CN104946703A - 一种高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法 - Google Patents

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周卫征
郭颖
许敬亮
王忠铭
梁翠谊
张宇
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Abstract

本发明公开了一种高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法。本发明利用高温液态水对微藻进行预处理，解离微藻的细胞壁，实现微藻的预糖化，然后利用酶解法完成伪造细胞内以淀粉为主的多糖糖化，是一种高效快速零污染的微藻糖化方法。本发明所述方法为生物质能源应用提供了新的途径，所用的高温液态水和酶解法工艺简单且环保，具有很好的应用前景。

Description

一种高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法
技术领域
本发明涉及通过自然资源获得糖类相关技术领域，具体涉及一种微藻糖化的方法。
技术背景
利用微藻生产燃料逐步成为全世界的研究热点并一直延续至今。近些年来，利用微藻制备乙醇，越来越受到人们的关注，世界各研究机构、能源科技公司都开展了相关研究工作，微藻乙醇逐步成为生物乙醇生产的研究热点。本文结合国内外利用微藻生产乙醇的研究进展，讨论了微藻产醇过程中的各关键步骤。
微藻有营养吸收快、光合效率高、生长迅速等特点。陆生植物的光合效率一般都低于0.5％，但微藻的光合效率最高可达10％。高效的光合效率使得微藻细胞的生长周期缩短，其生物质倍增时间平均为2—5天，而某些藻类仅为6个小时，能够在短时间内产生大量微藻生物质。通过人工控制条件，微藻养殖可以全年进行，大大提高了经济性。微藻乙醇的原料是微藻生物质中的碳水化合物，主要包括淀粉、纤维素、半纤维素等。许多藻类如小球藻、衣藻、栅藻、螺旋藻等含有大量的纤维素和淀粉，有些微藻淀粉含量可与玉米、小麦等其它乙醇原料媲美。另外与其它木质纤维素植物相比，微藻细胞内木质素和半纤维素含量更低，而且与植物中的纤维素Iβ不同，微藻细胞内为纤维素Iα，其氢键较弱，更易被降解为单糖。
微藻作为高效的光合微生物，能将太阳能、H2O和CO2通过光合作用转化为碳水化合物存储在细胞内。许多藻类细胞内含有大量的淀粉和纤维素，有些微藻淀粉含量可与玉米、小麦等相媲。另外，微藻细胞内木质素和半纤维素含量较低，而且与植物细胞中的纤维素Iβ不同，微藻细胞内为Iα型纤维素，其氢键较弱，更易被降解为单糖，因此是作为燃料乙醇生产的优良原料。
微藻预处理能够破坏微藻细胞壁，将大分子碳水化合物降解为小分子，提高后续酶解糖化效率。目前研究较多的微藻预处理方法，包括稀酸预处理、酶法预处理，碱法预处理。高温液态水(Liquid Hot Water)预处理法具有不需添加化学试剂、反应条件温和、抑制物生成少等优势，正逐渐成为微藻生物质预处理的研究热点。通过水热法预处理之后的微藻生物质，其后续水解效率大大提高，糖回收率有显著提高。
发明内容
本发明的目的在于结合目前大多数生物乙醇生产以粮食作物为原料，需要占用大量耕地，而且粮食的消耗还会刺激食品价格上涨，带来诸多环境和经济问题，而利用微藻糖化方法可以做到“不与民争粮，不与粮争地”。利用高温液态水对微藻进行预处理，解离微藻的细胞壁、实现微藻的预糖化，进而利用酶解完成微藻细胞内以淀粉为主的多糖糖化方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)称取冻干微藻生物质，加入超纯水至微藻生物浓度为0.067～0.2g/L，在100～200℃下进行高温液态水预处理，预处理时间为20～80min；
(2)完成预处理后，加入超纯水至固液质量比为1:20，离心，取上清液，用高效液相色谱测其中的葡萄糖浓度；同时取上清液，用4wt％硫酸在121℃下水解1h后，测定其中低聚葡萄糖和葡萄糖的总含量；
(3)将步骤(1)所得的处理液用醋酸溶液调节pH值至4.5(这是淀粉酶和纤维素酶的最适pH)，加入淀粉酶和纤维素酶，震荡酶解36～72h；
(4)取步骤(3)酶解后所得的酶解液，离心，取上清液，用高效液相色谱测定其葡萄糖浓度，计算葡萄糖回收率。
葡萄糖回收率为微藻生物质经过高温液态水预处理及酶解后所得的葡萄糖占微藻生物质中葡萄糖总量的百分比，计算公式为：
作为一种优选方案，步骤(1)中，所述微藻生物质为室内外培养的高碳水化合物含量的微藻品种；步骤(2)和(4)中，所述离心是8000rpm离心10min；步骤(3)中，所述淀粉酶的加入量是每克冻干微藻生物质加入200～400FPU淀粉酶；所述纤维素酶的加入量是每克冻干微藻生物质加入20～40FPU纤维素酶；所述震荡酶解是在、150rpm下的恒温摇床中进行。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明是以富淀粉微藻为原料，高温液态水处理结合酶解微藻糖化的方法。本发明为微藻生物质在生物质能源方面的应用提供了新的途径，酶解、高温液态水环境友好工艺简单、环保，为微藻能源化利用研究提供了新研究方向。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步阐述。但实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例所用到的淀粉酶和纤维素酶均购自生工生物工程有限公司，淀粉酶酶活为1040U/g，酶活单位定义为1g enzyme at 40℃,pH 4.6 conditions,1 hourof hydrolysis of soluble starch and 1mg of glucose as an enzyme activity unit:U/g；纤维素酶酶活为155U/mg，酶活单位为国际单位。
实施例1
(1)准确称取冻干的微藻生物质1g，加入超纯水15ml，在温度、时间(40min)条件下进行高温液态水预处理。
(2)完成预处理反应后，均加超纯水至固液质量比为1:20，取预处理液，8000rpm离心10min，取上清液用高效液相色谱测预处理液中的葡萄糖浓度；同时取上清液，用4wt％硫酸在121℃条件下水解1h，测定预处理液中低聚葡糖和葡萄糖的总含量。
(3)预处理后的处理液，用醋酸溶液调节pH值至4.5，为淀粉酶和纤维素酶最适pH。加入淀粉酶200-400FPU/g底物酶量和纤维素酶40FPU/g底物酶量，于37℃、150r/min条件下，在恒温摇床中震荡酶解60h。
(4)取酶解液，8000rpm离心10min后取上清液，用高效液相色谱(HPLC)测定葡萄糖浓度。葡萄糖回收率为微藻生物质经过高温液态水预处理及酶解后所得的葡萄糖占微藻生物质中葡萄糖总量的百分比，计算公式为：
CHPLC为高效液相色谱测得的葡萄糖浓度，mg/mL。
总糖回收率为89.3％。
实施例2
(1)准确称取冻干的微藻生物质1g，加入超纯水20ml，在不同温度、时间(20min)条件下进行高温液态水预处理。
(2)完成预处理反应后，均加超纯水至固液质量比为1:20，取预处理液，8000rpm离心10min，取上清液用高效液相色谱测预处理液中的葡萄糖浓度；同时取上清液，用4wt％硫酸在121℃条件下水解1h，测定预处理液中低聚葡糖和葡萄糖的总含量。
(3)预处理后的处理液，用醋酸溶液调节pH值至4.5，为淀粉酶和纤维素酶最适pH。加入淀粉酶200-400FPU/g底物酶量和纤维素酶20-40FPU/g底物酶量，于、150r/min条件下，在恒温摇床中震荡酶解36h。
(4)取酶解液，8000rpm离心10min后取上清液，用高效液相色谱(HPLC)测定葡萄糖浓度。葡萄糖回收率为微藻生物质经过高温液态水预处理及酶解后所得的葡萄糖占微藻生物质中葡萄糖总量的百分比，计算公式为：
CHPLC为高效液相色谱测得的葡萄糖浓度，mg/mL。
总糖回收率为42.3％。
实施例3
(1)准确称取冻干的微藻生物质1g，加入超纯水5ml，在不同温度、时间(80min)条件下进行高温液态水预处理。
(2)完成预处理反应后，均加超纯水至固液质量比为1:20，取预处理液，8000rpm离心10min，取上清液用高效液相色谱测预处理液中的葡萄糖浓度；同时取上清液，用4wt％硫酸在121℃条件下水解1h，测定预处理液中低聚葡糖和葡萄糖的总含量。
(3)预处理后的处理液，用醋酸溶液调节pH值至4.5，为淀粉酶和纤维素酶最适pH。加入淀粉酶200-400FPU/g底物酶量和纤维素酶40FPU/g底物酶量，于37℃、150r/min条件下，在恒温摇床中震荡酶解72h。
(4)取酶解液，8000rpm离心10min后取上清液，用高效液相色谱(HPLC)测定葡萄糖浓度。葡萄糖回收率为微藻生物质经过高温液态水预处理及酶解后所得的葡萄糖占微藻生物质中葡萄糖总量的百分比，计算公式为：
CHPLC为高效液相色谱测得的葡萄糖浓度，mg/mL。
总糖回收率为80.1％。
实施例4
(1)准确称取冻干的微藻生物质1g，加入超纯水10ml，在不同温度、时间(20min)条件下进行高温液态水预处理。
(2)完成预处理反应后，均加超纯水至固液质量比为1:20，取预处理液，8000rpm离心10min，取上清液用高效液相色谱测预处理液中的葡萄糖浓度；同时取上清液，用4wt％硫酸在121℃条件下水解1h，测定预处理液中低聚葡糖和葡萄糖的总含量。
(3)预处理后的处理液，用醋酸溶液调节pH值至4.5，为淀粉酶和纤维素酶最适pH。加入淀粉酶200-400FPU/g底物酶量和纤维素酶30FPU/g底物酶量，于37℃、150r/min条件下，在恒温摇床中震荡酶解72h。
(4)取酶解液，8000rpm离心10min后取上清液，用高效液相色谱(HPLC)测定葡萄糖浓度。葡萄糖回收率为微藻生物质经过高温液态水预处理及酶解后所得的葡萄糖占微藻生物质中葡萄糖总量的百分比，计算公式为：
CHPLC为高效液相色谱测得的葡萄糖浓度，mg/mL。
总糖回收率为85.1％。
实施例5
(1)准确称取冻干的微藻生物质1g，加入超纯水定容到5ml，在不同温度(120℃)、时间(60min)条件下进行高温液态水预处理。
(2)完成预处理反应后，均加超纯水至固液质量比为1:20，取预处理液，8000rpm离心10min，取上清液用高效液相色谱测预处理液中的葡萄糖浓度；同时取上清液，用4wt％硫酸在121℃条件下水解1h，测定预处理液中低聚葡糖和葡萄糖的总含量。
(3)预处理后的处理液，用醋酸溶液调节pH值至4.5，为淀粉酶和纤维素酶最适pH。加入淀粉酶200-400FPU/g底物酶量和纤维素酶20FPU/g底物酶量，于37℃、150r/min条件下，在恒温摇床中震荡酶解72h。
(4)取酶解液，8000rpm离心10min后取上清液，用高效液相色谱(HPLC)测定葡萄糖浓度。葡萄糖回收率为微藻生物质经过高温液态水预处理及酶解后所得的葡萄糖占微藻生物质中葡萄糖总量的百分比，计算公式为：
CHPLC为高效液相色谱测得的葡萄糖浓度，mg/mL。
总糖回收率为77.2％。

Claims (4)

1.一种高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)称取冻干微藻生物质，加入超纯水至微藻生物浓度为0.067～0.2g/L，在100～200℃下进行高温液态水预处理，预处理时间为20～80min；
(2)完成预处理后，加入超纯水至固液质量比为1:20，离心，取上清液，用高效液相色谱测其中的葡萄糖浓度；同时取上清液，用4wt％硫酸在121℃下水解1h后，测定其中低聚葡萄糖和葡萄糖的总含量；
(3)将步骤(1)所得的处理液用醋酸溶液调节pH值至4.5，加入淀粉酶和纤维素酶，震荡酶解36～72h；
(4)取步骤(3)酶解后所得的酶解液，离心，取上清液，用高效液相色谱测定其葡萄糖浓度，计算葡萄糖回收率。
2.根据权利要求1所述的高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法，其特征在于步骤(1)中，所述微藻生物质为室内外培养的高碳水化合物含量的微藻品种。
3.根据权利要求1所述的高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法，其特征在于步骤(2)和(4)中，所述离心是8000rpm离心10min。
4.根据权利要求1所述的高温液态水结合酶解处理微藻糖化的方法，其特征在于步骤(3)中，所述淀粉酶的加入量是每克冻干微藻生物质加入200～400FPU淀粉酶；所述纤维素酶的加入量是每克冻干微藻生物质加入20～40FPU纤维素酶；所述震荡酶解是在37℃、150rpm下的恒温摇床中进行。
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