CN104946702A - 氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于木质纤维素原料预处理技术领域，具体公开了一种氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法。（1）、称取干燥木质纤维素原料，按固液比g/ml=1/20～1/10，添加浓度为0.1～0.5mol/L的三氯化铁溶液，混匀后，在100～108℃下处理15～30min；（2）、取经过步骤（1）三氯化铁处理后并洗至中性的木质纤维素原料，按照固液比g/ml=1/6～1/4加入蒸馏水，用无菌封口膜封口，121±5℃灭菌1h±30min，接种处于对数期的白腐菌，保持28±3℃条件下进行培养6～30天。本发明先用三氯化铁处理木质纤维素原料再用白腐菌处理，还原糖的含量及周期有了明显的提高，处理后的木质纤维素原料产氢能力更强。

Description

氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法

技术领域

本发明属于木质纤维素原料预处理技术领域，具体涉及一种氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法。

背景技术

随着石油、煤炭等不可再生资源大规模的开发利用，能源危机和环境问题正逐渐成为制约各国发展的关键所在。随着我国综合国力的不断增强，对石油、天然气等不可再生能源的需求必将越来越大，这无疑将会严重阻碍未来我国乃至全世界政治、经济以及文化的发展。在化石燃料大规模利用的同时，全球的气候也正面临着严峻的考验，臭氧层空洞、温室效应等问题日益突出。因此，从环保以及资源的可持续发展角度出发，开发新的可再生能源，如风能、太阳能、核能以及生物能源，正逐渐受到世界各国的青睐。目前全球约有 40 万种木质纤维素原料，其具有来源丰富、原料易得、价格便宜、可再生等优点。木质纤维素原料主要包括纤维素、半纤维素和木质素三部分，其中纤维素可经纤维素酶水解生成葡萄糖，并进一步发酵生产乳酸、乙醇等产品，半纤维素经半纤维素酶水解可生成半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖等，进一步可以转化为木糖醇、有机酸等工业产品，另外，木质素还可以用来生产草酸、抗凝血剂等，因此对木质纤维素原料进行综合利用，将能有效地缓解全球的经济危机和环境问题。

木质纤维素原料中，主要含有纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素的无定形区由半纤维素包围着，木质素则包围着结晶区。因此，要提高纤维素酶解还原糖得率，必须除去半纤维素和木质素的包裹作用。预处理的主要目的在于提高纤维素酶对纤维素原料的可及性，减少纤维素酶的无效吸附，降低结晶度，得到更高的还原糖等，因此，在木质纤维素被利用之前，需要经过前期的预处理阶段，才能更好的发酵产糖。

木质纤维素原料转化为工业产品主要存在以下两个问题：一是木质纤维素致密的空间结构和纤维素自身的结晶结构严重阻碍着纤维素酶的高效吸附；二是纤维素酶的酶解还原糖得率较低，且价格较贵，不利于工业化应用。现阶段，木质纤维素原料转化乳酸等产品的首要问题是可溶性发酵糖产率低和工艺成本过高，而其中水解糖化过程中原料的预处理是一重要步骤，所以高效低能耗的预处理工艺是木质纤维素原料大规模生产利用的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法。

为达上述目的，本发明采取的技术方案为：

氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法，步骤如下：

（1）、称取干燥木质纤维素原料，按固液比g/mL=1/20～1/10，添加浓度为0.1～0.5 mol/L的三氯化铁溶液，混匀后，在100～108℃下处理15～30min；

（2）、取经过步骤（1）三氯化铁处理后并洗至中性、干燥的木质纤维素原料，按照固液比g/ml=1/6～1/4加入蒸馏水，用无菌封口膜封口，121±5℃灭菌1h±30min，每kg混合液接种0.2～0.3g处于对数期的白腐菌，保持28±3℃条件下进行培养6～30天。

上述步骤优选如下：

（1）、称取干燥木质纤维素原料，按固液比g/mL=1/20，添加浓度为0.5 mol/L的三氯化铁溶液，混匀后，在100～108℃下处理30min；

（2）、取经过步骤（1）三氯化铁处理后并洗至中性、干燥的木质纤维素原料，按照固液比g/ml=1/5加入蒸馏水，用无菌封口膜封口，121℃灭菌1h，每kg混合液接种0.25g处于对数期的白腐菌，保持28℃条件下进行培养12天。

进一步优选，所述木质纤维素原料为玉米秸秆，所述白腐菌为黄孢原毛平革菌。

本发明先用三氯化铁处理木质纤维素原料再用白腐菌处理，还原糖的含量及周期有了明显的提高，处理后的木质纤维素原料产氢能力更强。

附图说明

图1为三氯化铁溶液处理前后原料的扫描电镜图。

图2为白腐菌处理40目玉米秸秆对还原糖含量的影响。

图3为白腐菌处理三氯化铁处理后40目玉米秸秆对还原糖含量的影响。

图4为白腐菌处理40目和经三氯化铁处理过40目玉米秸秆还原糖对比。

具体实施方式

氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法，步骤如下：

第一步，氯化铁处理：

1实验与材料

1.1原料

玉米秸秆采自河南农业大学机电工程学院实验园，自然风干下经粉碎机粉碎，经研究分析，过40目标准筛，75℃烘干至恒重。

1.2实验过程

称取一定量的干燥秸秆，分别按固液比（g/mL）为1/10、1/20，添加浓度（mol/L）为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5的三氯化铁溶液，振荡均匀后，置于高压灭菌箱中，设置温度(℃)范围为100～108，反应时间分别为15min和30min。实验方案如表1所示。                     

1.3玉米秸秆中纤维素、木质素、半纤维素含量测定

采用改良王玉万法，测定流程如下：

①将约1g样品置于300ml碘量瓶中，加入100ml中性洗涤剂3%（质量）十二烷基硫酸钠水溶液，之后放入已沸的高压蒸汽釜中，保温1h取出，用3号砂芯漏斗过滤，残渣用水、丙酮洗，得残渣1；

②将残渣1于60℃烘干72h，称重、计W1；

③将②处理后的残渣1置于300ml碘量瓶中，加入100ml 2M HCL溶液，然后放入已沸的高压蒸汽釜中，100℃保温50min，之后用3号砂芯漏斗过滤，水洗残渣至pH6.5-7.0，得残渣2；

④将残渣2 于60℃烘干72h，称重，计W2；

⑤将④处理后的残渣2用丙酮洗2次，60℃干燥，然后置300ml碘量瓶中，加入10ml 72%（质量） H₂SO₄，20℃水解3h，然后加水90ml，室温过夜(12-24h)，次日用已称重的3号砂芯漏斗过滤，水洗残渣至pH=6.5，得残渣3；

⑥将残渣3于60℃烘干72h，称重，计W3；

⑦将⑥处理后的残渣3于550℃灰化，称重，计W4；

半纤维素（%）=（W1—W2）/样品重*100% ；

纤维素（%）=（W2—W3）/样品重*100%；

木质素（%）=（W3—W4）/样品重*100%；

降解率（Rate of degradation，DR，%）=（接种培养前某种成分的含量—接种培养后某种成分的含量）/接种培养前某种成分的含量*100%；

以上同组实验分别做三次，取平均值，所测得的玉米秸秆中纤维素、木质素、半纤维素含量如表2所示（其中将未处理的玉米秸秆所测得的三素含量作为0组对照）。

在所测得21组实验中，经比较纤维素、木质素、半纤维素的含量，20组经过三氯化铁溶液加热处理过的玉米秸秆纤维素、木质素含量有明显的提高，而半纤维素的含量下降，发现第20组处理过的纤维素、木质素、半纤维素的含量变化最明显，其中纤维素的含量较未处理的原料增加了52.78%，半纤维素减少了6.98%。

三氯化铁溶液处理前后原料的扫描电镜图见图1，a -原料，b-三氯化铁溶液处理后；从图中可以看出，原料经过三氯化铁溶液处理前后，玉米秸秆的形态发生了明显变化，处理前玉米秸秆的表面结构平整光滑有序，经过处理后表明结构得到明显的破坏。

2分析讨论：

玉米秸秆经三氯化铁溶液预处理后，物料中各组分含量变化较大，分析原因主要是因为在金属离子的作用下，半纤维素变的松散，内部结构遭到严重破坏，易于被分离开来，故造成了半纤维素含量的减少；同时由于玉米秸秆细胞结构的破坏，使细胞内的物质更多地被溶解出来，故而使可溶性物质含量降低。由于粘接层结构遭到破坏，使纤维素晶体结构发生了变化，从而使玉米秸秆物料中纤维素更多的暴露出来，所以经三氯化铁溶液处理后的玉米秸秆纤维素含量有了很大提高。从扫描电镜的图谱分析结果可知，金属离子溶液预处理不仅能够明显破坏玉米秸秆物料的表面结构，而且还能够增大物料的表面孔径。扫描电镜的分析从另外一方面也佐证了化学组分分析的实验结果，表明秸秆结构对酶解后还原糖产率的提高起着至关重要的作用，三种金属离子溶液处理后表面均变的粗糙不平，孔径变大，出现了空穴、断裂等现象，从而有利于后续纤维素酶分子与物料的接触，使玉米秸秆的酶解还原糖产率有所提高。

3小结：

经过三氯化铁溶液处理过的原料，其纤维素、木质素、半纤维素含量均有明显的变化，且纤维素含量最高增加了52.78%，半纤维素最高减少了6.98%，可以看出三氯化铁溶液预处理具有显著地效果。

第二步，白腐菌菌种再处理

2.1.白腐菌菌种的培养

把购自广东微生物研究所微生物保藏中心购买的白腐菌（黄孢原毛平革菌）冻干粉先进行活化：干粉用无菌生理盐水溶解，然后接种到斜面PDA培养基上，放入28℃的恒温生化培养箱中静置培养白腐菌（约为7d），然后对菌种进行第二代的接种培养即接种到平板PDA培养基上28℃静置培养（白腐菌约为7d）；然后放入4 ℃的冰箱备用。PDA培养基：取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000毫升煮沸20分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足1000毫升，加入葡萄糖20g，琼脂20g，溶化后分装，121℃灭菌30分钟。                                                                                                           

2.2 白腐菌菌种的预处理

    取表1第20组经过三氯化铁处理后、洗至中性、自然风干的40目的玉米秸秆及未经处理的40目玉米秸秆7.0g，置于300mL的三角瓶中，按照固液比g/ml=1/5加入蒸馏水，用无菌封口膜封口，121℃灭菌1h，用打孔器向6个三角瓶中分别每kg混合液接种0.25g处于对数期的白腐菌（黄孢原毛平革菌）菌片，保持28℃条件下进行培养。分别在接种菌片第6、12、18、24、30天后取样，测定还原糖的含量的变化，为避免差错及减少误差，每组试验做3遍，取平均值。实验设计方案见表3。

3 微生物预处理秸秆还原糖产率

3.1白腐菌菌种处理的结果

3.1.1 白腐菌处理玉米秸秆

    白腐菌（黄孢原毛平革菌）的降解酶系是由过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）组成的。过氧化物酶（LiP）可以对底物进行部分或彻底的氧化，而后在锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）的共同作用下将秸秆类生物质里的木质素充分地降解，解除木质素对纤维素和半纤维素的包裹，使得秸秆类生物质的纤维素和半纤维素能都得到更好地水解。还原糖的浓度在一定程度上可以反映后续光合制氢产氢的能力，还原糖含量越高，其产氢能力越强。

图2为白腐菌处理40目玉米秸秆对还原糖含量的影响。由图可知，在起初的前6天还原糖的含量很高，在第6天时达到了最大值1.14mg/mL，但是此时玉米秸秆的降解还不够完全，不适宜用于产氢，到12天时还原糖消耗了很多，达到了最小值0.39mg/mL，这种情况的出现可能是白腐菌在繁殖的过程中自身会消耗掉基质中一部分的还原糖，在后续的12天内，还原糖的含量又开始攀升，第18天时还原糖的含量约为0.67mg/mL，随着继续的处理等到第24天时又出现了一个含量高峰，此时还原糖的含量约为0.97mg/mL，而24天～30天的时间内，还原糖的含量又开始了下降且趋于稳定。因此，白腐菌处理40目的玉米秸秆24天左右的时候，可以加入光合产氢细菌，此时，产氢能力将会最强。

图3为白腐菌处理三氯化铁处理后40目玉米秸秆对还原糖含量的影响。由图可知，随着处理时间的增加，白腐菌处理用氯化铁处理后的40目玉米秸秆时还原糖的含量先增加到一个高峰，而后还原糖的含量又逐渐减小，最后趋于稳定。第12天时还原糖的含量最高，约为1.92 mg/mL，在18天的时候还原糖的含量达到一个较小值，约为1.41 mg/mL，在第6～12天的过程中基质中还原糖的含量增长了0.59 mg/mL，到第24天时，还原糖的含量约为1.52 mg/mL，相较于第18天增加了0.11 mg/mL，在第24天～30天期间随着还原糖的被消耗达到一个稳定值，约为1.48 mg/mL。考虑到玉米秸秆的降解程度和产氢能力，选择在12天时加入光合产氢菌，就可以使产氢效果较理想，产氢能力也较强。

图4为白腐菌处理40目和经三氯化铁处理过40目玉米秸秆还原糖对比。由图可知，还原糖含量的走势不大相同，白腐菌直接处理的玉米秸秆是先减少，后增加，再减少，最后趋于稳定，这是因为玉米秸秆在刚接种白腐菌后，白腐菌一边降解秸秆生成还原糖，同时还要利用还原糖进行自身的繁殖生长。而经过三氯化铁处理过的秸秆，接种白腐菌后，在第六天时就达到了1.33mg/ml，在第12天就达到了最大值1.92mg/ml，之后又减少，趋于稳定。究其原因，因为玉米秸秆经过氯化铁处理后，其细胞壁结构已经被破坏，可以使白腐菌直接快速的降解木质素和纤维素，生成多糖。综上可知，经过氯化铁处理过的40目玉米秸秆再用白腐菌处理，还原糖的含量及周期有了明显的提高。

4总结

秸秆类的生物质可经过一系列的物理化学转变可被光合制氢微生物所利用，秸秆中的木质素、纤维素和半纤维素则需经过一定的预处理才能被利用。微生物预处理通过微生物本身所产生的酶类实现了对秸秆中木质素、纤维素和半纤维素的降解，本发明先利用化学法处理玉米秸秆，再利用白腐菌中黄孢原毛平革进行处理，以酶解后还原糖含量作为考察指标，确定了最佳工艺：先用0.5mol/l的三氯化铁溶液，固液比g/ml为1/20在100-108℃下处理30min后，其纤维素、木质素、半纤维素含量均有明显的变化，且纤维素含量最高增加了52.78%，半纤维素最高减少了6.98%；经过过滤，洗至中性，再接种白腐菌，按照固液比1:5加入蒸馏水，用无菌封口膜封口，121℃灭菌1h，接种处于对数期的白腐菌（黄孢原毛平革菌）菌片若干，保持28℃条件下进行培养，在处理12天左右，产生的还原糖含量最高达到1.92mg/mL，此时作为光合产氢的基质效果最好。

Claims (3)

1.氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法，其特征在于步骤如下：

（1）、称取干燥木质纤维素原料，按固液比g/mL=1/20～1/10，添加浓度为0.1～0.5 mol/L的三氯化铁溶液，混匀后，在100～108℃下处理15～30min；

（2）、取经过步骤（1）三氯化铁处理后并洗至中性、干燥的木质纤维素原料，按照固液比g/ml=1/6～1/4加入蒸馏水，用无菌封口膜封口，121±5℃灭菌1h±30min，每kg混合液接种0.2～0.3g处于对数期的白腐菌，保持28±3℃条件下进行培养6～30天。

2.如权利要求1所述的氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法， 其特征在于步骤如下：

（1）、称取干燥木质纤维素原料，按固液比g/mL=1/20，添加浓度为0.5 mol/L的三氯化铁溶液，混匀后，在100～108℃下处理30min；

（2）、取经过步骤（1）三氯化铁处理后并洗至中性、干燥的木质纤维素原料，按照固液比g/ml=1/5加入蒸馏水，用无菌封口膜封口，121℃灭菌1h，每kg混合液接种0.25g处于对数期的白腐菌，保持28℃条件下进行培养12天。

3.如权利要求1或2所述的氯化铁与白腐菌联合预处理木质纤维素原料的方法，其特征在于：所述木质纤维素原料为玉米秸秆，所述白腐菌为黄孢原毛平革菌。