JP2010518850A - 海藻類を利用したバイオ燃料の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、海藻類を利用したバイオ燃料の製造方法に関し、より詳しくは海藻類原草または海藻類から抽出した多糖類物質に分解酵素及び／または加水分解触媒を処理して単糖類を生成するステップと、前記単糖類を微生物により発酵させるステップとを含む、海藻類を利用したバイオ燃料の製造方法に関する。本発明に係るバイオ燃料の製造方法は、バイオマスの原料に海藻類を用いるので原料需給の問題を画期的に改良することができ、従来の木質系原料の利用時に必須に伴われるリグニン除去工程が不要なので工程費用を節減することができるので、経済的及び環境的に非常に有利である。
【選択図】 図２０

Description

本発明は、バイオ燃料の製造方法に関し、より詳しくは海藻類を利用したバイオ燃料の製造方法に関する。

バイオ燃料は、バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）を原料にして得られるエネルギーを通称するものであって、直接燃焼、アルコール発酵、メタン発酵などを介して得られる。バイオ燃料の原料になる物質であるバイオマスは、大きく糖質系（砂糖黍、砂糖大根など）、澱粉質系（とうもろこし、じゃがいも、さつまいもなど）、木質系（木、稲のわら、ほごなど）に分けられ、糖質系の場合、原料を比較的簡単な前処理過程後に続く発酵工程を介し直ぐバイオ燃料への転換が可能であるが、澱粉質系と木質系の場合は、適切な前処理過程と糖化工程を経た糖化液を利用した発酵工程を介しバイオ燃料を製造することができる。木質系は、都市廃棄物の形態の廃木材や森林のいたる所に散在している林産副産物を原料に利用することができ、食糧としての活用価値がないので原料需給の安定性は確保できるが、工程上必ず伴われなければならないリグニン除去前処理工程による工程費用の上昇とともに、木質系セルロース基質の特徴である水素結合でなる結晶（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）構造により糖化収率が低く経済性が低いとの欠点がある。

輸送用代替燃料としてバイオ燃料の成功的な商業化は、ガソリン対比バイオ燃料、例えばバイオエタノールの価格競争力の確保にある。通常、バイオ燃料の製造コスト中で原料費と工程費の占める割合は、バイオマスの種類と工程に従って偏差が大きい。例えば、砂糖黍や砂糖大根を利用する糖質系の場合、原料費：工程費が大凡７５：２５程度である反面、とうもろこし、じゃがいも、キャッサバなどの澱粉質系は大凡５０：５０であり、木質系の場合は大凡２５：７５程度である。

しかし、木質系を除いては現在常用化されたバイオ燃料生産の技術は、人間が食糧として用いることができる糖質系または澱粉質系の原料を用いるので、食糧をエネルギー源に用いるとの問題だけでなく、今後食糧の需要が増加する場合原料の需給問題が発生することがあり、経済的な側面でも穀物を用いるのは原料費用の側面で問題になる。さらに、とうもろこしの栽培は相当量の農薬と窒素肥料を要するだけでなく、他の作物に比べて土壌をひどく腐食させるとの環境的な欠点も存在する。

バイオエタノールは、２００６年現在、全世界的に大凡５１３億リットルの規模で生産されている。糖質系を利用したバイオ燃料、具体的にバイオエタノールの全世界の生産量は大凡１８７億リットル（２００６年基準）であり、主要生産国はブラジル、インド、台湾であり、このうちブラジルが１７８億リットルを生産するほどにブラジルが主導している（グローバル・バイオ・エネルギー・パートナーシップ（ＧＢＥＰ）、２００６）。ブラジルは、豊かな資源である砂糖黍を原料に輸送用バイオエタノールの生産が活発に進められており、実際に多様な形態のエタノール混合ガソリン（ｇａｓｏｈｏｌ）が普及されている。２００３年にはエタノールとガソリンの含量が変化しても運行が可能なＦＦＶ（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｆｕｅｌ Ｖｅｈｉｃｌｅ）が販売され始め、２００５年５月現在総乗用車販売数の大凡５０％を占めた状態である。

とうもろこしを利用したバイオエタノールの全世界の生産量は大凡１９８億リットル（２００６年基準）であり、主要生産国は米国、ヨーロッパ、中国であり、このうち米国が１８５億リットルを生産するほどに主導している（表１を参照）。米国は、オイルショック直後の１９７８年にエネルギー税法（Ｅｎｅｒｇｙ Ｔａｘ Ａｃｔ）を制定し、エタノール１０％以内を含むガソリンに対してガロン当たり４ドルの連邦税減税の恵沢を与えて普及を拡大している。このように米国は、広い耕作地と豊かな資源であるとうもろこしを原料に輸送用バイオ燃料の生産が活発に進められており、新再生エネルギーの技術開発を介し石油依存経済から脱皮する高級エネルギー技術を開発しており、代替エネルギーの開発の一環でエタノール生産技術の開発を推進しており、とうもろこしを利用した燃料用エタノール生産の基盤が拡がる傾向である。

木質系を利用したバイオ燃料の製造技術は未だ常用化段階まで至っていないので、観測された産業動向はない。しかし、カナダのアイオジェン（Ｉｏｇｅｎ）社の場合、木質系バイオマスを利用した製造技術を活発に開発しており、米国は次世代バイオマスとして農業廃棄物及び植物原料からエタノールを抽出する技術を２０１２年まで常用化するために２００７年度の予算に１５０百万ドルを投入する予定であり、これを介し全体の輸送燃料の３０％をエタノールに取り替えることを推進中にある。

一方、海藻類は大きく大型藻類（ｍａｃｒｏａｌｇａｅ）と微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）に分けられ、大型藻類には紅藻類、褐藻類、緑藻類、微細藻類にはクロレラ、スピルリナなどがある。海藻類の生産量は全世界的に年間大凡１，４００万トンに達し、 ２０２０年には大凡２，２００万トン以上まで増加するものと予測されている。このような生産量は全体養殖生産量の大凡２３％に当たるものであって、このうち９０％以上がワカメ、昆布などの褐藻類と、ノリ、天草、オゴノリなどの紅藻類からなっている。韓国の海藻類養殖の生産量は、現在大凡５０万トンで９０年代半ばの大凡７０万トンよりは多少減少したが、養殖漁場の総面積は大凡７万ｈａで９０年代半ばの大凡６万ｈａより増加した。

海藻類は、その他のバイオマスに比べて生長性に遥かに優れ（亜熱帯地方の場合、年間４〜６回収獲可能）、広い海を利用することができるので使用可能な栽培面積が広く、淡水、土地、肥料などコストの高い資源の使用が少ないとの利点がある。さらに、木質系の場合、必ず除去しなければならないリグニン成分がないので、バイオ燃料の製造工程が簡単で、総合エネルギー転換の収率も高い。それだけでなく、海藻類は二酸化炭素の年間吸収量がｈａ当たり３６．７トンで木質系より５〜７倍高いとの利点があり、Ｅ２０（２０％エタノールが添加されたガソリン）を用いると仮定するとき年間温室ガスの低減率は大凡２７％であり、これを金額で換算するとき大凡３，０００億ウォンの炭素税節減の効果を得ることができる（表２）。

しかし、海藻類は今まで主に電気泳動試薬、肥料、乳化剤、抗癌剤などの精密化学素材及び医学素材に利用するか、食用、薬用などの健康食品類にのみ活用されてきただけで、これを利用したバイオ燃料の開発に関する研究は皆無の実情である。

本発明は、前記のような従来のバイオ燃料の製造方法上の問題点を改良するために案出されたものであって、従来のバイオ燃料の原料に使われた糖質系、澱粉質系または木質系原料の代わりに海藻類を利用することにより、原料需給の不安定、低い糖化効率などのような問題点を改良した海洋新バイオマスを原料に利用したバイオ燃料の製造方法を提供することを目的とする。

本発明の海藻類を利用したバイオ燃料の製造方法は、
海藻類原草または海藻類から抽出した多糖類物質に分解酵素及び／または加水分解触媒を処理して単糖類を生成するステップと、
前記単糖類を微生物により発酵させるステップとを含む。

本発明において、前記バイオ燃料にはＣ_１〜Ｃ_４のアルコール、Ｃ_２〜Ｃ_４のケトンなどがあり得、この中でメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはアセトンであるのが好ましいが、これに限定されるものではない。さらに、前記多糖類物質には寒天、澱粉、纎維素、カラギーナン、アルギン酸などがあるが、必ずこれに限定されるものではない。

本発明のバイオ燃料の製造方法で用いられる海藻類には大型藻類または微細藻類が制限なく使用可能であり、前記大型藻類には紅藻類、褐藻類、緑藻類などがあり、微細藻類にはクロレラ、スピルリナなどがある。前記紅藻類には天草、ノリ、コットニー、フダラク、アルバアマノリ、オバクサ、ユイキリ、マフノリ、オゴノリ、ツノマタ、タンバノリ、イバラノリ、イギス、アミクサ、スギノリ、エゴノリ、ムカデノリなどが使用可能であるが、これに限定されるものではなく、この中でも天草を用いるのが好ましい。天草は、紅藻類の中で種の種類が最も多様で生長性に優れ、乾燥重量基準でセルロース成分である纎維素が大凡１５〜２５％、ガラクタンが主成分である寒天が大凡５０〜７０％程度を占め、これ以外に１５％未満のタンパク質と７％未満の脂質で構成されている。前記褐藻類にはワカメ、昆布、マツモ、ナガマツモ、イシゲ、カヤノモリ、ハバノリ、カジメ、ツルアラメ、アラメ、スジメ、ホンダワラ、アカモク、ウミトラノオ、ヒジキなどが使用可能であるが、これに限定されるものではない。褐藻類は多細胞体であり、藻類の中で最もよく分化されている。前記緑藻類にはアオサ、アオミドロ、アオノリ、ミル、タマミル、フサイワヅタ、タマジュズモなどが使用可能であるが、これに限定されるものではない。緑藻類は、葉緑素を有しているので光合成により澱粉類を生成する。前記褐藻類と緑藻類の構成成分を検討してみれば、褐藻類にはアルギン酸が大凡３０〜４０％、纎維素が大凡５〜６％含まれており、緑藻類には炭水化物が主成分である澱粉類が大凡４０〜５０％、纎維素が５％未満含まれている。

寒天はガラクトースポリマーでなるガラクタンが主成分であり、ガラクタンは適切な低分子化過程を介しガラクトース及び３，６−アンヒドロガラクトースなどの単糖類に切り換えられ得る。纎維素はセルロースでなる物質であって、天草の場合、全成分の大凡１５〜２５％を占める。前記セルロースは、適切な酵素や酸触媒を利用した糖化工程を介し単糖類のグルコースに切り換えられ得る。前述のガラクトースとグルコースは、発酵工程を介しバイオ燃料に切り換えられ得る前駆体に用いられる。

澱粉はデキストリンとも呼ばれ、緑色植物の葉緑体内で光合成により生成されて貯蔵される炭水化物であって、グルコースを構成単位にする多糖類である。前記澱粉は、適切な酵素や酸触媒を利用した糖化工程を介し単糖類のグルコースに切り換えられ得る。

前記海藻類で寒天、纎維素、澱粉、カラギーナン、アルギン酸などのような多糖類物質を抽出するための方法は特に制限されず、当該技術分野に周知の如何なる方法も使用可能である。一つの好ましい具現例によれば、海藻類をアルカリ水溶液に一定時間浸漬させたあと水で洗浄し、前記洗浄された海藻類を酸性薬品でなる抽出溶媒に一定時間浸漬させて寒天、カラギーナン、アルギン酸成分を抽出した後、残りの纎維素及び澱粉類を収集する段階を介し寒天、カラギーナン、アルギン酸成分及び澱粉または纎維素を抽出することができる。このとき、抽出温度は特に限定されるものではないが、８０〜１５０℃の範囲であるのが好ましい。前記酸性薬品にはＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４（ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｈ_３ＰＯ_４（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＴＳＡ（ｐａｒａ−ｔｏｌｕｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）または常用固体酸などがあるが、必ずこれに限定されるものではなく、前記アルカリ水溶液には水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水溶液などがあるが、必ずこれに限定されるものではない。

寒天、澱粉、纎維素、カラギーナン、アルギン酸などのような多糖類物質抽出物に適切な分解酵素及び／または加水分解触媒を処理して糖化させることにより単糖類を得ることができる。前記単糖類にはガラクトース、３，６−アンヒドロガラクトース、グルコース、フコース、ラムノース、キシロース、マンノースなどがあるが、必ずこれに限定されるものではない。

前記糖化工程は大きく直接糖化法と間接糖化法に分けることができ、以下で前記２種類の糖化工程と、これを介し得られた糖化液を利用したバイオ燃料の発酵方法について説明する。

先ず、間接糖化法を利用した糖化方法の一例として、寒天を出発物質に利用して糖化する方法について説明する。寒天はガラクトースポリマーであるガラクタンが成分の大部分を占めており、前記ガラクタンは適切な糖化工程（低分子化工程）を介し発酵可能な単糖類のガラクトースまたは３，６−アンヒドロガラクトースに切り換えられ得る。このとき、糖化工程に用いられる方法には、大きく酸加水分解法と酵素加水分解法がある。酸加水分解法は適切な酸加水分解触媒を利用してガラクタンを低分子化する方法であって、使用可能な触媒にはＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡまたは常用固体酸などがある。このとき、用いられた酸の濃度及び反応温度と反応時間などをよく設定することによりガラクトースの糖化収率が最大になるとともに、生成されたガラクトースが過分解されないようにするのが好ましい。酵素を利用して寒天を糖化する方法は、酸加水分解法に比べ切換え効率が低下することもあるが、最適のガラクトシダーゼ酵素群を選択すればこれを克服することができる。ガラクタンを加水分解する酵素にはβ−アガラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼが使用可能であるが、必ずこれに限定されるものではない。前記β−アガラーゼはシュードモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得ることができ、β−ガラクトシダーゼはコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）または牛精巣（Ｂｏｖｉｎｅ ｔｅｓｔｅｓ）から得ることができる。本発明の好ましい具現例によれば、前記単糖類は寒天に対し０．０５〜３０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４またはＰＴＳＡのような加水分解触媒を利用し、６０〜２００℃の温度で０〜６時間反応させることにより生成される。

間接糖化法を利用した糖化方法として、纎維素を出発物質に利用して糖化する方法を検討してみる。纎維素はセルロースでなる物質であって、糖化酵素及び／または酸加水分解触媒を利用して加水分解されグルコースに切り換えられ得る。セルロースを加水分解する常用酵素には現在大凡５２種が知られており、商業的に購入可能なβ−グルコシダーゼ（生産菌株：サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ））、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（生産菌株：クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、タラロミセス・エマーソニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ））のような酵素が好ましいが、必ずこれに限定されるものではない。セルロースを加水分解する触媒にはＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡまたは常用固体酸などが使用可能であり、このとき用いられた酸の濃度及び反応温度と反応時間などをよく調節することによりグルコースの糖化収率が最大になるとともに、生成されたグルコースが過分解されないようにするのが好ましい。本発明の一つの好ましい具現例によれば、前記単糖類は纎維素に対し０．０５〜５０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４またはＰＴＳＡのような加水分解触媒を利用し、８０〜３００℃の温度で反応させることにより生成される。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記単糖類は纎維素に対し分解酵素を利用して０超過〜１４４時間反応させることにより生成される。

間接糖化法を利用した糖化方法として、澱粉を出発物質に利用して糖化する方法を検討してみる。澱粉はグルコースでなる物質であって、糖化酵素及び／または酸加水分解用触媒を利用して容易に加水分解されグルコースに切り換えられ得る。澱粉を加水分解する常用酵素にはアミラーゼが一般的に使用可能であるが、これに限定されるものではない。アミラーゼは多糖類を加水分解する酵素であって、デキストリン（アミロース及びアミロペクチン）やグリコーゲンと同様に主にα−結合のグルコースでなる多糖類に作用する。作用方式に従いα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼの３種類に分けられる。アミラーゼを生産する微生物にはコウジカビ、クロコウジカビ、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）または超高温性微生物（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）などがあるが、これに限定されるものではない。澱粉を加水分解する触媒にはＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡまたは常用固体酸などが使用可能であり、このとき用いられた酸の濃度及び反応温度と反応時間などをよく調節することによりグルコースの糖化収率が最大になるとともに、生成されたグルコースが過分解されないようにするのが好ましい。

直接糖化法を利用した糖化方法は、纎維素及び／または寒天、カラギーナンが全て含まれた海藻類または澱粉及び／またはアルギン酸、纎維素が全て含まれた海藻類原草を出発物質に利用し、前記物質等を直接糖化する工程を含む。このとき、酵素加水分解法と酸加水分解法を利用することができる。酵素加水分解法の場合、海藻類原草に存在する主要基質がガラクタン及び纎維素、またはカラギーナン及び纎維素、またはアルギン酸及び纎維素、または澱粉及び纎維素であり、グルコースに切り換えられる酵素の機作と、ガラクトース及び３，６−アンヒドロガラクトースに切り換えられる酵素の機作とが互いに相違し得るので、効率的な加水分解のため前述した酵素の適切な選択が求められ得、間接糖化工程で用いられる加水分解酵素のうち２種類以上が複合的にともに用いられてもよい。例えば、緑藻類の場合澱粉と纎維素の２種類の多糖類が存在するので、澱粉を分解する澱粉分解酵素と纎維素を分解する纎維素分解酵素を同時に用いる複合酵素群を用いることができる。酸加水分解法の場合、酸加水分解用触媒は特に限定されず、既に前述したように、間接糖化工程で用いられる加水分解触媒が使用可能である。このとき、酸触媒の濃度と反応温度及び反応時間を適切に調節することにより生成されたグルコースとガラクトースの糖化収率が最大になる条件、及び生成された単糖類が過分解されないようにする反応条件を探すのが重要である。海藻類原草を出発物質にして糖化する場合は、採取された海藻類を水洗過程を介し不純物除去と洗浄過程を行ったあと、熱風乾燥器または自然乾燥法を利用して完全に乾燥させ、乾燥した海藻類を原料粉砕機を利用して細かく破砕し、粒子のきれいなパウダーの形態に変換したあと利用するのが好ましい。本発明の一つの好ましい具現例によれば、前記単糖類は海藻類原草に対し０．０５〜５０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４またはＰＴＳＡのような加水分解触媒を利用して６０〜３００℃の温度で０超過〜６時間反応させることにより生成される。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記単糖類は多段階糖化法を利用して海藻類原草に対し０．０５〜５０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡまたは常用固体酸でなる群から選択される加水分解触媒を利用して６０〜３００℃の温度で０超過〜６時間のあいだ反応させたあと、残りの纎維素或いは澱粉を対象に前記反応条件で２次或いは３次糖化反応させることにより生成される。

前述したように生成されたガラクトース、３，６−アンヒドロガラクトース、グルコースまたはその混合物を含む糖化液は、バイオ燃料発酵用菌株、例えば酵母を利用してバイオアルコールに切り換えられ得る。本発明で使用可能な発酵用酵母にはクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・オーランチブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）またはクロストリジウム・テタノモーファム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）などがあるが、これに限定されるものではなく、これらはブタノール及びアセトンの発酵においてより好ましい。さらに、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サルシナ・ベントリクリ（Ｓａｒｃｉｎａ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ）、クリュイベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）またはクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＩＭＢ３、ブレタノミセス・クステルシィ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｕｓｔｅｒｓｉｉ）などが使用可能であり、これらはエタノール発酵においてより好ましい。

特に、バイオ燃料の中でガソリンと類似する成分を有するバイオブタノールはエネルギー密度、揮発性制御、十分なオクタン価、低い不純物などのような特性を含む主要特性等の良好な燃料の基準を満足させ、１０％程度混合されたバイオブタノール燃料混合物の性能がガソリン燃料と非常に類似し、バイオブタノールのエネルギー密度も無煙ガソリンに殆ど近接する。バイオブタノールは、バイオエタノールとは異なって水が存在するとしても相分離が発生せず、酸素含有量が低いのでガソリンに高濃度のバイオブタノールを混合させることができるとの利点がある。

糖化装置を示す概略図であって、（ａ）バッチ反応器、（ｂ）サンプリングポート、（ｃ）圧力ケージ、（ｄ）Ｎ_２ガス調節器、（ｅ）Ｎ_２ガス筒、（ｆ）コントロールボックス、（ｇ）Ｎ_２ガス保管器を示す。 アガロースの結合構造を示す化学構造式である。 寒天を基質に用いた場合のガラクトース収率に及ぼす反応温度の影響を表わすグラフであって、実験条件は基質１０ｇ、１％ Ｈ_２ＳＯ_４ ４００ｍＬで３０分間反応である。 寒天を基質に用いた場合のガラクトース収率に及ぼすサンプリング温度の影響を表わすグラフであって、実験条件は基質１０ｇ、１％ Ｈ_２ＳＯ_４ ４００ｍＬで当該温度に到達時の反応である。 セルロースを基質に用いた場合のグルコース収率に及ぼすＨ_２ＳＯ_４濃度の影響を表わすグラフであって、実験条件は基質２０ｇ、２００℃で反応である。 天草を基質に用いた場合、反応温度及び反応時間が（ａ）グルコース収率、（ｂ）ガラクトース収率、（ｃ）グルコース＋ガラクトース収率に及ぼす影響を表わすグラフであって、実験条件は基質２２ｇ、１％ Ｈ_２ＳＯ_４ ４００ｍＬである。 天草を基質に用いた場合、反応温度及び反応時間が（ａ）グルコース収率、（ｂ）ガラクトース収率、（ｃ）グルコース＋ガラクトース収率に及ぼす影響を表わすグラフであって、実験条件は基質４０ｇ、１％ Ｈ_２ＳＯ_４ ４００ｍＬである。 天草を基質に用いた場合、反応温度及び反応時間が（ａ）グルコース収率、（ｂ）ガラクトース収率、（ｃ）グルコース＋ガラクトース収率に及ぼす影響を表わすグラフであって、実験条件は基質６０ｇ、１％ Ｈ_２ＳＯ_４ ４００ｍＬである。 天草を基質に用いた場合、Ｓ／Ｌ比（ｓｏｌｉｄ／ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ）がガラクトース収率に及ぼす影響を表わすグラフであって、実験条件は１％ Ｈ_２ＳＯ_４ ４００ｍＬ、１２０℃で４時間反応である。 天草を基質に用いた場合、Ｈ_２ＳＯ_４濃度が（ａ）グルコース収率、（ｂ）ガラクトース収率、（ｃ）グルコース＋ガラクトース収率に及ぼす影響を表わすグラフであって、実験条件は基質６０ｇ、１５０℃で４時間反応である。 天草を基質に用いた場合、酸の種類が（ａ）グルコース収率、（ｂ）ガラクトース収率、（ｃ）グルコース＋ガラクトース収率に及ぼす影響を表わすグラフであって、実験条件は基質７．５ｇ、１％ Ｈ_２ＳＯ_４ ２００ｍＬ、１２１℃で１５分反応である。 天草を基質に用いた場合、加水分解回数が単糖類の収率に及ぼす影響を表わすグラフであって、実験条件は１％ Ｈ_２ＳＯ_４、１２１℃で１５分反応である。 （ａ）１．０％、（ｂ）２．０％、（ｃ）５．０％濃度のグルコースの存在下でサカロミセス・セレビシエの成長曲線を示すグラフである。 （ａ）１．０％、（ｂ）２．０％、（ｃ）５．０％濃度のガラクトースの存在下でサカロミセス・セレビシエの成長曲線を示すグラフである。 （ａ）１．０％、（ｂ）２．０％、（ｃ）５．０％濃度のグルコースの存在下でブレタノミセス・クステルシィの成長曲線を示すグラフである。 （ａ）１．０％、（ｂ）２．０％、（ｃ）５．０％濃度のガラクトースの存在下でブレタノミセス・クステルシィの成長曲線を示すグラフである。 混合糖を利用したサカロミセス・セレビシエによるエタノールの生産を示すグラフである。 混合糖を利用したブレタノミセス・クステルシィによるエタノールの生産を示すグラフである。 糖化液（ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ）を利用したサカロミセス・セレビシエによるエタノールの生産を示すグラフである。 糖化液を利用したブレタノミセス・クステルシィによるエタノールの生産を示すグラフである。

以下、本発明を実施例に基づき詳しく説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の内容が下記実施例により限定されるものではない。

本実施例では、下記のような糖化装置、実験材料及び分析方法を使って実験を行なった。

１．糖化装置
糖化実験を行なうための反応器とコントロールボックスで構成された糖化装置システムが図１に示されている。反応器は５００ｍＬ容量（有効容積：４００ｍＬ）の円筒状で内部高さ１２．５ｃｍ、内径７ｃｍに製作し、温度ジャケットを設けて設定された反応温度に到逹できるようにした。反応器の内部温度を測定するため熱電対（ｔｈｅｒｍｏｃｏｕｐｌｅ）を取り付け、過熱されるのを防止するため反応器外部に冷却水が循環供給されるようにした。反応途中のサンプル採取を容易にするために反応器外部から高圧のＮ_２ガスが流入できるようにし、Ｎ_２ガス貯蔵所とサンプルポートを取り付け、コントロールボックスにはＲＰＭメータとデジタル温度調節器、圧力ケージを取り付けた。

２．実験材料
２．１．基質
本実施例では紅藻類にモロッコ産天草、済州産天草、オゴノリ、コットニーを用い、緑藻類にはミルを用い、褐藻類としては昆布を用いた。

本実施例では天草を原料に利用した直接糖化法と、天草から分離／抽出された纎維素及び寒天を原料に利用した間接糖化法に分けて実験を進めた。直接糖化法のためには天草を蒸留水で洗浄したあと、４０℃で乾燥して粉砕し、１０６、３００メッシュで分体して用いた。間接糖化法のため、寒天はＫＯＨ水溶液に一定時間浸漬させてから蒸留水で洗浄し、半乾きのモロッコ産天草を蒸留水またはエチルアルコールまたはメチルアルコールを利用して抽出したあと、４０℃で乾燥し粉砕して用い、纎維素は抽出された寒天をＯ_３で２回（１ｈ／１回）漂白して６０℃でＣＩＯ_２で２回（１．５ｈ／１回）漂白したあと、８０℃でＨ_２Ｏ_２で２回（１ｈ／１回）漂白して用いた。

２．２．菌株及び培地
本実施例では、サカロミセス・セレビシエＤＫＩＣ４１３及びブレタノミセス・クステルシィ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｕｓｔｅｒｓｉｉ）Ｈ１−３９菌株（韓国種菌協会 ＫＣＣＭ １１４９０）を用い、培養培地としてＹＥＰＤ培地（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ、ｐｅｐｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ、ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ）を用いた。培地は高圧反応器（Ｗｏｏｓｕｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃｏ．， Ｋｏｒｅａ）で１２１℃、１５分間滅菌したあと用いた。

２．３．使用酵素
本実施例に利用された酵素は、商業用酵素であって(株)バイオシスで購入した。セルクラスト（ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ）はトリコデルマ・リーゼイの培養液を濃縮したもので、セルロースをグルコースとセロビオースに分解する酵素（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）であり、ビスコザイム（ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ）はアスペルギルス・アクレアータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）の培養液を濃縮したもので、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼが混合された複合酵素である。スピリザイム（ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ）とＡＭＧ（Ａｍｙｌｏ Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）はクロコウジカビから生産されたアミロ・グルコシダーゼで、α−アミラーゼとイソアミラーゼによりマルト・オリゴマーに分解された澱粉をグルコースに分解する酵素であり、ラクトザイム（ｌａｃｔｏｚｙｍ）はクリュイベロミセス・フラジリスの培養液を濃縮したもので、ラクトースをグルコースとガラクトースに分解する酵素（ｌａｃｔａｓｅ）である。各酵素の機能及び加水分解条件は表３に示されている。

３．分析方法
３．１．糖分析
糖化液は、電流度検出器が取り付けられたＨＰＬＣ（ＩＣＳ−３０００， Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏ．， ＵＳＡ）を使って分析し、Ｃａｒｂｏｐａｃ ＰＡ １（４２５０ｍｍ， Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏ．， ＵＳＡ）とＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ １（４５０ｍｍ， Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏ．， ＵＳＡ）をコラムとして用いた。移動相は１６ｍＭ ＮａＯＨ溶液を用い、流れ速度は１ｍｌ／分、コラム温度は３０℃にした。グルコース、ガラクトースの濃度は標準物質の補正曲線を利用して定量分析され、グルコース及びガラクトースの収率は式１により原料の乾燥総重量対比生成されたグルコース及びガラクトースの収率で計算した。

Ｃ ＝ グルコースまたはガラクトースの濃度（ｇ／Ｌ）
Ｖ ＝ 糖化に利用された総溶媒量（Ｌ）
Ｓ ＝ 糖化に利用された総基質量（タンパク質、纎維素、ガラクタン、その他）（ｇ）
３．２．タンパク質分析（Ｓｅｍｉ−ｍｉｃｒｏ Ｋｊｅｌｄａｈｌ法）

タンパク質を分析するため、試料０．５ｇを取ってタンパク質分解管に入れたあと、分解管に硫酸２０ｍＬと分解促進剤（Ｋ_２ＳＯ_４： ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２０ ＝ ９：１）５ｇを投入してタンパク質を分解した。分解が完了したあと蒸留水７０ｍＬを加え、蒸留器に３２％のＮａＯＨ ７５ｍＬを入れたあと、タンパク質蒸留装置を利用して蒸留した。蒸留により発生したアンモニアを３％のホウ酸１００ｍＬで捕集したあと、０．１Ｎ ＨＣｌで滴定して式２により総窒素含量を計算した。

Ｖ_０ ＝ 空試料の０．１ Ｎ ＨＣｌ消費量（ｍＬ）
Ｖ_１ ＝ 本試料の０．１ Ｎ ＨＣｌ消費量（ｍＬ）
ｆ ＝ ０．１ Ｎ ＨＣｌのファクター
Ｎ ＝ 窒素係数
ｓ ＝ 試料量（ｍｇ）
０．００１４ ： ０．１ Ｎ ＨＣｌ １ｍＬに相当する窒素量（ｇ）

３．３．灰分分析（乾式灰化法）
るつぼを恒量になるまで５５０℃の灰炉で加熱したあと、デシケータで放冷して秤量した。秤量したるつぼに試料２ｇを入れて５５０℃の灰炉で白色または灰白色の灰が残るまで灰化したあと、灰炉内で２００℃に放冷させ、デシケータに移して室温で放冷した。灰分含量（％）は式３により計算した。

Ｗ_１ ＝ 容器の恒量（ｇ）
Ｗ_０ ＝ 灰化後の容器＋灰分量（ｇ）
Ｓ ＝ 試料重量（ｇ）

３．４．菌体濃度の測定
菌体濃度は分光光度計（Ｇｅｎｅｓｙｓ １０−Ｓ， Ｔｈｅｒｍｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｃｏｒｐ．， ＵＳＡ）を使って６００ｎｍで測定した。菌体乾燥量は時間別に採取した培養液を遠心分離機（ＶＳ−１５０ＦＮ， Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， ＬＴＤ．， Ｋｏｒｅａ）を利用して３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離したあと、蒸留水で洗浄して再度遠心分離した濃縮液を５０℃で２４時間乾燥して測定した。菌体乾燥量（ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ）は、サカロミセス・セレビシエの場合菌体乾燥量 ＝ ０．３１３５吸光度＋０．１８１１（相関係数＝０．９９４）、ブレタノミセス・クステルシィの場合菌体乾燥量 ＝ ０．１２９２吸光度＋０．８５５４（相関系数＝０．９９９）の関系を利用して計算した。

３．５．エタノール分析
培養液中のエタノール濃度はＲＩ検出器が取り付けられたＨＰＬＣ（Ｂｒｅｅｚｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ， Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ．， ＵＳＡ）を使って分析し、コラムはＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（３００７．８ｍｍ， Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いた。移動層は５ｍＭの硫酸水溶液を用い、流れ速度は０．６ｍＬ／分、コラム及びＲＩ検出器の温度は５０℃に設定・分析し、エタノール濃度は標準物質の補正曲線を利用して定量分析した。

実施例１．海藻類の種類に従う纎維素及びガラクタンの成分分析
海藻類（モロッコ産天草、済州産天草、オゴノリ、コットニー、ミル、ワカメ、昆布）０．３ｇと７２％の硫酸水溶液３ｍＬをガラスチューブに入れて３０℃で２時間のあいだ反応させた（１次加水分解）。反応が完了したあと、反応液を２５０ｍＬの瓶に入れて蒸留水８４ｍＬを添加し、高圧反応器（ＶＳ−１５０ＦＮ， Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， ＬＴＤ．， Ｋｏｒｅａ）を利用して１２１℃で１時間のあいだ加水分解した（２次加水分解）。加水分解が完了すると、高圧反応器の内部温度が５０℃であるとき瓶を取り出して室温で放置・冷却し、このうち１ｍＬを取ってＣａＣＯ_３で中和したあと、遠心分離機（ＶＳ−１５０ＦＮ， Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， ＬＴＤ．， Ｋｏｒｅａ）を利用して８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＣａＳＯ_４を除去したあと纎維素及びガラクタン成分を分析した。

その結果、表４に示されているように、海藻類の種類に従い、同じ種でも採取場所に従って成分の含量差を表しており、炭水化物の含量は天草（モロッコ産、済州産）が７０〜８０％で最も高く、ワカメが４１％で最も低かった。さらに、非炭水化物（タンパク質、脂質及びその他）の含量はワカメが５９％で最も高く、天草（モロッコ産、済州産）が２０〜２８％で最も低くて紅藻類の天草がエタノール生産の原料として最も効率的に利用できることを確認した。したがって、以後の実験では炭水化物の含量が相対的に高いモロッコ産天草を選択して糖化／発酵実験を行なった。

実施例２．糖化実験
２．１．酸糖化
１％の硫酸水溶液と基質７５ｇを４Ｌの三角フラスコに入れて１２１℃で１５分間反応させたあと、常温に温度を降下させて糖化液をＣａＣＯ_３で中和し、遠心分離機（ＶＳ−１５０ＦＮ， Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， ＬＴＤ．， Ｋｏｒｅａ）を利用して８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離しＣａＳＯ_４を除去した。高圧反応器にＳ／Ｌ比（５．５〜１５．０％）に従う基質と硫酸水溶液（０．５〜４．０％）を入れたあと、設定された温度範囲（８０〜２００℃）と時間（０〜４時間）のあいだ糖化反応を行なった。さらに、設定された時間にサンプルを採取し、反応完了後には反応器を室温まで降下させたあとサンプルを採取した。採取したサンプルはＣａＣＯ_３で中和し、遠心分離機（ＶＳ−１５０ＦＮ， Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， ＬＴＤ．， Ｋｏｒｅａ）を利用して８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＣａＳＯ_４を除去したあと分析した。その結果は次の通りである。

２．１．１．寒天（Ａｇａｒ）を利用した糖化
分離された乾燥寒天を基質にして反応温度に伴う糖化収率を比較した。基質が寒天なので、生成可能な単糖類はガラクトースと３，６−アンヒドロガラクトース（３，６−ＡＨＧ）であるが（図２を参照）、発酵可能な単糖類だけを対象にするためガラクトースだけを収率で表わした。基質１０ｇと硫酸水溶液４００ｍＬを５００ｍＬ反応器に入れて８０〜１２０℃の範囲で反応を進めており、各反応時間は３０分であり、反応終結後常温に低下させた糖化液を中和してＨＬＰＣ（ＩＣＳ−３０００， Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏ．， ＵＳＡ）で分析した。図３は、各反応温度で反応終了後寒天からのガラクトース収率を表わしたものである。ガラクトース収率は８０℃から１２０℃に反応温度が増加するほど増加したものの１５０℃では減少したが、これは反応温度が増加するほどガラクトース収率も増加するが、適正温度以上では時間の増加に伴い生成糖の分解が発生し、糖化収率を減少させるためであると考えられる。したがって、１５０℃に達する前の温度における糖化収率を確認するため反応途中にサンプルを採取したが、サンプリング時点を温度が１２０、１４０、１５０℃に達する時点にして実験を進めた。

図４は、１２０、１４０、１５０℃に達したときの寒天からのガラクトース収率を表わしたものである。ガラクトース収率は、温度が増加するほど共に増加して１５０℃で３７．１％（生成可能なガラクトースを基準にしたとき７４．２％）で最も高かったが、反応器を常温に低下させた後には３２．８％に減少して冷却される途中に生成糖の分解が進められたことが分かった。

２．１．２．纎維素を利用した糖化
繊維素系バイオマスの場合は一層極限の条件で加水分解が行われ、特に結晶形纎維素の場合は２００〜２４０℃の高い温度で加水分解が行われる。本実施例では、このような点を勘案して反応温度を２００℃に設定し、触媒濃度に伴う生成糖の収率を比較するため０．５〜４．０％範囲の硫酸水溶液を触媒に利用した。基質２０ｇと硫酸水溶液４００ｍＬを反応器に入れて１時間のあいだ糖化反応を進めた。図５は、反応温度（２００℃）に達した時点を基準に触媒濃度に伴う纎維素からのグルコース収率を表わしたグラフである。

図５に示されているように、硫酸水溶液の濃度が高くなるほど収率が減少し、４．０％の硫酸水溶液を利用した場合は０．１％、２．０％では２．６％、１．０％では１２．３％、０．５％の硫酸水溶液を触媒にして糖化したときには１５．８％のグルコース収率をそれぞれ表わした。

２．２．酵素糖化
基質（寒天： １．１ｇ、纎維素： ２．５ｇ）と蒸留水１００ｍＬを２５０ｍＬの三角フラスコに入れて混合し、使用酵素に従ってｐＨを調節したあと、１ｍＬの酵素を添加し１００ｒｐｍで各酵素別の反応条件に従って糖化実験を行なった。反応途中に一定時間の間隔でサンプルを採取し、採取したサンプルは遠心分離機（ＶＳ−１５０ＦＮ， Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， ＬＴＤ．， Ｋｏｒｅａ）を利用して３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離したあと、上澄液だけを取って分析した。

纎維素の糖化は、初期基質濃度を２．５％（２．５ｇ／１００ｍＬ）にして１４４時間のあいだ反応を行なった。その結果、表５に示されているように、纎維素の糖化により生産されたグルコースの濃度は１１．６ｇ／Ｌ（１．１６％）で大凡４６％がグルコースに切り換えられたものと表われ、初期の３時間以内に速やかに糖化されたあと持続的に反応が発生したことが分かった。酸糖化により纎維素の単糖類（ｇｌｕｃｏｓｅ）への切換えが最大１５％内外である点を考慮すれば（図７を参照）、纎維素分解酵素による糖化は非常に効果的なものと判断される。

寒天糖化の際は１％以上の溶液で高い粘性を示すので、初期基質濃度を１．１％にして１４４時間のあいだ糖化反応を進めており、糖化酵素は経済性を考慮して、食品産業などで用いられる常用化された澱粉分解酵素とマルターゼ及びラクターゼ機能の複合酵素を利用した。その結果、表６に示されているように、澱粉分解酵素を含めた澱粉質系糖化酵素は寒天の糖化には大きい効果を示していず、反応初期に検出されたガラクトースは寒天成分の分離時に分解された遊離ガラクトース単量体によるものと考えられる。

２．３．原料直接糖化
２．３．１．温度及び時間による影響
２．３．１．１．Ｓ／Ｌ比 ５．５％
モロッコ産天草２２ｇを基質に利用、１％の硫酸水溶液４００ｍＬを利用して反応温度１２０〜１５０℃で４時間のあいだ糖化反応を進めた。Ｓ／Ｌ比 ５．５％における反応温度、時間に伴うグルコース、ガラクトース及びグルコース＋ガラクトース（単糖類）に対する収率を表わした。その結果、図６に示されているように、グルコース及びガラクトースともに反応温度１４０℃で最も高い収率（グルコース： ４．８％、ガラクトース： ３３．７％、単糖類： ３８．５％）を表わしており、低い温度（１２０℃）では反応時間の経過に伴い収率が増加し、ガラクトースの場合、１５０℃では反応時間１５分以後に収率が急減した。

２．３．１．２．Ｓ／Ｌ比 １０．０％
モロッコ産天草４０ｇを基質に利用、１％の硫酸水溶液４００ｍＬを利用して反応温度１２０〜１５０℃で４時間のあいだ糖化反応を進めた。図７は、Ｓ／Ｌ比 １０．０％で反応温度、時間に伴うグルコース、ガラクトース及びグルコース＋ガラクトース（単糖類） 収率を表わしたグラフである。グルコース及びガラクトースともに反応温度が１５０℃のとき最も高い収率を表わし、このうち最も高い収率を表わした反応時間は１５分であった（グルコース： ４．７％、ガラクトース： ２９．８％、単糖類： ３４．５％）。

２．３．１．３．Ｓ／Ｌ比 １５．０％
図８は、Ｓ／Ｌ比 １５．０％（基質： ６０ｇ、１％の硫酸水溶液： ４００ｍＬ）における反応温度、反応時間に伴うグルコース、ガラクトース及びグルコース＋ガラクトース（単糖類）収率を表わした結果である。Ｓ／Ｌ比 １５．０％でも反応温度１５０℃、反応時間０〜１５分のとき最も高い収率を表わしており（グルコース： ４．０％、ガラクトース： ２２．０％、単糖類： ２６．０％）、１２０〜１４０℃で糖化反応３０分以後に加水分解が殆ど行われていないため、Ｓ／Ｌ比 １０．０％の場合と同一の傾向性を示した。

２．３．２．Ｓ／Ｌ比による影響
図９は、Ｓ／Ｌ比に応じて反応温度１２０℃で４時間のあいだ反応させたときのガラクトースの切換え収率を表わした結果である。Ｓ／Ｌ比と反応温度との間の相関関係を最小化するため、最も低い温度（１２０℃）における糖化実験の結果を比較しており、グルコースの場合に糖化収率が非常に低いので、ガラクトースの切換え収率だけを表わした。図１１に示されているように、グルコース及びガラクトースともにＳ／Ｌ比が５．５％のときに最も高い収率を表わし、Ｓ／Ｌ比 １０．０％と１５．０％では殆ど類似する収率を表わした。

２．３．３．酸濃度による影響
触媒濃度に伴う天草の生成糖の収率を比較するため、基質６０ｇと０．５〜１．２５％の硫酸溶液４００ｍＬを利用して１５０℃で４時間のあいだ糖化反応を行なった。その結果、図１０に示されているように、１．０％の硫酸溶液を触媒に糖化したとき反応時間０〜１５分でグルコース４．０％、ガラクトース２２．３％で最も高い収率を表わしており、糖化１５分以後には生成糖の収率が減少した。０．７５〜１．２５％濃度の硫酸溶液を利用した場合反応時間１時間以後に生成糖の収率が減少したが、０．５％の硫酸溶液を利用した場合は糖化時間に伴う収率の差が殆どなかった。０．７５％と１．２５％の硫酸溶液を利用した場合ほぼ同一の収率を表わし、０．５％の硫酸溶液の場合は最も低い収率を表わした。

２．３．４．酸の種類による影響
酸の種類に伴う生成糖の収率を比較するため、２５０ｍＬの三角フラスコにモロッコ産天草７．５ｇと１％の硫酸、塩酸、窒酸、酢酸水溶液をそれぞれ２００ｍＬ入れて １２１℃で１５分間、高圧反応器で糖化反応を行なった。図１１は、前記触媒を利用したとき、グルコース、ガラクトース及びグルコース＋ガラクトース（単糖類）収率を表わしたものである。酢酸を触媒に利用した場合は糖化が発生しないので酸加水分解のための触媒として酢酸は不適切であり、硫酸を触媒に利用したときガラクトース及びグルコースの収率が共通的に高かった。

２．４．多段階糖化
前述の実験で、原料の直接糖化及び分離糖化実験を通じてガラクトース及びグルコースへの加水分解条件が相違することを確認し、寒天のガラクトースへの加水分解条件は、纎維素からグルコースを分解するための加水分解条件に比べて穏やかであることが分かった。さらに、天草を直接糖化した場合よりは纎維素及び寒天に分離して糖化したとき生成糖の収率が高かった。工程の最少化を介し分離した炭水化物成分等を加水分解する最適条件を探して糖化収率を最適化することになれば、これを利用したエタノールの生産を最大化することができるはずである。

本実施例では、このような点を考慮して２５０ｍＬの三角フラスコにモロッコ産天草７．５ｇと１％の硫酸水溶液２００ｍＬを入れて１２１℃で１５分間、高圧反応器で１次、２次、３次、４次など段階別に糖化反応を行ない、グルコース抽出収率と段階別糖化に伴うグルコース及びガラクトースの収率を確認した。その結果、表７及び図１２に示されているように、グルコース抽出収率は１次まで糖化した場合７８．０％（天草中の纎維素成分が１７％であり、原料量対比計算）であった。さらに、段階別糖化に伴うガラクトースの収率は２次糖化時に２９．６％であったが、この数値は全体原料量対比でない、ガラクトースに糖化可能な成分（２８％、表４を参照）だけを考慮した場合１０５．７％（収率が１００％以上である理由： ３，６−ＡＨＧの一部がガラクトースに切り換えられたものと判断される）なので、天草が含んでいるガラクトース成分は殆ど全て抽出されており、グルコースの切換え収率は１次糖化以後糖化回数を繰り返えしても収率は増加しないので、これ以上加水分解が行われないことが分かった。前記反応条件を利用して２次まで糖化する場合、寒天のガラクトースへの糖化工程及び天草からの纎維素成分の分離が効果的に同時に行なわれ得、その後分離された纎維素成分を酸糖化または酵素糖化を利用してグルコース収率を高めれば、多段階糖化工程は天草の糖化効率を最大化することができる最適化工程に活用可能であることを確認した。

実施例３．エタノール生産培養
３．１．発酵菌株の成長特性の確認
３．１．１．サカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
エタノール生産菌株であるサカロミセス・セレビシエの成長パターン及び糖摂取特性を調べるため炭素源にグルコース及びガラクトースを利用し、このときの濃度は１％、２％及び５％にした。図１３はグルコース１％、２％及び５％におけるサカロミセス・セレビシエの成長曲線及び糖摂取を表わしたものであり、図１４はガラクトース１％、２％及び５％におけるサカロミセス・セレビシエの成長曲線及び糖摂取を表わしたものである。炭素源の濃度が高くなるほど菌体の濃度もまた増加したが、最も高い５％濃度では期待値に比べて低い菌体成長率を示した。炭素源の濃度に拘らず、グルコースの場合は２４時間、ガラクトースの場合は４８時間以内に全部費やされ、グルコースがガラクトースより早い速度で費やされたが、菌体の濃度はガラクトースを炭素源に利用した場合に最も高かった（ガラクトース５％を利用した場合、大凡３．５ｇ／Ｌ）。

３．１．２．ブレタノミセス・クステルシィ（Ｂ．ｃｕｓｔｅｒｓｉｉ）
炭素源の種類及び濃度をサカロミセス・セレビシエと同じ条件にし、さらに他のエタノール生産菌株であるブレタノミセス・クステルシィの成長パターン及び糖摂取程度を調査した。その結果、図１５及び図１６に示されているように、炭素源の濃度が高くなるほど菌体の濃度もまた増加しており、ガラクトースを炭素源に利用した場合最も高い菌体濃度（５％ガラクトースを利用した場合２．１ ｇ／Ｌ）を表わしてサカロミセス・セレビシエと同じ傾向を示した。さらに、ブレタノミセス・クステルシィでも炭素源の濃度に拘らずグルコースがガラクトースより早い速度で費やされたが、グルコースの場合は１２時間、ガラクトースの場合は１８時間以内に全部費やされ、サカロミセス・セレビシエに比べ糖消費の速度が２倍以上高いものと表われた。さらに、菌体成長の速度もサカロミセス・セレビシエより早かった。

３．２．エタノールの発酵
１００ｍＬのＹＥＰＤ培地が含まれた２５０ｍＬ容量の三角フラスコに、固形培地で保存中の菌株（サカロミセス・セレビシエ及びブレタノミセス・クステルシィ）を白金耳で接種して３７℃、３０℃で１５０ｒｐｍで２４時間のあいだ菌株別に前培養した。本培養は、混合糖または糖化液（１〜２０％）とペプトン１５％、酵母抽出物１５％、硫酸マグネシウム０．５％が含まれた培地１５０ｍＬ（発酵槽を利用した場合２．５Ｌ）に前培養液２５％を接種したあと、初期ｐＨ５．０〜５．５、温度３７℃または３０℃で４８時間のあいだ菌株別に培養した。

３．２．１．混合糖を利用した発酵
高圧反応器を利用、１２１℃で１５分間天草を１次糖化したとき、ガラクトースの濃度は０．８〜０．９％、グルコースの濃度は０．０３〜０．０５％である。本実施例では、糖化液と同じ濃度及びガラクトース：グルコースの割合で混合糖を調剤し、サカロミセス・セレビシエ及びブレタノミセス・クステルシィの混合糖におけるエタノール発酵のパターンを調査した。図１７及び図１８は、サカロミセス・セレビシエ及びブレタノミセス・クステルシィをそれぞれ発酵菌株にして混合糖におけるアルコール発酵の結果をそれぞれ表わしたものである。サカロミセス・セレビシエの場合、発酵４８時間の経過後にも糖を全部費やしていず（グルコースは全部費やしたが、ガラクトースは大凡３５％を費やす）、グルコースを全部費やした後にガラクトースを代謝対象に費やすものと表われた。一方、ブレタノミセス・クステルシィはグルコースとガラクトースを同時に代謝対象に用いて発酵２４時間以後には糖を全部費やしており、発酵開始時点でエタノールが生成され（グルコースにより触発されたものと判断される）４８時間後大凡４．１ｇ／Ｌのエタノールを生産した（エタノールの生産収率： ９３．８％）。ブレタノミセス・クステルシィを発酵菌株にした場合、炭素源が枯渇された２４時間以後にもエタノールの濃度が増加するものと表われたが、これは細胞内の成分切換えと見られる。

３．２．２．糖化液を利用した発酵
図１９及び図２０は、高圧反応器を利用して加水分解した糖化液でのサカロミセス・セレビシエ及びブレタノミセス・クステルシィのアルコール発酵の結果をそれぞれ表わしたものである。サカロミセス・セレビシエは発酵４８時間後にもエタノールを生産していず、ブレタノミセス・クステルシィは１２時間以後にエタノールの生成量は４．６ｇ／Ｌ（エタノールの生成収率： ９６．０％）でこれ以上増加しなかった。混合糖を利用したときに比べると、サカロミセス・セレビシエとブレタノミセス・クステルシィの場合全部、糖消費の速度及びエタノールの生成程度が少なかった。

本発明に係る海藻類を利用したバイオ燃料の製造方法は、バイオマスの原料が安定的に需給されることにより原料需給の問題を画期的に改良することができ、従来の木質系原料の利用時に必須に伴われるリグニン除去工程が不要なので工程費用を節減することができ、グルコース以外にガラクトース、３，６−アンヒドロガラクトースなど海藻類に含まれた大部分の糖成分がバイオ燃料に切り換えられ得るため、燃料の生産コストを画期的に節減することができるのでエネルギー資源の問題を解決できるだけでなく、海藻類の場合、ＣＯ_２の吸収能が卓越するので、汎国家的な温室ガスの低減に寄与し、国際環境規制に積極的に対処することができるので経済的及び環境的に非常に有利である。

Claims (21)

1. 海藻類原草または海藻類から抽出した多糖類物質に分解酵素及び／または加水分解触媒を処理して単糖類を生成するステップと、
   前記単糖類を微生物により発酵させるステップとを含む、バイオ燃料の製造方法。
2. 前記バイオ燃料は、Ｃ_１〜Ｃ_４のアルコール及びＣ_２〜Ｃ_４のケトンでなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
3. 前記バイオ燃料は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びアセトンでなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のバイオ燃料の製造方法。
4. 前記多糖類物質は、寒天、澱粉、カラギーナン、アルギン酸及び繊維素でなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
5. 前記海藻類は、大型藻類または微細藻類であることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
6. 前記大型藻類は、紅藻類、褐藻類及び緑藻類でなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のバイオ燃料の製造方法。
7. 前記微細藻類は、クロレラまたはスピルリナであることを特徴とする、請求項５に記載のバイオ燃料の製造方法。
8. 前記紅藻類は、天草、コットニー、フダラク、ノリ、アルバアマノリ、オバクサ、ユイキリ、マフノリ、オゴノリ、ツノマタ、タンバノリ、イバラノリ、イギス、アミクサ、スギノリ、エゴノリ及びムカデノリでなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のバイオ燃料の製造方法。
9. 前記褐藻類は、ワカメ、昆布、マツモ、ナガマツモ、イシゲ、カヤノモリ、ハバノリ、カジメ、ツルアラメ、アラメ、スジメ、ホンダワラ、アカモク、ウミトラノオ及びヒジキでなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のバイオ燃料の製造方法。
10. 前記緑藻類は、アオサ、アオミドロ、アオノリ、ミル、タマミル、フサイワヅタ及びタマジュズモでなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のバイオ燃料の製造方法。
11. 前記多糖類物質の抽出は、
    海藻類をアルカリ水溶液に浸漬させたあと水で洗浄するステップと、
    前記洗浄された海藻類を抽出溶媒に一定時間浸漬させて寒天、カラギーナン及びアルギン酸でなる群から選択される１つ以上を抽出するステップと、
    前記抽出物を分離し、残りの澱粉または纎維素を収集するステップと
    を介し行われることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
12. 前記抽出溶媒は、Ｈ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡ及び常用固体酸でなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のバイオ燃料の製造方法。
13. 前記単糖類は、ガラクトース、ガラクトース誘導体、３，６−アンヒドロガラクトース、グルコース、フコース、ラムノース、キシロース及びマンノースでなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
14. 前記分解酵素は、β−アガラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びセルラーゼでなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
15. 前記加水分解触媒は、Ｈ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡ及び常用固体酸でなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
16. 前記単糖類は、寒天に対し０．０５〜３０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡ及び常用固体酸でなる群から選択される加水分解触媒を利用し、６０〜２００℃の温度で０〜６時間反応させることにより生成されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
17. 前記単糖類は、纎維素に対し０．０５〜５０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡ及び常用固体酸でなる群から選択される加水分解触媒を利用し、８０〜３００℃の温度で生成されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
18. 前記単糖類は、纎維素に対し分解酵素を利用して０超過〜１４４時間反応させることにより生成されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
19. 前記単糖類は、海藻類原草に対し０．０５〜５０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡ及び常用固体酸でなる群から選択される加水分解触媒を利用し、６０〜３００℃の温度で０超過〜６時間反応させることにより生成されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
20. 前記単糖類は、多段階糖化法を利用して海藻類原草に対し０．０５〜５０％濃度のＨ_２ＳＯ_４、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＮＯ_３、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ＨＣＯＯＨ、ＨＣｌＯ_４、Ｈ_３ＰＯ_４、ＰＴＳＡ及び常用固体酸でなる群から選択される加水分解触媒を利用し、６０〜３００℃の温度で０超過〜６時間のあいだ反応させたあと、残りの纎維素或いは澱粉を対象に前記反応条件で２次或いは３次糖化反応させることにより生成されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。
21. 前記発酵微生物は、サッカロミセス・セレビシエ、サルシナ・ベントリクリ、クリュイベロミセス・フラジリス、ザイモモナス・モビリス、クルイベロミセス・マルキシアヌスＩＭＢ３、ブレタノミセス・クステルシィ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・オーランチブチリカム及びクロストリジウム・テタノモーファムでなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のバイオ燃料の製造方法。