泛应用。所以采取微生物发酵的方式获取ALDH是一种绿色环保且高效的方法。通过改造微生物生产ALDH，并对其酶学性质进行相关研究，进而开发出高活性的ALDH。综上所述，克隆并分离稳定性较好的、具有潜在应用价值的乙醛脱氢酶基因，无论是从扩大基因资源还是实际生产应用的角度都具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种能高效应用的乙醛脱氢酶突变体，它具有耐高温，较宽的pH稳定性等优点。
一方面，本发明提供了一种热稳定性提高的乙醛脱氢酶ALDH4M，所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有90%以上序列同源性的序列。
优选地，所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有95%以上序列同源性的序列。
进一步优选地，所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或与SEQID NO.1具有98%以上序列同源性的序列。
另一方面，本发明提供了一种前述的乙醛脱氢酶ALDH4M的核酸。
具体地，所述的核酸序列为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有90%以上序列同源性的序列。
优选地，具体地，所述的核酸序列为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有95%以上序列同源性的序列。
进一步优选地，所述的核酸序列为SEQ ID NO.2或与SEQ ID NO.2具有98%以上序列同源性的序列。
另一方面，本发明提供了一种重组载体，所述的重组载体包括前述的核酸。
具体地，所述的载体可以是质粒、噬菌体和病毒中的一种。
优选地，所述的载体为质粒。
进一步优选地，所述的载体是pPIC9质粒。
具体地，将核酸插入到pPIC9质粒上的BlnI和NotI限制性酶切位点之间。
另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括前述的核酸或前述的重组载体。
具体地，所述的细胞可以是真核细胞或原核细胞。
优选地，所述的细胞可以是毕赤酵母菌、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。
进一步优选地，所述的细胞为毕赤酵母。
更进一步优选地，所述的细胞为毕赤酵母GS115。
另一方面，本发明提供了一种热稳定性提高的乙醛脱氢酶ALDH4M，所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的氨基酸序列为SEQ ID NO.3的突变体，突变位点为S273N、I368L和V425Y。
具体地，所述的S273N是第273位丝氨酸突变为天冬氨酸；所述的I368L是第368位异亮氨酸突变为亮氨酸；所述的V425Y是第425位天冬氨酸突变为酪氨酸。
另一方面，本发明提供了一种制备权利要求1或权利要求8所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的方法，包括以下步骤：
（1）用前述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
（2）培养重组菌株，诱导重组乙醛脱氢酶表达；
（3）回收并纯化所表达的乙醛脱氢酶ALDH4M。
具体地，所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
另一方面，本发明提供了一种药物，所述的药物包括前述的乙醛脱氢酶ALDH4M。
具体地，所述的药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步具体地，所述的药学上可接受的辅料选自聚山梨酯、组氨酸、蔗糖、精氨酸、氯化钠、蛋氨酸、醋酸盐、海藻糖、脯氨酸、山梨醇、磷酸钠、泊洛沙姆188、乙二胺四乙酸、柠檬酸、甘露醇、谷氨酸盐、甘氨酸、柠檬酸钠、琥珀酸钠和/或乳酸。
另一方面，本发明提供了前述的乙醛脱氢酶ALDH4M在制备解酒药物中的应用。
另一方面，本发明提供了前述的乙醛脱氢酶ALDH4M在制备解酒饮品中的应用。
另一方面，本发明提供了前述的乙醛脱氢酶ALDH4M在制备酶制剂中的应用。
具体地，所述的酶制剂可用于治理石油以及工业污染。
本发明所取得的的技术效果：
（1）本发明的乙醛脱氢酶突变体ALDH4M在pH5.0-9.0之间均很稳定，即此酶在碱性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
（2）本发明的乙醛脱氢酶突变体ALDH4M最适温度为35℃，在55℃仍具有60％以上的酶活力。
（3）本发明的乙醛脱氢酶突变体ALDH4M抗干扰能力强。
（4）本发明的乙醛脱氢酶突变体ALDH4M底物特异性强。
附图说明
图1为重组乙醛脱氢酶ALDH以及突变体ALDH4M的最适pH。
图2为重组乙醛脱氢酶ALDH以及突变体ALDH4M的pH稳定性。
图3为重组乙醛脱氢酶ALDH以及突变体ALDH4M的最适温度。
图4为重组乙醛脱氢酶ALDH以及突变体ALDH4M的热稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明的乙醛脱氢酶突变体ALDH4M由北京睿博兴科生物技术有限公司合成获得，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶与连接酶均购自TaKaRa公司，EcoRI内切酶货号1611，NotI内切酶货号1623，连接酶货号2011A。乙醇以及其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
（1）酵母培养基YPD(100mL)：1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g葡萄糖，2g琼脂，pH7.0。
（2）大肠杆菌培养基LB(100mL) ：1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1gNaCl，pH7.0)。
（3）BMGY培养基(100mL）：1g酵母提取物，2g蛋白胨，1.34gYNB，0.00004g 生物素，1%甘油(V/V)。
（4）BMMY培养基：除以0.5%(V/V)甲醇代替甘油，其余成分均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactisCBS 2105乙醛脱氢酶突变体编码基因aldh4m的合成
乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactisCBS 2105乙醛脱氢酶ALDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中N端102个氨基酸为其预测的信号肽序列SEQ ID NO.5。成熟的乙醛脱氢酶ALDH的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
本发明以来自于乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactisCBS 2105乙醛脱氢酶ALDH氨基酸序列（SEQ ID NO.3）作为参考，对其序列进行如下突变（S273N，I368L，V425Y），并在突变后序列的5' 端与3' 端分别加入BlnI和NotI限制酶切位点，将序列发送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行人工合成基因。人工合成的乙醛脱氢酶突变体aldh4m氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2乙醛脱氢酶突变体编码基因aldh4m的克隆
提取携带乙醛脱氢酶突变体的基因载体
将合成好的基因载体以穿刺菌的形式保存，于超净台中用无菌牙签挑取穿刺菌，并置于含Amp（工作浓度：100μg/mL）抗生素的LB摇管中，37℃，220rpm过夜培养，次日按康为世纪质粒提取试剂盒PurePlasmid Mini Kit（CW0500）说明书步骤进行实验提取含有突变体基因的载体。
根据乙醛脱氢酶ALDH的基因序列，设计并合成了如下引物P1，P2：
P1（SEQ ID NO.6）:5'-ggccctaggatgtacgaaca-3'；
P2（SEQ ID NO.7）:5'-gccgcggccgcTTAttgagt-3'。
以提取后的载体为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约1413bp片段，将该片段回收后与pMD19载体相连送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，通过DNAMan软件将得到的核苷酸序列与aldh基因序列进行比对，确认S273N，I368L，V425Y三处位置的突变无误。
实施例2重组乙醛脱氢酶突变体ALDH4M的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(BlnI+NotI)，同时将编码乙醛脱氢酶突变体的基因aldh4m双酶切(BlnI+NotI)，切出编码成熟乙醛脱氢酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，将乙醛脱氢酶基因片段插入到表达载体上的BlnI和NotI限制性酶切位点之间，使该基因片段位于AOX1启动子的下游并受其调控，获得含有乙醛脱氢酶基因aldh4m的重组质粒pPIC- aldh4m并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/aldh4m。
取含有重组质粒的GS115菌株与对照菌株（即未突变的菌株GS115/aldh），接种于300mL的BMGY培养液中，30℃，250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL的BMMY培养基重悬，30℃，250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定乙醛脱氢酶的活力。SDS-PAGE结果表明，重组乙醛脱氢酶在毕赤酵母中得到了表达。
实施例3重组乙醛脱氢酶突变体ALDH4M的活性分析
具体方法如下：20 mmol/L β-NAD 0.3 mL；1 mol/L Tris-HCl 0.3 mL（pH 8.0）；1mol/L 巯基乙醇（2-Me）0.03 mL；100 mmol/L 乙醛0.2 mL；3 mol/L KCl 0.1mL；水1.07mL；将混匀的体系在35℃条件下温浴10 min后加入乙醛脱氢酶酶液 1.0mL，迅速使用酶标仪检测340nm下吸光度值的变化量，每隔1 min读取一次吸光度值，总反应时间为5min，根据每分钟的吸光度值的变化量计算出乙醛脱氢酶的酶活。经测定，未突变乙醛脱氢酶ALDH酶活为10.20U/mL，乙醛脱氢酶突变体ALDH4M酶活为12.06U/mL。
实施例4重组乙醛脱氢酶突变体ALDH4M的性质测定
1、重组乙醛脱氢酶ALDH4M的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
在测量重组乙醛脱氢酶的最适pH时，只改变反应体系中缓冲液的pH值，使用缓冲液如下：
KH2PO4-NaOH 缓冲液(pH 6.5-7.5)，Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)，Glycine-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.5)，Na2HPO4-NaOH缓冲液(pH 11.0-11.5)。通过比较乙醛脱氢酶在不同pH 缓冲液中反应的初始速率来确定酶的最适 pH。结果(图1)表明，突变酶ALDH4M对酸性环境比较敏感，当pH值低于6.0时，酶活随着 pH 值的增加而提高，但均低于50%；当pH值达到8.0时，酶活最高；当pH值高于9.0 时，酶活迅速降低。
将酶液在不同pH值的缓冲液中处理60min，测定酶活以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明乙醛脱氢酶在pH5.0-9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50%以上，这说明此酶在碱性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
2、乙醛脱氢酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
乙醛脱氢酶的最适温度的测定为在Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0)缓冲液体系及不25-60℃下进行酶促反应。耐温性测定为乙醛脱氢酶在25-60℃处理5min，再在35℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)其最适温度为35℃。酶的热稳定性试验表明(图4)，突变乙醛脱氢酶ALDH4M在55℃下处理5min，剩余酶活仍在60%以上（图4），而未突变乙醛脱氢酶ALDH在50℃处理5min即失去大部分酶活，表明突变乙醛脱氢酶ALDH4M的热稳定性较ALDH相比有明显提高。
3、不同金属离子对ALDH4M酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入浓度为5 mmol/L的不同的金属离子（Fe2+、Ca2+、Co2+、 Cu2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Na+、K+）在35℃、pH8.0条件下测定酶活性，研究其对酶活性的影响。以未添加金属离子检测到的酶活为对照，计算乙醛脱氢酶的相对酶活。结果表明，乙醛脱氢酶突变体ALDH4M与未突乙醛脱氢酶ALDH基本一致，Cu2+、Mn2+和对酶活力有较强的抑制作用；Na+、K+对酶的活性具有明显促进作用。
4、重组乙醛脱氢酶ALDH4M的底物特异性
为了考察乙醛脱氢酶ALDH4M对底物的特异性，选择5种底物（乙醛、甲醛、丙醛、苯甲醛和戊二醛）进行研究。乙醛脱氢酶对实验所用的5种醛类都有催化能力，其中对甲醛、戊二醛有较低的活性、对乙醛表现出最高的活性，从结果表明本发明乙醛脱氢酶最适底物为乙醛，并具有较狭窄的底物特异性，该结果与未突变乙醛脱氢酶ALDH一致，表明突变未对ALDH4M的底物特异性产生影响。
对比例
本发明提供了乙醛脱氢酶突变体ALDHM3，所述的ALDHM3在SEQ ID NO.3基础上进行了S198T，G353A，V425W突变，ALDHM3突变体及ALDHM3重组酶制备方法如上述实施例。参照本发明的热稳定测定方法，对ALDHM3进行热稳定性检测，可知ALDHM3在50℃处理5min后只保留了不到50%的酶活性。
Claims (10)
1.一种热稳定性提高的乙醛脱氢酶ALDH4M，其特征在于，所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列为SEQ ID NO.2。
4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的核酸。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的载体是质粒和噬菌体中的一种。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求2-3任一项所述的核酸或权利要求4-5任一项所述的重组载体。
7.一种热稳定性提高的乙醛脱氢酶ALDH4M，其特征在于，所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的氨基酸序列为SEQ ID NO.3的突变体，突变位点为S273N、I368L和V425Y。
8.一种制备权利要求1或权利要求7所述的乙醛脱氢酶ALDH4M的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用权利要求4-5任一项所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
（2）培养重组菌株，诱导重组乙醛脱氢酶表达；
（3）回收并纯化所表达的乙醛脱氢酶ALDH4M。
9.一种药物，其特征在于，包括权利要求1或权利要求7所述的乙醛脱氢酶ALDH4M。
10.权利要求1或权利要求7所述的乙醛脱氢酶ALDH4M在制备解酒药物中的应用。
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| CN101244264A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-08-20 | 复旦大学附属中山医院 | 包含有乙醛脱氢酶的解酒药的新用途 |
| WO2014133092A1 (ja) * | 2013-02-27 | 2014-09-04 | トヨタ自動車株式会社 | 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 |
| CN105431520A (zh) * | 2013-07-31 | 2016-03-23 | 诺维信公司 | 利用表达昆虫天冬氨酸1-脱羧酶的重组酵母的3-羟基丙酸生产 |
| CN111133111A (zh) * | 2017-09-26 | 2020-05-08 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 消耗乙酸的菌株 |
| CN113736803A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-12-03 | 江南大学 | 一种表达乙醛脱氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用 |
-
2023
- 2023-12-13 CN CN202311708995.2A patent/CN117384871B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 乙醛脱氢酶及其医疗领域研究进展;毛跟年;李鑫;瞿建波;;天然产物研究与开发(第01期);第197-201页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117384871A (zh) | 2024-01-12 |
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